1、分子标记 在 玉米 遗传 育种 中的应用及展望 田汝美 巨伟 赵凯 贺杰 李鑫 栗红梅 张友秋 * （山东鑫秋种业科技有限公司， 山东济南， 250100） 摘要 ： 分子标记技术的快速发展 ， 为分子标记辅助选择育种提供了便利，有利于加快育种进程 。 本文概述了各种常用分子标记 RFLP、 RAPD、 AFLP、 SSR、 SNP的原理；以及近年来分子标记技术在中国玉米遗传多样性、杂种优势及杂种产量的预测、目标基因定位、指纹图谱构建和杂交种子纯度鉴定等研究方面的应用；并简单提出了分子标记技术在未来玉米育种研究中的应用前景和发展方向。 关键词 ：玉米 ;遗传育种 ;分子标记 ;应用 Appli
2、cation of Molecular Mark Technology in Genetic Breeding of Maize Tian Rumei Ju Wei Zhao Kai He Jie Li Hongmei Li Xin Zhang Youqiu* （ Shan Dong Xin Qiu Seed technology co.,LTD, Ji Nan,Shan Dong,250100,China） Abstract: Accurately mapping the genes of resistant to stresses of maize by molecular marker
3、technology in order to reduce the times of maize breeding. The paper summaries the principle and feature of molecular markers, such as RFLP, RAPD, SSR and AFLP, their application in analysis of genetic diversity, division of heterosis groups, construction of genetic maps and molecular marker-assiste
4、d selection in breeding of maize and discusses the application prospect of molecular mark technology in maize genetic breeding. Key words: maize; genetic breeding; molecular marker; application 玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一， 在我国玉米的种植面积已经远超于小麦和水稻，成为我国第一大粮食作物 。 玉米 也 是重要的粮食与饲料作物 ， 是现代食品、医药、化学工业的重要原料作物 ， 在 我国北方和西南
5、山区及 其它旱谷地区 玉米是 主要粮食 作物 之一 1。 因此 ， 利用新的技术手段加快玉米育种进程，提高玉米 产量和质量一直是育种工作者努力解决的问题。在玉米育种中由于 _ 项目来源： 转基因生物新品种培育重大专项 。 作者简介：田汝美（ 1985-），女，山东济南人，硕士研究生，主要从事药用植物和玉米育种研究。 Email：。 通讯作者：张友秋（ 1957-），男，山东， 本科 ， 山东鑫秋科技有限公司董事长， 主要从事棉花育种及其相关专业的研究 。 Email： 。 对玉米许多性状的遗传机制还缺乏了解，阻碍了玉米育种工作的进程。所以，如何提高玉米产量、改善玉米品质和增强玉米抗性，实现玉米
6、生产的高产、优质、广适、多抗 成为育种工作者的主要目标。 长期以来，玉米育种工作者大多数是借用易于鉴别的形态学和同工酶等遗传标记来辅助育种，并取得了很大的成功 2。由于标记数量有限、不易找到与目标性状密切相关的标记，所以很难应用于玉米育种实践 3。随着分子生物学的迅速 发展，建立在 DNA变异基础上的分子标记技术在玉米育种中已得到了广泛的应用。现在涉及到的分子标记的类型主要包括 RFLP、 AFLP、 RAPD、 SSR以及正在处于高速发展期的 SNP 等。在玉米的遗传育种方面，分子标记技术主要用于遗传图谱的构建、遗传多样性分析、目标基因的标记及基因定位、杂种纯度及真伪的鉴定、杂种优势及产量的
7、预测、分子标记辅助选择育种等方面。高伟等 4利用 cDNA-SRAP标记对玉米氮素营养诊断表明不同的 SRAP标记引物对扩增效率不同，玉米基因表达受到氮素水平的严格调控。孙世孟等 5利用 RAPD标 记研究得出山东玉米亲本自交系间相似系数高达 0.66-0.97，并将山东玉米优良自交系分为三大类群。郝转芳等 6基于 SNP 标记的关联分析对玉米耐旱基因进行分析，表明 SNP变异与基因功能密切相关，将玉米耐旱基因的研究有重要的影响。 目前，通过 QTL(Quantitative trait locus)遗传定位已经在玉米 10条染色体上发掘出大量控制耐旱性的相关基因位点 7,8，而 且通过图位克
8、隆技术已获得一些模式植物 QTL 的基因序列 9,10。 因此 ， 在保持玉米遗传多样性的基础上 ， 通过分子遗传和分子生物学等手段对 玉米的产量、品质、抗性等进行分子学研究，对玉米常规育种具有重要的 辅助作用。 本 文综述了 现阶段最常用的玉米 分子标记的主要类型及 对 玉米育种 的影响及应用 。 1 常用的几种 玉米 分子标记技术 1.1 限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) RFLP它是在 1974年由 Grodzicker等创立 ， 是一种以 DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记 11。 它是利用放射
9、性同位素、非放射性同位素 （ 如地高辛标记 ） 探针 ， 与转移于支持膜上的经过限制性酶消化的植物 总 DNA杂交 ， 通过显示限制性酶切片段的大小 ， 来检测不同遗传位点变异的一种技术。 RFLP标记克隆可表现基因组 DNA多态性的探针较为困难 ， 实验操作较繁锁 ， 检测周期长 ，成本费用也很高 12，但 RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点 ， 能区分纯合子和杂合子 ， 结果稳定可靠 ， 重复性好 ， 特别适用于构建遗传连锁图。 1.2 随机扩增多态性 (Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD) RAPD是 1990年由美国杜邦公司的 Will
10、iams13和加利福尼亚生物研究所的Welsh等 14发明的分子标记技术。它是以 PCR为基础 ， 利用人工合成的随机序列寡核苷酸作引物 ， 以生物的基因组 DNA作为模板进行 PCR扩增反应 ， 产生不连续的 DNA产物 ， 通过琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA序列的多态性 。 已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用 15。 由于 RAPD技术不依赖于种属特异性和基因组结构 ， 一套引物可用于不同生物基因组分析 ，所以在对某种作物的初始研究中应用较广 。因此， RAPD 被广泛用于种质资源的鉴定和分类、基因的快速定位和遗传作图等 16。 1.3 扩增片段长度多态性 (Am
11、plified Fragment Length Polymorphism, AFLP) AFLP 又称选择性限制片段扩增标记 ， 是一种基于 PCR 反应的选择性扩增限制性片段的方法 ， 由荷兰科学家 Zabeau和 Vos于 1992年创建的一种利用 PCR技术检测 DNA 多态性的方法， 其基本原理是选择性地扩增基因组 DNA 的酶切片段 17。 AFLP 技术结合了 RFLP 和 PCR 的优点 ， 具有多态性丰富、稳定性好和重复性高的特点， 由于不同物种基因组 DNA 的大小不同 ， 基因组 DNA 经限制性内切酶酶切后产生的限制性片段的分子量大小不同 ， 使用特定的双链 接头与酶切
12、DNA片段连接作为扩增反应的模板 ， 用含有选择性碱基的引物对模板 DNA进行扩增 ， 扩增产物经放射性同位素标记、电泳分离 ， 然后根据凝胶上 DNA指纹的有无来检出多态性。 AFLP 技术作为目前国际上构建 DNA 指纹图谱的最新方法之一 ， 已在植物遗传研究领域得到了广泛应用 ， 如构建遗传图谱、结合混合分离分析法标定目的基因、检测遗传多样性、辅助育种等 18。 1.4 简单序列重复 (Simple Sequence Repeat, SSR) SSR又称微卫星 DNA是 Moore等于 1991年结合 PCR技术创立的。 SSR标记的 基本原理是 ： 根据微卫星重复序列两端的特定短序列设
13、计引物 ， 通过 PCR反应扩增微卫星片段， 由于核心序列重复数目不同 ， 因而扩增出不同长度的 PCR产物 19。 SSR 在群体中通常具有很高的多态性，标记序列简单，重复性好，而且它是共显性分子标记，符合孟德尔方式的分离和遗传规律，不易被自然选择和人工选择所淘汰。 因此，作为一种经典的分子标记技术， SSR 在玉米的基因定位、分子辅助育种、真假杂交种和种子纯度的鉴定以及物种系统发生、亲缘关系和起源等研究方面也得到了广泛的应用 20。 1.5 单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphism, SNP) SNP标记是指核苷酸水平的变异引起的 DNA序列多态性，包
14、括碱基转换、颠换、插入或缺失等。 与其他的分子标记相比， SNP 功能标记由于是从目的基因的功能位点开发 ， 因而可靠性强 ， 前期不需要构建作图群体 ， 不存在遗传重组带来标记与性状之间的无关联而产生的风险 ， 而且能够最好地代表遗传变异 ， 它可以准确地跟随等位基因。 因此 ， SNP 技术特别适合于研究 作物育种中 多位点控制的数量性状及其等位基因遗传结构 21。 SNP作为一种新型的分子遗传标记，越来越受到世人的关注。目前， SNP 标记主要用于人类基因组研究，在植物基因组研究中的应用还很少。随着拟南芥、水稻等重要植物全基因组测序工作的相继完成， SNP标记必将在植物遗传与育种研究领域
15、中发挥巨大的作用 22。 2 分子标记在玉米 遗传 育种中的应用 2.1 分子标记在玉米杂种优势群划分中的应用 合理准确的划分玉米杂种优势群，建立相应的杂种优势模式，才能有效的改良玉米自交系和选配优质高产的玉米杂交组合，提高育种效率 23。在我国， 传统的方法是根据自交系系谱信息 ， 特殊配合力 ，形态差异，同工酶标记的等方法相继被用于玉米杂种优势群 划分 ， 这些方法各有 自己的优点，但同时也造成玉米杂种优势群划分上的偏差，甚至一些材料根本无法划分。 利用分子标记技术来划分杂种优势群的结果更加可靠 ， 同时也大大促进了杂种优势群划分的效率。 划分杂种优势群可用的分子标记方法主要有 RFLP、
16、 SSR、 AFLP、 RAPD、SNP 等 ， 研究者通过比较不同分子标记方法 ， 致力于筛选最有效的杂种优势群划分方法。袁力行等 23通过研究 15个玉米自交系遗传多样性 ， 对 RFLP、 SSR、AFLP 和 RAPD 标记进行比较 ， 认为 RFLP 与 SSR 更适合玉米遗传多样性的研究。 因 玉米基因组中重复序列所占比例约为 80%， 并存在大量的简单重复序列，鉴于此 ， 李新海等 24应用 SSR 标记方法将 70 份我国主要玉米自交系划分为 6个类群 。 郑淑云等利用 SSR标记将 64份玉米自交系材料划分为 8大类群 。 任纬等 25通过 SSR 标记技术与表型性状相结合的
17、方法将 21 个玉米自交系划分为 5个类群 ， 3 个试验结果与系谱分析结果基本一致。 吴敏生等 26,27研究了 17 个玉米自交系的 AFLP分子标记与相应 136个单交种的产量、产量杂种优势的关系。陈秀玲，李向拓等 28,29首次利用 RAPD标记将我国目前推广玉米杂交种的 15个主要自交系进行了杂优类 群的划分 ， 划分为 6个类群，为玉米育种、优势类群构建及杂种优势模式的建立提供了分子水平上的理论依据。 分子标记技术的日趋成熟为玉米自交系亲缘关系及杂种优势群的选择研究提供了新的手段和方法，对玉米自交系的亲缘关系进行研究进而划分类群，是构建玉米杂种优势群的重要依据，是提高选育效率的基础
18、性研究，这在玉米育种中尤为重要。 2.2 分子标记在玉米遗传多样 性 中的应用 遗传多样性是用以衡量一个种、亚种或种群内基因变异性的概念，是生物多样性的基础。它包括物种内多样性、物种间多样性、生态系统多样性三个方面 30。在一个自然群体 内，没有两个个体具有完全一致的遗传背景，高度的遗传多样性是维持物种长期生存的基础 31。 深入认识种质的遗传多样性，是合理开发 、 发掘 和利用各种种质资源的前提。利用分子标记进行遗传多样性评价比以往通过形态学观察和同工酶标记等手段具有更多的优势，为玉米杂种优势群的划分提供 依据，为亲本的选育提供更便利的途径。 利用不同的分子标记技术对玉米的地方种质及外来种质
19、的遗传多样性已有较多的研究，并以取得了较大的进展。通过玉米自交系的遗传多样性分析获得的信息来评价和选择亲本，可以有效的提高玉米自交系优良性状的改良。 Marilyn等 32利用从 85对 SSR引物中选出的 53对多态性丰富的引物，对 CIMMYT的 7个群体和 57个自交系的遗传多样性进行了研究，利用 SSR分子标记，将不同来源的自交系划入 CIM-MYT已有的杂种优势群。 程春明等 33利用 ISSR分子标记技术对 59份玉米自交系和 1份大刍草材料进行遗传多样性分析将这些材料分成两大组，共 9个亚组，并且在一定程度上与血缘和系谱是一致的，也存在一些例外。 田 松杰等 34利用 AFLP分
20、子标记技术对 50个有代表性的玉米及其野生近缘种大刍草等进行遗传分析，发现 50个材料可以分为 3大类， 与已有的玉米族分类一致，但与玉蜀黍属内的种间和种内 分类存在差异，认为大刍草内存在较大的遗传多样性。 2.3 分子标记在玉米品种纯度鉴定中的应用 玉米杂交种子纯度鉴定是玉米种子质量控制体系中的关键环节。目前室内鉴定玉米杂交种纯度的方法主要有种子贮藏蛋白质和同工酶电泳技术 35， 但种子贮藏蛋白质和同工酶均为基因表达种类 ， 同时其遗传方式并非全部表现为共显性遗传 ， 一些玉米杂交种难以用这些方法将杂交种和亲本区分开。分子标记技术的迅速发展 ， 并 分子标记具有多态性水平高、能够鉴别表型相近
21、品种、受环境因素的影响小、检测结果准 确等优点 ， 在品种纯度鉴定方面为广大科研工作者广泛采用 36。李素玲等 37利用筛选出的特异性 SSR引物成功地对盐溶蛋白电泳技术难以进行鉴定的强盛 1 号玉米杂交种及相应亲本自交系进行了鉴定。 李晓辉等 38应用 SSR标记技术结合单籽粒 DNA快速提取方法，准确地鉴定玉米杂交种种子纯度。 赵久然等 39筛选确定了适合中国主要玉米杂交种及其双亲的 RAPD 特意引物，认为应用 RAPD 技术 可以简便、快捷、经济、准确的鉴别玉米杂交种子纯度及真伪。 杨双 40应用 SSR 分子标记技术，在 DNA 水平上鉴定 2 份待检样品与沈玉 21标准样品是否为同
22、一品种。结果表明：待检样品 1与标准样品为相同品种或极近似品种；待检样品 2与标准样品为不同品种。建立了沈玉 21的 DNA指纹图谱，为鉴定种子的真伪性提供了有效有段，在品种保护工作中发挥重要作用。 2.4 分子标记在玉米基因定位上的应用 目前，利用分子标记技术，在玉米上已定位了许多重要农艺性状基因。质量性状方面主要有与育性有关的基因标记和与抗性有关的基因标记。 通过分子标记与目标性状的重组值来估计标记与性状的连锁关系及其遗传距离 ， 应用多个标记与性状的连锁分析 ， 就可以把控制某性状的基因准确定位在某 2个确 定的标记间的精确座位上 41。从而， 对于其他表现为数量性状遗传特点的农艺性状
23、， 如玉米的产量性状、成熟期、品质、抗旱性 等 ， 完整的高密度分子标记图谱给数量性状位点 (QTL)提供了有用的工具。 育种家根据表现型和基因型之间的明确关系，就能检测出理想的等位基因。人们对玉米的多种抗病基因、株高基因、产量及构成因子基因都已作了较为详尽的研究 42,43。 利用分子标记技术构建饱和的玉米分子遗传图谱，探索基因型与表现型之间的关系，进行更多重要农艺性状基因的精细定位，探索分子标记与常规育种的有效结合途径，这些已经成国内外 玉米专家研究的热点，也必将成为未来辅助玉米常规育种，改善玉米农艺性状及质量性状的强大武器。李玉杰 44首次利用分子标记辅助选择技术改良我国玉米骨干自交系的
24、粗缩病抗病性，以抗病自交系 90110为供体亲本，以感病玉米自交系掖 478杂交 昌 7-2等为轮回亲本进行粗缩病抗性改良，并取得了一定的效果。李新海等 45采用 SSR 标记对黄早四 杂交 掖107组合的 F3群体进行了玉米雌雄开花间隔天数 QTL分析， 在灌溉和干旱条件下 ， 分别检测到了 3个和 2个控制雌雄开花间隔天数 (ASI)的 QTL。刘鹏飞等 46对玉米叶夹角和叶向 值的 QTL分析，发现 1个同时控制叶夹角和叶向值性状的QTL，位于第 2 染色体上的 bnlg1017-umc2129 区间， 对两性状的表型贡献率分别为 10.8%和 10.6%，为玉米耐密型育种及分子辅助选择
25、育种提供一定的理论依据。 覃鸿妮等 47对玉米籽粒中花色苷和黑色素含量的 QTL 分析显示， 2 个群体中检测到的上位性 QTL 的数量、位置和对表型的贡献率差别均较大， WD 群体的上位性效应明显大于 YD群体，说明上位性效应对遗传背景更加敏感，需要进一步深入研究贡献率大的上位性 QTL及其利用。 3 分子标记的利用前景与展望 分子标 记作为一种新的遗传标记技术发展不过几十年 ， 却具有很强的生命力 ， 十分活跃 ， 呈现出广阔的应用前景和巨大的应用潜力。它从更深层次上揭示了基因与性状之间的关系 ， 使育种选择从操纵表型真正进入到操纵基因的阶段 ，能从更广泛的空间认识基因的作用 ， 找到充分
26、利用遗传资源的途径 ， 为玉米遗传育种研究开辟了新的途径 。 分子标记辅助育种 为玉米种质资源和品种的鉴定、分类、遗传图谱构建及目标性状基因标记等提供了理想的方法。在玉米种质资源利用方面 ， 分子标记技术可以通过探查、挖掘、收集玉米的重要农艺基因 ， 进行分类整理 ， 为玉米育种提供原始材料或 谱克隆重要基因。 育种家可以 根据玉米育种目标 ， 设计出能最大限度地综合利用有利基因和避免不利基因的最佳杂交组合 ， 这将有利于促进玉米品种的改良。分子标记的应用 ， 尤其是在分子辅助早期选择方面的应用前景更为广阔 ， 有目的地将所需基因导入 ， 然后根据分子遗传图谱和重要基因的分子标记 ，对杂交后代
27、群体进行早期选择 ， 筛选出含有目的基因的植株 ， 这将大大提高选择准确性和育种效率 ， 缩短育种年限 ，加快玉米育种进程。分子标记辅助选择与基因组辅助育种有密切关系，它将逐步进入基因组辅助育种时代，实现基因设计育种和选择 48。 随着分子生物学 理论与技术的迅猛发展 ，学者们 必将研发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记技术 ， 同时 ， 在今后的研究中应当加大与育种实践结合的力度 ，使分子生物学更深入到常规的田间育种实践中， 相信随着分子标记技术的深入发展 ， 分子标记技术 必将成为玉米育种的重要途径之一，帮助育种家培育出更为抗病、高产、品质好的新品种 ，提高农民的种植效益 。
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