1、TORCH感染检测方法与结果分析,1971 年Nahmias 等首先描述了病原体感染对胎儿的致畸作用，他将数种能引起孕期宫内感染，甚至造成先天缺陷或发育异常的病原体英文名词的第一个字母组合而成“TORCH”，即弓形虫 ( TOX) 、风疹病毒(RV) 、巨细胞病毒(CMV) 、单纯疱疹病毒(HSV)、其他(OTH)。其他病原体感染包括细小病毒（B19）、沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（UU）等。近几年人乳头瘤病毒（HPV）、淋球菌（GC）感染率明显上升，也引起学者重视。,孕期TORCH感染通常无症状，但对胎儿可造成危害，可导致自然流产、胎儿畸形、死胎、胎儿生长受限（FGR）、早产及新生儿疾病等
2、严重并发症。虽然TORCH感染对胎儿、新生儿能够产生不利影响，但经积极治疗后再次受孕仍可分娩正常婴儿。因此在孕前监测TORCH 感染，争取在孕前进行干预，选择适宜的妊娠时机受孕，可减少不良妊娠结局的发生，对减少先天性感染儿及病残儿的出生极为重要。,TORCH感染临床检测最常用的方法包括两种： TORCH抗体的检测 TORCH病原体的检测,一、TORCH抗体检测方法与结果分析 1、检测方法 用于测定液体标本中的微量物质，最常用的是免疫标记技术，是指用荧光素、酶、放射性同位素、发光剂或电子致密物质标记抗体或抗原后进行的抗原抗体的反应。这类检测技术的优点是特异、灵敏、快速、能够定性和定量、易于观察结
3、果等。我们实验室检测TORCH抗体采用的方法是酶免疫测定中的酶联免疫吸附试验（ELISA），它是用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行的抗原抗体反应。,（1）标本采集和处理 病人无需空腹，通过无菌性静脉穿刺采集自凝血样本2ml，离心后留取血清，最好是新鲜血清用于测定，如不能立即测定可保存于-20，不能反复冻融。溶血、高脂血症、黄疸可能影响检测结果。,（2）检测原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是根据酶免疫测定原理发展的一种固相免疫酶技术，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。ELISA的基本原理是：抗原和抗体能与固相载体表面结合并保持其免疫活性；抗原和抗体与酶结合成的标记物，既能保持抗原或抗体的免疫活
4、性，又能保持酶的活性；受检物中的抗原或抗体与固相表面的抗体或抗原发生免疫反应并结合在固相表面，此抗原抗体复合物又能结合相应的酶标记物 ,用洗涤方法除去未结合而游离的酶标记物，继而加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，显色的程度与受检物中的抗原或抗体的量直接相关，用合适的分光光度计或酶标仪进行比色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，一般1分子酶在1min内可催化数十万乃至上千万分子底物变为产物，故可极大地放大反应结果，从而使测定方法具有很高的敏感度。,我们实验室检测抗体的具体步骤是:先将已知的可溶性抗原吸附于某一种固相载体表面，并保持其免疫活性。加入待检血清，患者
5、血清与固相载体表面的抗原接触起反应，如血清中有相应特异性抗体存在，则抗体会与抗原结合在固相载体上，形成抗原抗体复合物，洗涤去除过多的抗体。然后加入用辣根过氧化物酶标记的抗体复合物，后者将会与抗原抗体复合物结合。,通过洗涤，洗去未反应的酶标记抗体，这样结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物四甲基联苯胺（TMB）后，底物经酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，用酶标仪进行比色，根据颜色反应的深浅进行定性分析。,2、结果分析 抗体中的IgM和IgG以高浓度遍布全身，是全身性体液免疫反应的主要效应分子。IgM是初次体液免疫应答早期阶段产生的主要免疫
6、球蛋白，主要分布于血液中，抗全身感染的作用较强。IgG是再次体液免疫应答产生的主要免疫球蛋白，在血浆和组织液中各占50%左右，故几乎分布于全身各组织及体液中。IgG是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白，故对新生儿抗感染起重要作用。,TORCH感染后，一般首先出现的是IgM，然后才产生IgG，感染后56天IgMIgG，2030天IgM达到高峰。感染后48周IgG达到高峰，并维持多年至终生。,抗体实验结果解释参考表：,IgM IgG 结 果 解 释, 从未感染过。易感人群, 两周后复查，结果相同， 考虑为近期感染, 远期感染过，近期无感染, 原发性感染或再感染,孕妇血清中IgM 阳性是诊断活动性感染重要而
7、可靠的指标，但由于它实际检测的是人体对TORCH感染的免疫反应状态，因此对那些处于潜伏状态不排毒的孕妇，或免疫系统发育不完善的孕妇，易出现漏检。 随着分子生物学技术的发展，根据检测病原体DNA 或RNA 的水平对感染进行诊断就更为直接，并越来越受到围产医学界的关注。 TORCH抗体的检测一般用于孕前和孕早期病原体感染的筛查，IgM阳性妇女需进一步作病原体DNA或RNA检测以明确感染的存在。,二、TORCH病原体的检测方法与结果分析 1、检测方法 检测TORCH病原体，临床常用方法是聚合酶链反应（PCR），又称体外酶促基因扩增法。 （1）标本采集 TOX采集EDTA防凝血2ml，利用低渗法提取白
8、细胞；RV、CMV采取自凝血，离心提取血清；HSV、CT、UU、NG、HPV等采取宫颈分泌物。,（2）技术原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR由高温变性低温退火中温延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：通过加热使模板DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链，以便它与引物结合； 模板DNA与引物的退火（复性）：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。,当温度突然降低时由于模板DNA的分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA的量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部
9、形成杂交链，而模板DNA之间互补的机会较少。 引物的延伸：在DNA聚合酶和四种脱氧核糖三磷酸底物及Mg2存在的条件下，模板-引物结合物，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。以上三步为一循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板。这样反复循环以上反应过程就能将待测目的基因数量呈指数倍数扩增放大几百万倍。,PCR产物可用凝胶电泳分析法分析结果。常用的是琼脂糖凝胶电泳，在配制琼脂糖时加入0.5g/ml的溴化乙锭（EB），或在电泳后凝胶用电泳缓冲液配制的同样浓度的EB液染色15-30min，紫外灯下观察结果并拍照记录。,我们实验室采用的是实时荧光定量PCR方法，常规PCR存在着不能定量和产
10、物污染假阳性等问题，使其临床应用受到限制。实时荧光定量PCR就是利用荧光信号检测整个PCR扩增过程，获得在线描述PCR过程动力学曲线。其原理是在常规PCR扩增体系中，加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针。探针的5端标记荧光报告基团，3端标记荧光淬灭基团。当探针完整时，由于淬灭基团的淬灭作用，荧光报告基团不能产生荧光发射。,当有靶基因存在时，在PCR的复性延伸期，标记探针即与靶基因互补结合，新合成链从引物开始，沿膜板延伸，当新链延伸至标记探针结合部时，DNA聚合酶具有53的外切酶活性，将探针5端荧光报告基团切下。从而，荧光报告基团淬灭作用被解除，产生荧光发射。通过荧光光谱分析仪连续不断地
11、检测反应体系中的荧光信号的变化。,其定量原理是：首先根据PCR扩增过程中，产物信号（荧光）尚未出现前本底荧光信号平均值加3个标准差确定为荧光阈值。在PCR反应中设置原始已知定量膜板管进行扩增，这样不同定量膜板管经过不同循环次数达到荧光阈值，此时的循环次数(Ct值：也称循环阈值) 就被记录下来。该循环参数和PCR 体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，根据循环参数Ct 值就可以准确计算出起始DNA的数量。即能得出待测样品原始膜板的数量，从而实现样品膜板的定量。,荧光定量基因扩增技术的优点是特异性强，克服了假阳性的主要来源，可准确定量出低至1个拷贝/微升的病原体，真实地反映了病人体内病毒存在与复制的情况，可减少血清学所致的假阴性诊断。,2、结果分析 病原体DNA或RNA的存在是病原体体内复制的直接标志，可用于确定病原体感染。 阳性定量范围为103 109 copies/ml，103 copies/ml为阴性。,谢谢,
