1、DNA 简单重复序列基因分型的新方案摘要：随着大规模测序技术的不断发展，测序成本降低，各种生物的基因组序列已逐步完善，重测序工作成为基因多态性研究中非常重要的方法。它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性，广泛应用于多种疾病的检测和鉴定等。但是，当重测序过程中遇到简单重复序列时，往往会出现峰谱图的滑移现象，使测序结果不准确。本研究利用荧光标记引物定向扩增包含重复序列的片段，结合 ABI 377 DNA 自动测序仪进行检测重复单位，结果表明，该方法可以准确无误的检测出重复序列的重复次数，是对重测序工作中的重复序列分型技术的一项重要补充。 关键词：重复序列；重测序；荧光标记引物；ABI 377 D
2、NA 自动测序仪 中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-04-0061-3 基金项目：国家自然科学基金（30771191） 0 引言 全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。当前， “重测序”在动植物育种研究广泛应用。据了解，研究人员运用新一代测序技术对 17株野生大豆和 14 株栽培大豆进行了全基因组重测序，完成世界上首次对野生大豆和栽培大豆全基因组进行大规模遗传多态性的分析。另外，科学家通过 40 个家蚕突变品系和中国野桑蚕的全基因组序列，绘制完成了世界上第一张基因组水平上的蚕类单碱基
3、遗传变异图谱。近年来，包括人、牛、鼠等哺乳动物， 家蚕、蜜蜂等昆虫， 拟南芥、水稻等植物， 以及流感嗜血杆菌等微生物越来越多生物物种的基因组序列被测定，针对生物多样性的研究也越来越普遍，重测序工作将得到更广泛的应用。 重测序技术是将新序列与已知的对照样本中得到的一个或者多个 DNA序列比较的方法，用来鉴定 DNA 序列中的突变/变异，从而检测到与重要科学问题相关的突变/变异，在临床诊疗，疾病检测等方面都具有重要作用。但是，在重测序的过程中也存在很多问题，由于 Sanger（桑格）双脱氧链终止法测序的原理是聚合酶链式反应，即 PCR 反应，双脱氧核糖核酸可能随机的被加入到正在合成中的 DNA 片
4、段里。由于双脱氧核糖核酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到 DNA 链上，这个 DNA 链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的 DNA 片段。当序列中出现重复序列时，对于采用双脱氧测序法来说，由于重复序列的重复次数繁多，易造成结果峰谱图滑移等问题，造成数据的不准确。目前研究表明，不论是在低等原核生物还是高等真核生物的基因组中， 都存在着一定比例（1%77%）的重复序列，因此， 测定重复序列， 尤其是高度重复序列是目前重测序中的一个疑难问题。 荧光标记引物，是对引物进行荧光标记，从而使荧光标记基团直接掺入 PCR 扩增产物。利用荧光引物进行扩增的 PCR 产物，经过聚丙烯
5、酰胺凝胶电泳获得相应图谱，再通过 genemap3.0 软件分析，得到准确的PCR 产物长度大小。本文通过利用荧光引物特异性扩增含重复序列的目的片段，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结合测序技术验证，探索了一种简单、快速鉴定个体间重复序列差异的方法，不失为一种准确性高，重复性好的重测序实验方法。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 样本 11 个不同地区中国野生小家鼠 DNA 样本（嘉定 3，崇明41，崇明 31，崇明 25，松江 5，金山 7，金山 11，金山 13，南汇，浦东5，浦东 3）以及 1 个实验室小家鼠品系 C57BL/6J（九亭实验动物中心购买）样本 DNA。 1.1.2 引物合
6、成 用于扩增特异区段的 PCR 引物序列如表 1 所示。荧光引物 YG 所带荧光为蓝色，扩增片段内含 4 碱基的重复序列，荧光引物lan 所带荧光为蓝色，扩增含单碱基重复序列的野生小鼠样本，荧光引物lv 所带荧光为绿色，扩增含单碱基重复序列的实验室对照小鼠样本。由上海生工有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 DNA 抽提 采用酚氯仿法抽提小鼠 DNA，依照酚氯仿抽提实验说明书。 1.2.2 PCR 扩增反应 PCR 反应体系（10ul）包括：ddH2O 5.3ul，10PCR buffer（含 15mM Mg2+）1ul，25mMMg2+ 0.6ul（3mM） ，dNTPmix（各 2mM
7、）1ul，primer 1ul（浓度 0.02mM） ，HotStarTaq DNA Polymerase（5 units/ul） ，0.1ul，Template DNA 1ul（35ng/ul） 。试剂由上海生工有限公司提供。PCR 反应程序：95 15min； 94 30s； 60 45s ；72 1min；重复- 共 35 个循环； 72 10min 25 forever。 1.2.3 测序分析 将所得 PCR 产物进行 ABI3730 测序 博尚测序公司，同时将对照物与样品加入上样缓冲液后，在 ABI 377 型测序仪上用同一聚丙烯酰胺变性胶进行电泳，得到峰谱图。 1.2.4 数据分析
8、 应用 lasergene7.1 DNA Star 公司软件包中的seqman 软件分析测序图谱，genemap3.0 ABI 公司 软件分析聚丙烯酰胺凝胶电泳图。 2 结果 在以上扩增片段中，包含 2 种重复序列对照组，其多态性见表 2，对应于 4 碱基重复序列引物 YG 扩增片段如图 1，3，单碱基重复序列引物lan（lv 为对照）扩增片段如图 2，4。 3 讨论 在传统测序方法中，目的序列通常会出现峰图滑移等情况，使得测序结果不能正常列出，导致难以分析。一般来说，所出现的峰图滑移现象均由序列中的重复序列造成的。重复序列分为单碱基重复序列和多碱基重复序列，其广泛分布于基因序列中，对于目的序
9、列的测定造成了极大的不便及干扰。 本研究针对两条含不同重复序列的待测序列，利用不同样本间重复次数不同的对照，采用荧光引物扩增待测目的片段，再将所得目的片段进行测序电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，ABI 377 测序分型，进行对比。得到两种对比型结果：测序结果显示，当序列中出现重复序列的时候，峰谱图出现滑移现象，不能准确获得重复序列及重复次数；ABI 377 测序分型结果显示，由于可直接读出所测目的片段的大小，通过对照组对比，即可准确得知不同样本内重复序列的重复次数。 另外，本研究还列出了两种不同的重复序列，单碱基重复序列和 4 碱基重复序列。对于单碱基重复序列，为避免由重复单位差异较小而造成的分析不
10、便，将参照样本以另一颜色荧光标记标出，同时加于上样孔中，以此分辨不同样本间存在的单碱基重复差异，该方法进一步提高了重复序列鉴定的准确性。 目前，普遍使用的鉴定重复序列的方法是双向测序结合标准序列进行判读，如果重复次数仅仅 13 次，那么双向测序结合正常序列判读，可以获得有用的信息。但是，当一个等位基因内存在两种重复次数改变时，仅通过 PCR 产物测序，往往无法判定可能存在的其他重复次数，从而不能获得两条等位基因的完整信息。而经典的克隆测序，特别是目前经常使用的 TA 克隆测序，虽然效果好，但是整个过程繁琐，技术及环境要求较高。虽然本方法所测目的片段不能完整的显示序列信息，但是，本方法所使用的仪
11、器简单，结果明确，重复性好，可以获得确切的重复次数，而避免了克隆的复杂后续过程；而且该方法在整个过程中仅使用一对引物，是适用于一般实验室的可以广泛使用的一种大规模检测方法。本方法为以后的实际重复序列鉴定提供了模式参考，并为中国野生小家鼠的重复序列检测提供了数据。 参考文献 1 International Human Genome Sequencing Consortium.Initial sequencing and analysis of the human genomeJ.Nature，2001，409（ 6822）：860-921. 2 The Bovine Genome Sequenc
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