1、 1 出芽短梗霉的诱变选育及丙二酸抗性筛选聚苹果酸高产菌 摘要：目的 ：以出芽短梗霉（ A.pullulans） AH2 为出发菌株，经紫外诱变和丙二酸抗性筛选获得聚苹果酸高产菌株。 方法 ：以 AH2 为起始菌种，经制霉菌素预处理，改变了出芽短梗霉细胞膜的通透性，再经紫外线诱变后进行丙二酸抗性筛选，然后经溴钾酚绿初筛，根据筛选培养基上的菌落形态特征以及 HC 值的大小，选出用于发酵的菌株，最后对发酵产生的聚苹果酸进行定量测定，筛选获得 PMA 高产菌株。 结果 ：最终获得一株出芽短梗霉高产菌株丙5-5-4，其摇瓶发酵产量达到了 20.80g/L，比出发菌株提高了 6%,且高产特性稳定。 结论
2、 ：对丙二酸耐受的出芽短梗霉菌株可以高产聚苹果酸，此种选育方法克服了随机筛选的盲目性，提高了菌种筛选的效率。 关键词： 聚苹果酸； PMA 高产菌株；溴钾酚绿初筛；紫外诱变；丙二酸抗性筛选；出芽短梗霉 Screening of high poly malic acid mutant of Aureobasidium pullulans against malonic acid of Succinodehydrogenase Inhibitor Abstract ： Objective Starting from the AH2, by mutagenesis and screening to
3、obtain poly malic acid production by Aureobasidium pullulans strains. Methods Taking AH2 as the starting strain, through nystatin pretreatment, changed by Aureobasidium cell membrane permeability, after UV mutagenesis of malonic acid resistance screening, and then by potassium and bromine phenol fir
4、st green screen, according to the selection of culture based on the morphological characteristics of the colony and the HC value, select strains for fermentation. At the end of fermentation to produce poly malic acid was quantitatively determined and screened to obtain high-yield strains of PMA.Resu
5、lts Finally, a poly malic acid high yield strain 5-5-4 was obtained, its shake flask fermentation production reached 20.80g/L and the yield was increased by 6% compared with the starting strain AH2, and the yield was stable.Conclusion Aureobasidium pullulans of malonic acid tolerance can produce hig
6、her yield of poly malic acid by fermentation.This method overcame the blindness of random screening, and improve the efficiency of screening. 2 Key words： Poly malic acid; PMA strain; potassium bromide phenol green screening; UV mutagenesis; screening of malonic acid resistance; Aureobasidium pullul
7、ans 第 1 章 前言 1.1 出芽短梗霉 出芽短梗霉（ Aureobacidium pullulans）又称为“出芽苗霉”、“黑酵母”及“短梗霉”等，是一种半知菌类短梗霉，是类酵母真菌，它归属于半知菌门、丛梗孢目、短梗霉菌属具有酵母样和真菌菌丝体两种形态，这两种菌体形态受培养基成分、培养条件等因素的影响，是可以相互转变的。它在遗传上具有不稳定性，可以形成很多种变种，菌落最初有粘獨状，呈脏白色，很快转变为黄色，之后变为深绿色，最后为黑色，菌落边缘呈现辖射状，菌落的质地开始较为粘稠，最后变得坚硬 1。出芽短梗霉能产 生很多种代谢产物，比如胞外多聚糖、酶类、抗菌素、聚苹果酸等。 1.2 聚苹果酸
8、的性质、结构、作用 聚苹果酸 ( Poly-malic acid， PMA) 是一种可完全生物降解且拥有高度生物相容性的水溶性高分子聚酯， PMA 具有良好的水溶性、易代谢性、可化学衍生性和生物安全性等特点而受到研究者的重视。 3 聚苹果酸有 、等 3 种结构，其中 -PMA 在自然界广泛存在，用途也最为广泛，微生物发酵所得均为型 2。苹果酸和聚苹果酸的结构如图 1 所示3。 图 1 苹果酸与 3 种聚苹果酸的结构 Fig.1 Structure of malic acid and poly (malic acid)s 聚苹果酸可降解生成苹果酸单体 ,其中 L-苹果酸是生物体内三羧酸循环 (T
9、CA)的中间体 ,可参与代谢活动而被生物体吸收。此外 ,对聚苹果酸的侧链 -COOH 进行修饰或改性 ,引入功能基团或药物分子 ,从而提高药效和降低毒性。聚苹果酸的诸多优点 ,使其在药物载体和生物材料等领域获得重要的应用 ,在诸如手术缝合线、药物控制释放体系、组织工程支架材料及食品包装材料等方面有着广阔的应用前景 4。 1.3 聚苹果酸的合成现状 聚苹果酸的生产方法主要分为微生物发酵法与化学合成法，化学合成法多以 -烷氧羰基 -丙内酯为单体，在引发剂的条件下，通过开环聚合得到，成本相对较高 5。化学合成法得到的产物分子量低 ,约为 2 4kDa,不具备实际的应用价值；且催化剂有毒性 ,副产物较
10、多 ,产物分离较困难并且合成步骤冗长 ,提纯工艺复杂 ,收率低 ( 20 ),合成成本很高 ,严重制约了其规模化生产。与化学合成法相比 ,生物合成法得到的 -聚苹果酸分子量高 ,可达 200 760kDa；所需的原料简单易得 ,反应条件温和 ,产物较纯 ,近年来受到普遍的重视；但目前存在 聚苹果酸的发酵产量低的缺点 ,距离聚苹果酸工业化生产的要求还有较大差距。 现知能合成 PMA 的菌株主要有：短梗霉（ Aureobasidium sp） 、黏菌（ Physarum polycephalum ）和出芽短梗（ Aureobasidium pullulans） 6。而4 有研究者表明短梗霉菌生产
11、PMA 的能力较强 7。目前普遍认为微生物发酵积累PMA 是以 L-苹果酸为前体。刘双江等 8提出 Aureobasidium pullulans 合成 PMA 的途径与多头绒泡菌 Physarum polycephalum 相似，在两种真菌中， PMA 通过三羧酸循环和乙醛酸途径合成，其中乙醛酸途径作为 PMA 合成的替代途径。程若东等 9通过添加代谢抑制剂推断出芽短梗霉积累 PMA与 TCA循环和乙醛酸途径有关。 近年来，相关研究者主要研究聚苹果酸产生菌出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)生物合成聚苹果酸的基本规律 ,重点研究生物合成中存在的关键问题如高产菌株的选
12、育、发酵动力学及聚苹果酸合成代谢途径等 ,以提高聚苹果酸的产量 ,相关的工作具有重要的科学意义和研究价值 ,可为实现生物合成聚苹果酸的产业化 提供理论依据和技术支持。 本文主要是通过琥珀酸脱氢酶抑制剂丙二酸结合紫外诱变选育聚苹果酸高产菌株。 1.4 出芽短梗霉菌种的选育 针对我国聚苹果酸不能形成工业化问题，出芽短梗霉的菌种选育主要希望能得到产酸量较高的菌株。基因突变是诱变育种的理论基础，而基因突变主要是碱基点突变和染色体畸变这两大类。诱变育种是用物理因素、化学试剂处理动植物或微生物细胞，使其基因突变的频率提高，然后选择适当的方法从变异群体中选择符合人们要求的单株个体，进而培养成新品种的方法。诱
13、变育种是在杂交育种之后发展起来的一种新方法。物理 诱变剂主要有紫外线，射线，射线，快中子，激光，微波，离子束等。其中紫外线是一种非电离辐射，具有很好的诱变效果，而且使用使用紫外诱变的特点是比较方便和安全。碱基对紫外波段的光都具有很强的吸收能力，而其吸收高峰值为 260nm。在紫外照射过程中，分子大量并强烈的吸收紫外线，形成嘧啶二聚体，也就是两个相邻的嘧啶进行共价连接，进而形成嘧啶二聚体，嘧啶二聚体的形成致使氢键作用减弱，同时使双链结构发生扭曲，导致碱基之间无法形成正常配对，从而有可能引起突变，甚至死亡。另外二聚体的形成，使双链无法正常解开，因而引起复制和转录 的异常。总之紫外线处理后可以引起碱
14、基的缺失、移码突变、颠换或转换 10。 因此，本文主要是对出芽短梗霉进行紫外诱变，另加筛选压力丙二酸，选育聚5 苹果酸高产菌株。 第 2 章 正文 材料与方法 2.1 仪器与材料 2.1.1 实验菌株 实验所用菌株为出芽短梗霉 AH2 突变株（诱变剂： ARTP 等离子），由本实验室经在平板上划线冷冻于冰箱。 2.1.2 培养基 1. 种子培养基：（ 100mL） 用于出芽短梗霉的接种培养 葡萄糖 6g ，硝酸铵 0.2g ，硫酸锌 0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾 0.05g ，玉米浆 0.1g ，磷酸二氢钾 0.01g 。 115灭菌 30 min。 2. YPD 培养基：（ 1
15、00mL） 用于菌株的活化 葡萄糖 2g ，酵母粉 1g ，琼脂 2g，蛋白胨 2g。 115灭菌 30 min 。 3. 发酵前种子培养基：（ 100mL） 用于菌株发酵前培养 葡萄糖 6g ，硝酸铵 0.2g ，硫酸锌 0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾 0.05g ，玉米浆 0.1g ，磷酸二氢钾 0.01g 。以上成分混合调 PH5.7后，加入碳酸钙 0.6g/瓶 (按每瓶加 30mL 培养基计 算），在 115灭菌 30 min。 4.发酵培养基：（ 100mL） 6 用于菌株发酵 葡萄糖 9g ，硝酸铵 0.2g ，硫酸锌 0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾 0.0
16、5g ，玉米浆 0.05g ，磷酸二氢钾 0.01g ，柠檬酸 0.1g 。以上成分混合调 PH4.0后，加入碳酸钙 0.9g/瓶 (按每瓶加 30mL 培养基计算），在 115灭菌 30 min。 5.初筛培养基 (0.02%溴甲酚绿培养基， 100mL）： 用于初步筛选出产聚苹果酸量大的菌株 葡萄糖 3g ，硝酸铵 0.2g ，磷酸二氢钾 0.01g ，氯化钾 0.05g ，硫酸镁 0.02g ，琼脂 2g 。 115灭菌 30 min 。溴甲酚绿溶液（ 0.01g/mL）单独灭菌，灭菌后按 0.02%加入三角瓶中。 2.1.3 试剂 葡萄糖，硝酸铵（重庆吉元化学有限公司），硫酸锌 (重庆
17、博艺化学试剂厂 ),硫酸镁（成都科龙化工试剂厂），氯化钾（成都科龙化工试剂厂），玉米浆 ，磷酸二氢钾（成都科龙化工试剂厂），蛋白胨（生物制药股份有限公司），琼脂粉（成都科龙化工试剂厂） ,碳酸钙，柠檬酸 ，溴甲酚绿 (成都科龙化工试剂厂 )，制霉菌素。 2.1.4 溶液 丙二酸溶 液 0.05g/mL 溴甲酚绿溶液 0.01g/mL 2.1.5 仪器及设备 1.电子分析天平 JA003A 2.T8 新世纪型紫外可见分光光度计 购于北京普析通用仪器有限责任公司 3.DELTA 320 pH 计 4.电热鼓风干燥箱 购于重庆市永生实验仪器厂 5.FRESTECH 电冰箱 6.湘仪离心机 TGL-1
18、6M 高速台式冷冻离心机 7.生化培养箱 购于重庆市永生实验仪器厂 8.LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器 9.HH-S2 二孔数显水浴 购于郑州长城科工贸有限公司 7 10.AIRTECH 超净台 购于苏州安泰空气技术有限责任公司 11.摇床 购于重庆仪器有限公司） 12.HPLC（日本日立， L-3130 高压泵、 L-2200 自动进样器、 L-2455 紫外检测器） 13.ZHWY-2102 深孔板恒温培养振荡器 购于上海智城分析仪器制造有限公司 14.QHZ-DA 全温大容量振荡培养箱 2.2 实验方法 2.2.1 出芽短梗霉的种子液培养 从平板培养基上刮取一环活化后的 AH2
19、，接到灭过菌的装有 50mL 种子培养液的 250mL 的三角瓶（一般需要加入几颗玻璃珠）中，置于摇床 28 ,180rpm培养。长到约 24h，培养基变得比较浑浊，而且瓶壁上有丝状悬浮物，取下三角瓶，用紫外可见分光光度计测定种子液的 OD 值，进而判断菌种生长情况。一般OD=1.0 大概是出芽短梗霉处于对数期的时候，生长最为旺盛。所以一般取此时的菌种进行诱变等操作。 2.2.2 出芽短梗霉 AH2 的紫外诱变致死率曲线的制作 取 OD=1.0 的菌液经已灭菌的垫有两层滤纸的漏斗过滤后，用无菌水稀释至OD=0.1。将 OD=0.1 的菌液稀释 125 倍后加入经灭菌后的平板培养皿中，并加入灭菌
20、的搅拌子，在电磁搅拌器搅拌作用下， 15W 的紫外 灯管 30cm 处 11紫外均匀照射 0、 2、 3、 5、 7、 10、 11、 12、 13min。将紫外照射后的菌液在暗室红光下按每个平板 100uL 菌液进行涂布。涂布后的平板需要放在避光， 25左右的环境中培养 2d后观察结果，结果如表 1所示。 其中，致死率 (%)=（对照组菌落总数 -处理后菌落总数） /对照组菌落总数100%12（注意：由于紫外线照射过的细胞易发生光修复作用，培养时放在暗处或用黑纸、黑布包裹进行避光培养） 表 1 紫外照射时间与出芽短梗霉致死率的关系 Table 1 Relationship between U
21、V irradiation time and the death rate of Aureobasidium pullulans 紫外时间（ min） 致死率（ %） 8 0 0 2 24.5 3 46.9 5 69.3 7 78.4 10 88.6 11 93.4 12 95 13 98.3 图 2 紫外诱变时间对出芽短梗霉菌致死率的影响 Fig.2 UV mutagenesis time lethal effect on the rate of Aureobasidium pullulans 据孙波等 13研究报道：在紫外诱变效应中，正突变常常出现在致死率较高的剂量。一般致死率以 80%
22、90%或者更低剂量有利于正突变株的产生，诱变效果较好。由图 2 可知，诱变处理 5、 7、 10min 时致死率大约在 80% 90%及稍低范围内，所以初步选择 5min、 7min、 10min 三个时间为本试验最佳诱变剂量。 2.2.3 抗性筛选 （ 1） 原理 紫外诱变作为最常用、最有效的诱变方法，由于它诱变频率高且不9 易发生回复突变的优点，一直受到众多微生物工作者的青睐 。但是，由于基因突变具有不定向性，诱变选得的突变株往往各具优势但很难得到综合酶系优良的菌株，从而使得诱变育种工作量大，而又具有很大的不确定因素。因此，如何快速高效地进行微生物遗传育种，一直是微生物研究工作中的重点 1
23、4。由于丙二酸是琥珀酸的结构类似物，是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制物，而琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸氧化成为延胡索酸进而促进三羧酸循环的酶，该酶被抑制，则三羧酸循环被阻断，造成线粒体内的柠檬酸大量积累，进而反馈抑制柠檬酸合酶的活性，使得草酰乙酸积累，则苹果酸脱氢产生草酰乙酸的平衡向生成苹果酸的方向移动，最终使得苹果酸大量积累，由于 L-苹果酸是聚苹果酸的前体物，所以苹果酸的积累会使聚苹果酸相应的积累。因此可以利用此性质将丙二酸作为筛选压力，选育出丙二酸耐受菌株，避免了传统随机筛选的盲目性，大大提高了筛选效率 15。 （ 2）丙二酸的敏感性实验 配制 0.5g/mL 的丙二酸溶液，共做 0、 0.
24、05、 0.1、0.2、 0.4、 0.8 g/L 六个浓度梯度，并据此配制 YPD 平板。将种子培养液按每板100uL 涂布于平板上， 2d后观察菌落抑菌圈大小，结果如图 3所示。（注：（ 1）、（ 2）、（ 3）、（ 4）、（ 5）、（ 6）对 应的丙二酸浓度分别为 0、 0.05、 0.1、 0.2、 0.4、0.8g/L） 图 3 出芽短梗霉对丙二酸的敏感性实验 10 Fig. 3 sensitivity experiment of Aureobasidium pullulans of malonic acid 由图 3 可知，随着丙二酸浓度的增加，菌落的大小发生了比较大的变化。 由（
25、 2）和对照（ 1）相比，菌落直径变小了 10 倍不止，抑菌圈相应的呈变大趋势，说明出芽短梗霉对丙二酸很敏感。当丙二酸浓度到达 0.1g/L 时，菌落直径继续减小，再继 续提高丙二酸的浓度，菌落直径和抑菌圈直径几乎没有明显的变化。由此，确定 0.1g/L 作为丙二酸的最佳筛选浓度。 2.2.4 紫外诱变结合丙二酸抗性筛选 由紫外诱变的致死率曲线和丙二酸的敏感性实验确定的最佳条件为：0.1g/L 丙二酸 +紫外 5min，紫外 7min，紫外 10min 步骤：取 OD=1.0（培养 24h）的菌液经垫有两层滤纸的漏斗过滤后，稀释至 OD=0.1，取 5mL OD=0.1 的菌液加入 2uL 的
26、制霉菌素（微量的制霉菌素与真菌细胞膜上的异甾醇相结合，导致原生质体膜破坏，膜通透性改变，提 高了出芽短梗霉对诱变因素的敏感性 16，有利于紫外诱变和丙二酸筛选）后，充分振摇15-20min。将菌液稀释 125 倍后加入经灭菌后的平板培养皿中，并加入灭菌的搅拌子，在电磁搅拌器搅拌作用下， 15W 的紫外灯管 30cm处紫外均匀照射 0、 2、3、 5、 7、 10、 11、 12、 13min，用移液枪分别取至四个离心管中备用。将紫外照射 5、 10、 7min 后的菌液涂布于 0.1g/L 的丙二酸平板培养基上，紫外照射 0min的菌液涂布于未经丙二酸处理的平板培养基上，涂布在暗室红光下进行。
27、涂布后的平板需要放在避光， 25左右的环境中 培养 3d 后观察结果。 2.2.5 初筛 （ 1）原理 溴甲酚绿作为最常用的酸碱指示剂，其颜色变化能灵敏的指示溶液中酸度的变化。由图 1 可知，聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体，相互之间通过酯键连接成的聚合物，分子中含有多个羧基，故具有较强的酸性，可以使溴甲酚绿发生颜色变化 ,所以可以将溴甲酚绿加入培养基中构建初筛平板培养基 17，随着菌株产酸的增多，培养基的颜色也将由蓝向黄变化。菌株产酸越多则培养基变色越快，便可在不检测培养液中聚苹果酸酸含量的情况下，通过初筛平板培养基颜色和变色圈直径与菌落直径比值初步判断菌株的产 酸的多寡。因为同条件下培养，在相同培养时间内，培养基颜色越黄菌株产酸越多，也就意味着产酸速率越
