1、肝衰竭机制及治疗进展,中山大学附属第三医院感染科高志良 教授,中山大学附属第三医院,肝衰竭 （liver failure, LF）,中山大学附属第三医院,肝衰竭一、肝细胞死亡的发生机制肝细胞死亡超过了肝脏的再生能力，即会发生肝衰竭经典的肝细胞死亡模式分为两类，即坏死与凋亡坏死往往继发于各种肝损伤所导致的ATP 耗竭，细胞肿胀溶解，导致胞内容物的释放和继发性炎症反应的发生凋亡为ATP 依赖的程序性细胞死亡方式，其细胞因皱缩而独立出来，染色质固缩，DNA 断裂成规律性片段，并被胞膜包绕形成凋亡小体，后者可由邻近巨噬细胞吞噬，以最大限度的减轻细胞内容物的渗漏和炎症反应肝脏病理中我们可以观察到肝细胞的
2、坏死与凋亡是并存的。研究证据提出新的观点，坏死与凋亡是源于相同启动因素和信号转导途径的不同的细胞死亡方式，这一过程被命名为坏死性凋亡。,中山大学附属第三医院,肝衰竭细胞肿胀是坏死早期最为显著的特征在ATP 耗竭后，肝细胞骨架蛋白的形态结构发生改变，促成浆膜大泡的形成。随即出现以线粒体去极化、溶酶体破裂、双向阴离子荧光团泄漏及浆膜大泡肿胀加剧为特征的亚稳态。该状态持续几分钟后浆膜大泡破裂，导致浆膜渗透压屏障不可逆的损伤，各种跨膜电子、离子梯度的断裂，以及溶质酶和代谢中间产物的渗漏，最终细胞失去活性,中山大学附属第三医院,病 因,中山大学附属第三医院,传统治疗,一、内科综合治疗(抗病毒治疗)二、免
3、疫调节治疗三、并发症的治疗,中山大学附属第三医院,治疗现状,一、人工肝二、肝移植三、细胞治疗,中山大学附属第三医院,我科治疗现状,中山大学附属第三医院,19982004年我科肝衰竭治疗效果情况,我科治疗现状,中山大学附属第三医院,19982004我科治疗肝衰竭的有效率（治愈率+好转率）,New strategy 乙肝肝衰竭的时相分层治疗新策略 2008年,中山大学附属第三医院,策略简介,以肝脏为主体对象的肝衰竭时相分层治疗新策略 以肝外脏器为主题对象的并发症干预新策略,中山大学附属第三医院,层次观点,病因治疗层面：全程监控抗病毒 病理生理层面：以控制过激的免疫攻击为基础，以肝细胞修复治疗（干细
4、胞移植）为终极目标，并辅以肝外脏器的稳定治疗。,中山大学附属第三医院,研究方案,中山大学附属第三医院,创新点,本项目在国内外:首次宏观、全面的对乙肝肝衰竭的病程 进行监控和处理。从观念上更新乙肝治疗的策略与方法。,中山大学附属第三医院,中山大学附属第三医院,以肝脏为主体对象的肝衰竭时相新观点,中山大学附属第三医院,慢性肝衰竭上升期三重打击学说,中山大学附属第三医院,第一重打击 免疫损伤,以CTL为中心的细胞免疫： 免疫效应细胞，CD8+CTL； 靶抗原，HBcAg、HBeAg、pre-S1、S2 I类MHC分子。肝细胞凋亡途径： 穿孔素颗粒酶系统； Fas系统； TNF系统； TRAIL。,中
5、山大学附属第三医院,第一重打击 免疫损伤,尽管TRAIL 介导的细胞凋亡途径已被阐明，但其是否与Fas-L、TNF- 途径一样在急性肝衰竭的疾病进程中发挥重要作用尚不明确体内外研究表明正常肝细胞对于TRAIL 介导的凋亡反应耐受，而慢性病毒感染、脂肪变性及毒性物质的刺激却可上调肝细胞TRAIL 的表达，进而通过TRAIL 配体/受体系统特异性清除病毒感染的肝细胞或肝癌细胞TRAIL 配体/受体途径对于肝细胞选择性诱导凋亡的作用为病毒性肝炎与肝胆管系统恶性肿瘤的治疗提供了潜在的治疗靶点。,中山大学附属第三医院,第一重打击 免疫损伤,持续的HBV复制严重损伤了病毒特异性T细胞功能，包括 增殖和分泌
6、细胞因子IL-2、IFN-r和INF-a的能力。 这种T细胞的功能损伤称之为功能耗竭(exhausition)， 可能与抗原提呈细胞（主要是DC）功能低下、调节性T细 胞（Regulatory T cells ，Tregs）增多以及抑制性受 体的高表达有关。 CD28家族的程序性死亡受体1（PD-1）分子可作为这些功 能耗竭的T细胞重要标志。,Zhang Z et al.J Hepatol 2007，47：751-759Xu DP et al.J Immunol ,2006,177(13):739-747Chen L et al.Nat Rev Immunol,2004,4(5):336-34
7、7,中山大学附属第三医院,第一重打击 免疫损伤,缺乏PD-1表达将会失去对T细胞反应过强的控制，从而诱 发免疫病理损伤，促进急性肝衰竭的发生。,中山大学附属第三医院,第一重打击 免疫损伤,Radziewicz H et al.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171,当肝脏炎性反应轻微时，肝内T细胞低表达PD-1，同时肝 细胞也低表达PD-L1，这样TCR信号可诱导T细胞发生正常 的免疫应答。 当肝脏炎性反应增强时，肝内增强的PD-1/PD-L1信号途径 就会抑制并损伤T细胞反应。 当肝脏炎性反应进一步增强时，肝内的PD-1/PD-L1信号途 径就会提高反应
8、性T细胞凋亡敏感性，从而抑制免疫应答。,中山大学附属第三医院,第一重打击 免疫损伤,Radziewicz H et al.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171,中山大学附属第三医院,第一重打击 免疫损伤,PD-1/PD-L1结合可能通过两条途径来抑制肝内T细胞反应： 通过磷酸化接头蛋白减弱TCR信号、降 低T细胞功能； 干扰细胞周期，提高细胞凋亡敏感性。,Radziewicz H et al.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171,中山大学附属第三医院,第一重打击 免疫损伤,肝细胞内病毒的复制诱导产生多种细胞因子，以
9、TNF-为核心的炎症反应，包括TGF-1对肝细胞再生的抑制作用， TNF-、IFN-、IL-6、IL-8水平的升高。另外，IL-15和NK细胞也可能在重型肝炎发病中起一定的作用。,中山大学附属第三医院,第二重打击 缺血缺氧,与其它高需氧的组织器官类似，肝脏对供血不足引起的损伤极为敏感。其中低流量性缺血，即血供被完全阻断时，整个肝脏将处于缺氧状态。而低流量性缺氧，即仍有血供但不足以满足氧需时，肝小叶中央区域而非周边区域将发生缺氧。由于肝脏具有双重血供系统，由低流量性缺氧造成的中央区域肝细胞的坏死是更为常见的现象。,中山大学附属第三医院,第二重打击 缺血缺氧,缺氧条件下肝脏微循环的紊乱导致肝脏损伤
10、一系列肝脏损伤的启动因素去除后，ALT/LDH指标持续低下预示肝脏缺血存在巨噬细胞的过度激活在急性肝衰竭病人的进展中起关键性的作用，肝脏中活化和增殖的巨噬细胞损伤内皮细胞，扰乱肝脏微循环。,Kazuhiro Kotoh, Hepatology 2008, 7:6,中山大学附属第三医院,第二重打击 缺血缺氧,Kazuhiro Kotoh等回顾性研究了日本33例急性肝脏损伤病人，分为存活组和死亡组病人入院后第三天ALT/LDH指标与MELD评分ROC曲线下面积分别为0.893、0.777存活组在LDH达到高峰之后，ALT/LDH指标迅速增高死亡组LDH延迟降低，ALT/LDH指标低，由肝脏微循环紊
11、乱引起,Kazuhiro Kotoh, Hepatology 2008, 7:6,中山大学附属第三医院,第二重打击 缺血缺氧,Lorrie A.等研究了细胞信号抑制因子的表达与小鼠肝脏缺血再灌注损伤严重性的关系TNF、IL-1、IL-6和IFN通过JAK-STAT通路对缺血再灌注损伤有重要的作用,Lorrie A.Journal of Hepatology 49 (2008) 198206.,这项研究第一次揭示了肝脏缺血再灌注损伤进展之间的关系，前炎症介质的诱导及负信号调节机制的活化GPT的清除，仅仅表示肝细胞很少继续坏死，不能预示恢复,细胞因子在不同时间的表达支持动态调控机制的出现SOCS3
12、在肝脏缺血再灌注中参与急性调节，轻微的损伤SOCS3能够控制细胞因子的表达SOCS1的诱导是一种辅助的调控机制,肝脏缺血再灌注后，IL-6是SOCS1、 SOCS3的主要诱导物 在外伤和多器官功能衰竭的病人中，IL-6 作为损伤严重性和死亡率的潜在性标记,高IL-6水平与预后差存在相关性，标志着负调节机制不足多器官功能衰竭时，负调节机制在局部或偏远损伤时诱导不充分，阻碍内环境的稳定及抑制炎症的进展,中山大学附属第三医院,第三重打击 内毒素血症,激活枯否细胞,细胞因子（ TNF）炎性介质（PAF）NO，内皮素，自由基，etc,微循环障碍,肝损害,Han DW et al. World J Gas
13、troenterol,2002,12,(8);961-966,内毒素,中山大学附属第三医院,第三重打击 内毒素血症,肝脏,内毒素,肠道菌群失调 肠道屏障,肝脏解毒功能 门脉高压,中山大学附属第三医院,第三重打击 内毒素血症,内毒素,经典途径：classical CD14 dependent pathway旁路途径： other pathway-sCD14 LBP：LPS binding protein Grace LS, et al. Hepatology 2000; 31: 932-936,Uesugi T, et al. Role of Lipopolysaccharide-Binding
14、 Protein in Early Alcohol-Induced Liver Injury in Mice J. J Immunol. 2002 ;168(6):2963-9,中山大学附属第三医院,第三重打击 内毒素血症,SCHFER C, et al, 2002, 37,(1), : 8186.,中山大学附属第三医院,第三重打击 内毒素血症,Uesugi T, et al. J Immunol. 2002 ;168(6):2963-9,LBP KO: LBP knockout mice.,中山大学附属第三医院,LPS刺激肝组织后分泌TNF,IL-1增多,P.Olinga,et.Journa
15、l of Hepatoloty. 2001(35:187-194),第三重打击 内毒素血症,中山大学附属第三医院,第三重打击 内毒素血症,-P.Olinga,et Journal of Hepatoloty. 2001(35:187-194) -Knolle P,et al. J Hepatol. 1995;22(2):226-9,LPS刺激肝组织后分泌IL-6,IL-10增多,中山大学附属第三医院,第三重打击 内毒素血症,TNF导致肝细胞调亡/坏死,Qing Zang G,et al. World J Gastroentero, 2000; 6(5):688-692,6 hours afte
16、r GalN/TNF-, a greatnumber of apoptotic liver cells are found,Apoptotic cells (a), apoptotic bodies (b), leukocytes (l) and necrosis (n).,9 hours after GalN/ET, further increase of apoptotic liver cells and pieces of liver cell necrosis and bleeding with leukocytes infiltration appear.,Qing Zang G,e
17、t al. Effect of hepatocyte apoptosis induced by TNF-on acute severe hepatitis in mouse models J. World J Gastroentero, 2000; 6(5):688-692,TNF抗体可阻断内毒素所引起的肝损害,Analysis of DNA ladder from liver cell extract.,Marker ET 6h TNF 9h ET 9h,Marker,TNF 6 h,Anti-TNF-/ET 9h,TNF,一种适用于慢加急性肝衰竭预后评估并且优于MELD的评分系统研究目的：
18、试图建立一种适用于慢加急性肝衰竭预后评估并且优于终末期肝病模型(MELD)的评分系统。,中山大学附属第三医院,研究背景：全国慢性乙型肝炎病人约2800万约1病人在病程中发生慢加急性肝衰竭晚期慢加急性肝衰竭死亡率大于80,中山大学附属第三医院,直到目前为止，对乙型肝炎慢加急性肝衰竭包括核苷类似物抗乙型肝炎病毒的内科综合治疗或加上人工肝支持系统治疗，仅对于有足够肝再生能力的病人才能奏效；而无足够肝再生能力的病人只能进行肝移植治疗才能挽救生命。然而，供肝缺乏，术后长期抗排斥和抗乙型肝炎病毒治疗，以及手术费用高昂等因素限制了肝移植治疗的临床应用范围。因此，临床上迫切需要建立一种客观，简便和敏感的评分方
19、法来帮助临床医生评估乙型肝炎慢加急性肝衰竭病人是选择内科综合治疗或/加上人工肝支持系统治疗，还是进行肝移植治疗。,中山大学附属第三医院,研究方法： 对死亡组196例和存活组203例慢加急性肝衰竭进行MELD评分，同时选择凝血酶原活动度、肌酐、肝性脑病、并发感染、血清总血清胆红素、肝脏大小和腹水等7个肝衰竭相关的临床指标，按照严重性给以14分并合计总分，然后比较这两种评分系统的异同。,中山大学附属第三医院,注：感染的评分： 13分均以白细胞（WBC）计数或中性粒细胞（N）的百分比，先达到者为准计分。 4分的标准为：凡有肺部炎症的影像学改变，无论其白细胞和中性粒细胞的值为多少，均计为4分。,表2.
20、 本评分系统与MELD评分结果,本评分系统t值26.13大于MELD评分t值16.57；ROC曲线下面积分析表明本评分系统比MELD能更准确地预测预后。,用ROC曲线比较MELD和本评分系统的预测能力：两者的分值均能够非常好的预测慢性乙型重型肝炎患者的死亡率MELD和简易评分系统的曲线下面积（c-statistic）分别为0.886(95 C值可信区间为0.852-0.920)和0.960 (95 C值可信区间为0.944-0.977)，两者的95可信区间无重叠，有统计学意义本评分系统对慢性乙型重型肝炎预后的预测能力明显优于MELD系统(图3)。,中山大学附属第三医院,图3. MELD与本评分
21、ROC曲线图,结论 与MELD评分相比较本研究增加了肝脏缩小，腹水，肝性脑病和感染4个临床指标参与慢加急性肝衰竭的评估，提高本评分系统的敏感性，更适用于慢加急性肝衰竭预后评估。本评分系统是一种敏感性优于MEID评分的客观，简易的评分系统。,中山大学附属第三医院,慢性乙型肝炎自然病程中从肝纤维化第1期到4期血清HBV DNA水平逐渐下降，而由相同肝实质体积分摊后没有变化研究背景在慢性乙型肝炎的初期，血清HBV DNA水平处于高水平；相反，在肝纤维化，肝硬化和肝细胞癌时血清HBV DNA的水平处于较低水平。,中山大学附属第三医院,研究目的弄清慢性乙型肝炎自然病程中从肝纤维化1期4期血清HBV DN
22、A水平的变化动态，以及不同肝纤维化分期用相同肝实质体积分摊后的变化动态。研究方法从1期4期肝纤维化的面积，推算肝纤维化1期4期的肝实质体积比例见示意图1。,中山大学附属第三医院,研究结果 1慢性乙型肝炎自然病程中从肝纤维化1期4期的血清HBV DNA水平变化动态，以及用相同肝实质体积分摊后的变化动态见表1：,2慢性乙型肝炎自然病程中从肝纤维化1期4期的血清HBV DNA水平变化动态，以及用相同肝实质体积分摊后的变化动态的统计学分析见表2：表2可见：从肝纤维化1期4期血清HBV DNA逐渐下降有统计学差异，但是，用相同肝实质体积分摊后，4期之间没有存在差异。,结论在慢性乙型肝炎的自然病程中，从肝
23、纤维化1期4期血清HBV DNA水平逐渐下降与肝实质体积的逐渐缩少造成提供给HBV复制的场所减少有关。,中山大学附属第三医院,恩替卡韦在乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭中的应用研究,中山大学附属第三医院,目的 观察恩替卡韦治疗对乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭患者生存率的影响。 方法 84例治疗组乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭患者在常规内科治疗基础上加用恩替卡韦0.5mg/天治疗，99例对照组患者采用常规内科治疗，观察患者存活情况、肝功能生化学指标、HBVDNA定量、凝血酶原时间，比较两组患者在早期、中期、晚期各期肝功能衰竭生存率的差异。,中山大学附属第三医院,结果 在早期慢加急性肝功能衰竭
24、患者中，治疗组存活率为63.27%（31/49），高于对照组存活率39.66%(23/58)，P=0.015。在中期慢加急性肝功能衰竭患者中，治疗组存活率为62.96%(17/27)，高于对照组存活率35.14%(13/37)，P0.028。在晚期肝功能衰竭患者中治疗组存活率50（4/8），对照组为25（1/4），两组比较无显著性差异（P0.408）。在血清总胆红素大于342mol/l的患者中，治疗组存活率为56.00，高于对照组(26.79),P0.002。在治疗4周时，治疗组HBVDNA载量下降3.95log10 copies/mL，高于对照组1.78 log10 copies/ml（P=
25、0.001）。,中山大学附属第三医院,表1 患者人口学及治疗前基线情况(S) 治疗组 对照组例数 84 99性别（男/女） 76/8 88/11 20.123 P0.726年龄（岁） 40.2010.64 39.5410.46 t=0.427 P=0.670TBili(mol/l) 386.18183.48 403.11180.09 t=0.628 P=0.531ALT (U/l) 510.75697.50 488.75612.89 t=0.238 P=0.812AST(U/l) 419.90513.35 354.59386.00 t=0.981 P=0.328ALB (g/l) 33.795
26、.11 32.514.66 t=1.764 P=0.079PT (sec) 29.3310.18 29.096.61 t=0.192 P=0.848HBeAg阳性率（）29.76 26.26 20.277 P0.599HBV DNA 4.9762.855 3.9442.662 t=2.527 P=0.012(log10 copies/ml),中山大学附属第三医院,中山大学附属第三医院,恩替卡韦治疗乙型肝炎早期慢加急性肝功能衰竭患者的生存分析,结论在乙型病毒性肝炎慢加急性早期及中期肝功能衰竭患者中，采用恩替卡韦抗病毒治疗能提高生存率，在晚期肝功能衰竭患者中需加大样本量进一步研究。在总胆红素水平高
27、于342mol/l的患者中，恩替卡韦抗病毒治疗能提高患者生存率。,中山大学附属第三医院,干细胞基础研究及 临床应用（肝衰竭治疗）进展,中山大学附属第三医院,研究背景,中山大学附属第三医院,干细胞(stem cell)是目前医学、生物组织工程学等领域研究的热点之一;间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能和体外稳定扩增能力, 广泛应用于心血管、骨骼、 神经、造血及肾脏系统疾病的治疗;,Heydarkhan-HS, et al. Cell Tissues Organs, 2008; 187(4): 263.Sabrina C, et al. Cell Biol Int, 2007; 31(8):
28、 845.Perin L, et al. Pediatr Res, 2008 Jan 24,研究背景,中山大学附属第三医院,MSCs 在肝脏病治疗中的应用 2006年英国科学家首先利用脐带血干细胞培育 人类肝脏组织 2008年台湾学者通过脾内和静脉注射, 采用不 同剂量的MSCs治疗肝衰竭的免疫缺陷小鼠显示: MSCs能有效地修复肝损伤,Pai M, et al. Am J Gastroenterol , 2008 Jun 30. Kuo T K. et al. Gastroenterology. 2008; 134(7): 2111-21,研究背景,中山大学附属第三医院,Banas A et
29、al. J Gastroenterol Hepatol. 2008 Jun 25. Poll D v et al. Hepatology. 2008; 47(5): 1634-43,最近日本Waseda(早稻田)大学研究者在体外和动物体内验证: MSCs具有较强的肝细胞分化特性以及较好的肝损伤修复作用。美国Harvard大学的学者在近期Hepatology上报道: MSCs分泌的细胞因子在大鼠体内能促进肝细胞再生和抑制调亡。,研究背景,中山大学附属第三医院,自体MSCs避免: 免疫排斥反应和伦理学限制, 具有良好应用前景.英国伦敦帝国医学院应用自体MSCs对慢性肝病的临床治疗显示: 1. 该方
30、法是安全的, 有效的,未见任何并发症; 2. 临床症状明显改善, 随访12个月18个月未见肿瘤形成.,Levicar N. et al. Cell Prolif. 2008; 41 Suppl 1:115-25,研究背景,中山大学附属第三医院,印度Hyderabad医院通过肝动脉注入自体MSCs治疗慢性肝衰竭和肝硬化临床研究显示: 自体MSCs是安全和有效的,A.A. Khan etal. Transplantation Proceedings, 40, 114044,基础研究,中山大学附属第三医院,1.正常成人MSCs 2.肝衰竭患者MSCs 3.羊水干细胞 4.肝衰竭肝匀浆蛋白对MSCs肝
31、细胞分化 影响,基础研究（1）,中山大学附属第三医院,正常MSC的分离，纯化，扩增,Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,32,基础研究（1）,中山大学附属第三医院,MSC向肝细胞分化技术成熟,Chan xie, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,40,基础研究（1）,中山大学附属第三医院,MSC向肝细胞分化诱导,Chan xie, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,40,基础研究（2）,中山大学附属第三医院,乙肝肝衰竭患者MSCs的HBV感染状况研究,基础研究（
32、2）,中山大学附属第三医院,对乙肝患者的BMSCs安全性检测(免疫组化),Chan xie, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,40,基础研究（3）,中山大学附属第三医院,羊水MSCs与骨髓MSCsOct-4基因表达水平的比较,Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,32,基础研究（3）,中山大学附属第三医院,羊水MSCs与骨髓MSCs向肝细胞诱导分化能力的比较,Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,32,基础研究（3）,中山大学附属第三医院
33、,羊水MSCs与骨髓MSCs细胞遗传学部分研究,Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,32,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,肝衰竭模型大鼠血清、肝匀浆中促进/抑制肝细胞再生蛋白的分析,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,肝衰竭模型血清和肝匀浆诱导大鼠骨髓MSCs向肝细胞分化,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,肝衰竭模型血清和肝匀浆对大鼠骨髓MSCs体外增殖的影响,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,凝胶层析法分离纯化正常大鼠与肝衰竭肝匀浆蛋白,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,凝胶层析法分离纯化正常大鼠与肝衰竭血清蛋
34、白,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,肝衰竭肝匀浆蛋白成分聚丙酰胺凝胶电泳,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,第1波峰:集中在260KD50KD； 第2波峰蛋白主要集中在220KD50KD; 第3波峰蛋白主要集中在85KD15KD； 第4波峰蛋白主要集中在85KD12KD; 第5、第6波峰的蛋白在电泳中没有蛋白条带,聚丙酰胺凝胶电泳蛋白条带大致分布,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白对大鼠骨髓MSCs体外增殖的影响,基础研究（4）,中山大学附属第三医院,初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白对大鼠骨髓MSCs体外肝细胞分化诱导,基础研究（4）,中山大学附属第三医院
35、,分离纯化后肝匀浆蛋白对MSCs作用发现:,既有促进MSCs肝细胞的分化(促分化作用); 同时还有对MSCs增殖有抑制作用(毒性作用); 提示肝衰竭患者的血浆和肝脏存在: 内促进/抑制肝细胞再生蛋白成分失衡,(已整理成文待发表),基础研究（4）,中山大学附属第三医院,(展望),进一步分离血清及肝匀浆中促进MSC向肝细胞分化的蛋白和对增殖抑制的蛋白;寻找具体的目的蛋白质，并进行蛋白测序和鉴定;分离纯化后蛋白应用于人工肝和临床治疗.,临床研究,第一代：自体MSCs移植治疗肝衰竭(已施行)第二代：自体MSCs体外培养增殖后移植治疗 肝衰竭（研究中）第三代：干细胞诱导分化为肝细胞后移植治疗 肝衰竭（研
36、究中）第四代：各种干细胞（羊水干细胞、异体干细 胞等）的移植治疗肝衰竭（设计中）,中山大学附属第三医院,第一代：MSCs自体移植治疗肝衰竭 本科室自2005年9月起开始自体MSCs移植治疗肝衰竭的实施与研究，至2006年6月共进行32例，收到明显效果。,中山大学附属第三医院,流 程,病例选择知情同意患者准备采集骨髓MSCs分离自体回输移植自体回输移植： 1、经介入途径由股动脉到达肝固有动脉 2、B超引导下经皮肤到达门静脉右前支,中山大学附属第三医院,方 法,采集骨髓,中山大学附属第三医院,方 法,分离MSCs（密度梯度离心法）： 得到单个核细胞，其中MSCs数量： 单个核细胞数量 10-3 1
37、0-4 个。,中山大学附属第三医院,方 法,介入途径回输,中山大学附属第三医院,方 法,B超途径回输,中山大学附属第三医院,对照研究,移植组32例，男30例，女2例，43.811.3岁。 对照组60例，男56例，女4例，44.211.3岁。筛选标准：1、重型肝炎患者，诊断依照：2000年病毒性肝炎防治方案 。2、无其他肝脏疾病及慢性疾病或脏器功能障碍。3、无严重并发症如严重感染、肝昏迷、肝肾综合征等。4、半年内未进行抗病毒治疗和免疫调节治疗。5、所有患者入院后均同时应用相同内科综合治疗一周：护肝治疗及新鲜血浆、白蛋白等对症支持处理。6、均未行人工肝或肝移植治疗。7、以MSCs自体移植术施行时间
38、为观察起点。,中山大学附属第三医院,结 果,手术成功率100。所有患者术中未出现严重不良反应及并发症。术后出现穿刺部位局部血肿、瘀斑4例，骨穿部位与介入穿刺部位各2例，经对症治疗后均满意恢复。术后未出现大量出血、感染、肝区疼痛不适等并发症。,中山大学附属第三医院,结 果,术后一到四周肝功能和凝血功能的平均改善情况：移植组均优于对照组。1、ALT改善情况：未见显著差异。2、TBIL改善情况：术后三周起出现显著差异。3、ALB改善情况：术后四周起出现显著差异 。 4、PTA改善情况：术后两周起出现显著差异。,中山大学附属第三医院,结 果,中山大学附属第三医院,结 果,术后一到四周肝功能和凝血功能改
39、善患者的比例对照：移植组均优于对照组。 （其中由于慢性肝衰竭患者中ALT正常者较多，故选用ALT上升作为评价肝脏酶学改变的指标）,中山大学附属第三医院,结 果,术后一到四周ALT上升患者比例对照,中山大学附属第三医院,结 果,术后一到四周TBIL下降患者比例对照,中山大学附属第三医院,结 果,术后一到四周ALB上升患者比例对照,中山大学附属第三医院,结 果,术后一到四周PTA上升患者比例对照,中山大学附属第三医院,结 果,自觉症状改善情况（移植组优于对照组）,中山大学附属第三医院,结 果,（P=0.397）,出院时转归（移植组优于对照组）,中山大学附属第三医院,结 果,远期预后的比较（移植组优
40、于对照组）,中山大学附属第三医院,结 果,在肝功能、凝血功能指标的改善方面，移植组的恢复均较对照组为好，但未见全部具有统计学意义的差异。在自觉症状改善和出院转归以及远期预后等方面，移植组亦均优于对照组，但未见显著差异。,中山大学附属第三医院,结 论,部分患者的MSCs自体移植疗效欠佳：MSCs细胞数量较少病情严重导致肝内框架破坏严重而损伤其分化微环境，导致移植的MSCs定植、分化障碍。,中山大学附属第三医院,目前存在问题,1. 体外标记、体内示踪。2. 具体定植与分化过程。3. 重建肝内微结构（小叶、胆管）。4. 功能重建程度以及具体疗效评价方法。5. 细胞数量：100 120ml骨髓中：107108个单个核细胞（103 104个MSCs） 最好：107个MSCs数量级别。6. 体外扩增培养：时间问题；生物安全性评估,中山大学附属第三医院,前 景,结果令人鼓舞，前景广阔。着眼点：1、疗效提高与评价2、生物安全性评价3、体外培养扩增或诱导分化后回输移植4、基因改造后回输移植5、其他干细胞的移植治疗,中山大学附属第三医院,谢 谢！,中山大学附属第三医院,
