1、广州地区红掌细菌性叶斑病病原初步鉴定摘要：本文对广州及周边红掌种植基地发生的细菌性叶斑病害进行了病原鉴定，通过实验分离得到的红掌细菌性叶斑病病原菌进行常规细菌学研究，结合细菌 16S rDNA 序列分析，初步鉴定广州及周边地区红掌细菌性叶斑病病原菌为地毯草黄单胞菌 ABB-2（Xanthomona. axonopodis ABB-2） 。 关键词：红掌 病原鉴定 16S rDNA 红掌（Anthurium andreanum Linden ex Andr）又名花烛、灯台花、安祖花，属天南星科花烛属，是全球第二大热带花卉。作为重要的切花和盆栽园艺植物，由革兰氏阴性细菌引起的细菌性叶斑病是红掌的毁
2、灭性病害，法国的 Prior 报道法国西印度群岛发生红掌的细菌性叶斑病其病原菌鉴定为 Pseudomonas sp.1。蒋桂芝等对云南西双版纳红掌细菌性叶斑病的病原进行分离和鉴定，确定为野油菜黄单胞菌（Xanthomomas axomopodis pv. Dieffenbachiae）引起2。浙江省杭州市红掌种植地区分离出细菌性叶斑病的病原为（Xanthomomas axomopodis pv. Dieffenbachiae）3。 红掌细菌性叶斑病在侵染红掌初期，叶片背面出现半透明、水渍状病斑，病斑常出现在叶片的叶脉间，呈块状，边缘清淅；当空气湿度较大时，病斑迅速扩展。在嫩叶背面的病斑上可见到
3、充满棕褐色菌脓的液泡，当空气湿度降低时，液泡消失，病斑变为褐色。 1、材料与方法 1.1 样本采集 收集广州及周边红掌种植基地细菌性叶斑病典型症状红掌植株样本，带回实验室进行病原分离。 1.2 方法 1.2.1 病原菌分离 挑选新鲜的具有细菌性叶斑病典型症状的红掌病叶作为病原菌分离材料，自来水下冲洗叶片表面杂物及灰尘，在无菌条件下，病叶在 75%酒精消毒 30 s，无菌水冲洗 3 次；0.1%的升汞溶液消毒 1 min， 再用无菌水冲洗 56 遍；在病健交界处将表面消毒的病叶切成约 1 cm1 cm 组织块，最后用无菌的镊子夹取组织块铺入牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯蔗糖培养基平皿，于 29 培养
4、 23 d。待组织块边缘长出明显菌落后，采用划线法对菌落进行纯化，将获得的单菌落连续 3 次划线分离纯化后，将其编号。 1.2.2 病原菌致病性测定 无菌条件下，分别用无菌水冲洗所分离菌株的试管斜面，配成 A600 nm 为 0.6 左右的菌悬液（约 108 cfu/mL） 。取健康红掌盆栽植株（阿拉巴马）若干盆，将配好的菌悬液喷洒到红掌植株叶片组织上，每个菌株处理组 5 个重复，无菌水处理组作为空白对照，全部置于温度约为 291 、RH 约 90% 、周期性光照培养室培养。观察记录红掌叶片是否出现细菌性叶斑病病害特征。 1.2.3 病原菌生理生化特性 参照微生物学实验指导对病原菌进行生理生化
5、性质进行测定4。1.2.4 病原菌 16S rDNA 序列测定 采用煮沸法提取病原菌株的基因组 DNA：取 200 l 用 LB 培养液培养 16-18 h 的菌液，12000 rpm 离心 2 min，弃上清，加入等体积ddH2O，重悬沉淀，100 煮 5 min，置于冰上 5 min，12000 rpm 离心 3 min，取上清作为 DNA 模板，-20 保存。 采用细菌通用引物对病原菌基因组 DNA 进行 PCR 扩增5。PCR 反应体积为 50 l，10PCR 缓冲液（Mg2+ Plus）5 l，dNTP（2.5 mM）4 l，引物（20 M）2 l，病原菌总 DNA 2 l，Taq
6、酶（5 U/l）0.6 l，ddH2O 50 l PCR 扩增程序循环参数：94 预变性 4 min，然后 94 变性 45 s，51.7 退火 1.5 min，72 延伸 2 min，30 个循环，最后 72 继续延伸 10 min。 配置 0.8%的琼脂糖凝胶，取 7.5 l PCR 产物加 1.5 l 的 6loading buffer 制成电泳样品，电泳检测是否扩增出 16s rDNA 条带。检出后，将剩余的 PCR 产物进行切胶回收，按照胶回收试剂盒说明书进行纯化。利用胶回收试剂盒回收得到的纯化 PCR 产物送华大基因公司，进行 PCR 产物的直接测序。测得菌株序列在 GenBank
7、 数据库中获得序列间相似性分析。调出相似性较高的相关菌株 16s rDNA 基因序列，用 MEGA 3.0 进行序列分析，利用 Neighbor Joining 方法构建系统进化树6。 2、结果与分析 2.1 病原菌初步分离 从收集的具有细菌性叶斑病典型症状红掌病叶中共分离到 7 个优势菌株，分别编号为 ABB-1、ABB-2、ABB-3、ABB-4、ABB-5、ABB-6 和 ABB-7。 2.2 病原菌回接试验 盆栽回接感染试验中，菌株 ABB-2 回接红掌植株后显示了细菌性叶斑病的典型病症，从回接试验中的红掌病叶部位再分离试验得到的优势微生物与所回接的菌株 ABB-2 在培养特征和显微形
8、态上一致，初步断定菌株 ABB-2 为广州地区红掌细菌性叶斑病的病原菌。 2.3 ABB-2 菌株生理生化试验 病原菌 ABB-2 为革兰氏阴性菌，在 PDA 培养基上 29 培养 2 d，菌落圆形突起，边缘整齐，表面淡黄色，粘液丰富，奶油状，生长缓慢，菌落直径约为 12 mm 左右。病原菌 ABB-2 生理生化结果如表 1，通过以上生 理生化指标参照伯杰细菌鉴定手册第八版，将病原菌 ABB-2 归入黄单胞菌属（Xanthomonas） 2.4 菌株 ABB-2 16s rDNA 序列分析 如图 1，菌株 ABB-2 16s rDNA 基因扩增片段大小为 1500 kb 左右，与预测相符。CK 是 ddH2O 代替菌株 ABB-2 总 DNA 的阴性对照。利用 DNA凝胶回收试剂盒切胶回收菌株 ABB-2 扩增基因片段，并送至华大基因公司双向测序（测序引物等同 PCR 引物） 。
