1、多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群摘要：总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的在 37生长时能使乳糖发酵、在 24 小时内产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。在日常的检测过程中，特别是在饮用水的检测中，总大肠菌群的检测对检测环境、检测人员的操作水平和经验要求都很高，且检测时间长达三天，因此其检测结果的准确率都和那提高。笔者在长期检测中对一些检测过程中出现的问题着重进行了归纳，通过反复的试验，和仔细观察后，摸索出了一些规律和方法，在此加以总结，有助于以提高总大肠菌群检测的高效性和准确性。 关键词：饮用水、总大肠菌群、多管发酵
2、 中图分类号：TU731.5 文献标识码：A 根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在3724h 内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。在检测时可用多管发酵法，以 100mL 水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示的。不同的方法标准略有差异，但检测步骤大体相同，即：乳糖发酵实验、分离培养和证实试验。按生活饮用水标准检验方法微生物指标 GB5750.12-2006 的规定，总大肠菌群检测的步骤为：2.1.5.1 乳糖发酵实验（初发酵） ；2.1.5.2 分离培养；2.1.5.3 证实实验（复发酵） 。而检测的难点主要在于步骤 2.1.5.1、2.1.5.
3、3 中“产酸产气”的确认及步骤 2.1.5.2 中的菌落形态及染色的确认。初发酵阳性管，不能肯定就是总大肠菌群，经过证实试验后，有时可能成为阴性。经过多次观察发现在复发酵成阳性的样品，在初发酵时都有着一些共同的现象。在此，我们从曾经受过微生物污染水样中选出两个最具代表性的样品（污染 1污染 2）为例，加以说明。1、乳糖发酵实验中产酸与产气的判断： 分别取 10ml 水样接种到 5 只 10ml 双料乳糖蛋白胨培养液中，置于 361的培养箱内培养 24h2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则报告总大肠菌群阴性，如产酸产气则进行下一步实验。 “产酸产气”是指水样中的细菌发酵乳糖蛋白胨后产生的
4、一些比较直观的现象。这是判断初发酵是否为阳性的重要依据。试管中小倒管内如有气泡，不论其气泡大小如何即为产气。如有疑问可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生。而“产酸”的确认则相对比较复杂。从原理上讲， “产酸”的判别主要是依据培养基中所含的指示剂成分溴甲酚紫显色情况而定。溴甲酚紫的理论显色范围为 5.26.8，颜色为黄紫色。但由于水样中大肠菌种类、数量的不同，其产酸情况往往存在较大的差异。以下为已产气或未产气但已产酸的管的不同颜色（见表 1） 。 表 1、在乳糖蛋白胨中 3624h 培养的显色情况 由于发酵时间对显色的影响很大，所以培养时间应相对一致。培养时间统一为
5、24 小时。由此可见阳性管的颜色越浅产酸量越高，而这些黄色或淡黄色的在复发酵中往往会成阳性。2、特征菌落的挑选： 挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。检测时需要对初发酵阳性培养基在伊红美蓝琼脂平板上进行分离培养，再置于361 恒温箱内培养 1824h，挑选符合特征的菌落进行涂片、革兰氏试验、镜检。 在接种时，应注意环境和器械的洁净，接种针每次操作都要应注意灭菌避免交叉污染的产生，同时动作要快，以免带入环境中的杂菌，如果取样量过大会导致菌落难以分离，
6、影响特征菌落的选取。涂片时尽量选取不同特征的菌落，常见的有： 深紫黑色，具有金属光泽的菌落； 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落； 淡紫红色，中心色较深的菌落； 粉红色，中心较深的菌落； 粉红色菌落； 乳白色，中心紫黑色的菌落； 乳白色菌落。 总之在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。把表 1 中颜色不同的培养液分别接种在伊红美蓝琼脂平板上进行分离培养，培养出的菌落形态各异，将有代表性的菌落按（1）涂片：（2）晾干：（3）固定（4）结晶紫色染色：（5）水洗：（6）媒染：（7）水洗：（8）脱色：（9）复染：（10）水洗：（11）晾干：（12）镜
7、检：的步骤进行检测，各种形态的菌落镜检结果如表 2： 表 2、伊红美蓝琼脂平板上 3620h 培养的菌落形态 可见大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时；淡紫红色，中心较深时；乳白色，中心紫黑色时检出率较高；红色、粉红色菌落检出率较低。 如果把初发酵的检验结果同各个单一菌落进行革兰氏染色的镜检结果进行比较，得到表 3 结果： 表 3、各种菌落的镜检结果与初发酵实验对照结果 3、用复发酵中对分离菌落进行确认： 将上述涂片镜检的菌落分别挑取该菌落的另一部分再接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中（内有倒管） ，为了方便统计验证，每一个培养液只接种一个特征菌落，然后置于 36恒温箱中培养 24h，有产酸产气
8、者（不论倒管内气体多少皆作为产气论） ， 即证实有总大肠菌群存在。 在对表 2 中各形态菌落接种，进行复发酵验证试验后，得到结果如表 4 所示： 表 4、在普通乳糖蛋白胨中 3624h 培养的验证情况 4、结果讨论： 通过对上述各步骤的确认，和在反复检测中对新现象、新结果的不断分析补充，我们便掌握了在这两个污染样品中总大肠菌群的判别依据：即在初发酵、复发酵时皆能产酸使培养液呈黄色、并产气；在伊红美蓝琼脂平板上培养，菌落呈（1）淡紫红色，中心较深、 （2）乳白色，中心紫黑色、 （3）紫黑色，带金属光泽的各管即为总大肠菌群阳性管，查 MPN表，可以准确地报告出 100mL 水样中的总大肠菌群的 M
9、PN 值。 总大肠菌群并非系统分类学范畴中的单一种群，而是指在某一特定培养条件下，能满足特定分类特性的各个种群的总称。所以，对于不同的水体，不同的污染源，其发酵的结果和菌落的形态都会有很大的差异，具体的判别依据也同样会有很大的差别。但是，对于正常的水体，其生态往往具有一定的稳定性，这在我们多年的检测过程中也得到了证实。因此，我们可以利用上述确认方法，对污染区进行认真、仔细地检测，通过对各种表形的分析和综合，总结出一个针对性较强、准确度较高的判别方法，从而既保证了检测的准确性，又可大大提高工作效率并节约物品的消耗。 参考文献：1微生物学（第二版）作者：诸葛健，李华钟 2009.9.12生活饮用水标准检验方法GB5750-2006 卫生部 3 微生物学实验技术(第二版) 作 者：程丽娟等 2012.9.1
