1、青花菜小孢子再生植株加倍及倍性鉴定摘要：采用秋水仙碱溶液对单倍体植株进行诱导，并采用流式细胞仪及保卫细胞叶绿体染色法对青花菜小孢子再生植株群体的倍性进行分析。结果表明，小孢子再生植株群体单倍体和二倍体所占比例基本一致；采用 200 mg/L 秋水仙碱处理单倍体植株 20 h 后，3 个供试基因型植株的存活率分别为 88.9%、90%和 100%，二倍体诱导率分别为 66.7%、70%和77.8%，另外还得到 1 株四倍体植株。采用 FDA 荧光染色和 1% I-KI 染色法可清楚地观察到不同倍性间植株气孔大小和形态以及保卫细胞叶绿体数存在显著差异；单倍体植株气孔长度约为 20 ?m，二倍体约为
2、 25 ?m，而四倍体大于 33 ?m；单倍体保卫细胞叶绿体数为 7 个左右，二倍体约13 个，而四倍体最多超过 23 个。1% I-KI 染色法对设备要求简单，宜普遍采用。 关键词：青花菜；小孢子再生植株；染色体；气孔；保卫细胞叶绿体；倍性鉴定 通过小孢子培养获得的再生植株在理论上都是单倍体，而由于单倍体植株育性差，往往不能被直接利用，需要采用人工诱导进行加倍处理，使之成为双单倍体（DH）植株。秋水仙碱诱导是最常用的加倍方法。前人采用秋水仙碱溶液浸根1、培养基中添加秋水仙碱2、处理次生芽或点滴生长点3-5等，均获得了较好的效果。由于存在自然加倍因素，小孢子再生植株群体通常是由单倍体、二倍体和
3、多倍体组成的混合群体。采用秋水仙碱溶液处理的小孢子再生植株群体的倍性水平也不一致，需要采用一种高效、简便的鉴定方法进行辨别。常用的倍性鉴定方法有植株形态法（包括植株长势、叶色叶形、花器官形态、角果形态等特征） 、显微结构法（气孔大小、保卫细胞叶绿体数目、花粉粒大小和形态等） 、染色体计数法（包括体细胞染色体和花粉母细胞染色体）以及流式细胞仪 DNA 含量分析法，这些方法中准确性最高的是染色体计数法和流式细胞仪 DNA 含量分析法。 近年来研究发现，植物叶片气孔保卫细胞叶绿体数目与植株倍性之间存在相关性。观察保卫细胞叶绿体数的方法有 FDA 荧光染色法和 1% I-KI 染色法。Michael
4、等6采用 FDA 荧光染色法对西瓜保卫细胞叶绿体进行染色，清晰地观察到二倍体和四倍体保卫细胞叶绿体数分别为 9.7 个和 17.8 个，差异显著；袁素霞等7采用 1% I-KI 溶液进行染色，清楚分辨出叶绿体形态和数目，并建立了甘蓝和青花菜保卫细胞叶绿体数与倍性的关系。笔者以不同基因型青花菜为试材，采用秋水仙碱溶液对小孢子再生植株进行加倍处理，并采用流式细胞仪 DNA 含量分析法和显微结构法观察保卫细胞叶绿体数目来鉴定植株倍性，研究和探讨甘蓝类植物小孢子再生植株加倍和倍性鉴定效果。 1 材料和方法 1.1 试验材料 选用小孢子培养胚胎发生效果较好的青花菜品种里绿、美绿 410、久绿作为供试材料
5、。供试材料于 2011 年 8 月底于温室内采用穴盘基质育苗，9 月下旬优选生长旺盛、无病虫害的植株定植于大田，采用常规田间管理。2012 年 3-4 月，室外平均温度 1015 时取单核晚期至双核早期的花蕾为试材进行游离小孢子培养。 1.2 小孢子的分离、培养与植株再生 小孢子的分离、培养与植株再生方法参照张振超等8的方法。 1.3 秋水仙碱加倍处理 将生长旺盛、根系健壮的再生植株在室温条件下炼苗 35 d，从培养基中取出，把培养基清洗干净，先把根部浸入到质量百分比浓度为75%80%的百菌清 8001 000 倍液中杀菌 5 min，捞出控水后移栽到装入营养土的穴盘中，置于温室中培养。用塑料
6、薄膜遮盖保湿，并遮盖黑色遮阳网，以备光照强度大时遮阳。温室内白天温度控制在（285）、夜晚温度在（253），光照为自然光照，在光照强烈时遮盖黑色遮阳网以降低温度。生长 1 周后，取出幼苗，用自来水洗净根部表面的营养土后，把植株根部浸入浓度为 200 mg/L 的秋水仙碱溶液中 20 h，后用自来水冲洗干净，重新栽入到营养土中适应生长，10 d 后移栽入大田。 1.4 再生植株倍性鉴定 1.4.1 1% I-KI 染色法观察保卫细胞叶绿体 参考袁素霞等7的方法。取再生植株新鲜叶片，用卡诺固定液（无水乙醇冰醋酸=31）处理至叶片颜色褪去为止。切取部分褪色叶片，在无菌水中浸泡 35 min 后取出，
7、置于载玻片上，用 1% I-KI 染色 30 s，盖上盖玻片后计数即可。 1.4.2 FDA 荧光染色法观察保卫细胞叶绿体 采用 Michael 等6的方法。用 0.01% FDA 对叶片下表皮进行染色，采用倒置荧光显微镜进行观察并拍照。在荧光显微镜下，被 FDA 染色的叶绿体发出绿色荧光，没有被染色的呈现红色。每个植株取 2 个叶片，显微镜下随机观察 10 个视野，统计气孔长度以及叶绿体数目。 1.4.3 流式细胞仪倍性分析 参照张振超等8-9的测定方法，以普通二倍体嫩叶作对照。 1.5 数据分析 所得数据采用 SAS 软件进行差异显著性分析，并在 0.05 水平上进行Duncan 多重比较
8、分析。 2 结果与分析 2.1 小孢子再生植株自然加倍结果 小孢子再生植株驯化后移栽到营养土上生长 5 d，取植株幼嫩叶片进行倍性检测，通过流式细胞仪可以清楚地鉴定出倍性水平，结果见表 1和图 1。在里绿、美绿 410、久绿 3 个青花菜材料小孢子再生植株群体中，单倍体和二倍体所占比例最大，单倍体分别为 45%、50%、45%，二倍体分别为 45%、50%、50%。另外，里绿和久绿 2 个试验材料还产生了多倍体，其发生率分别为 10%和 5%。 2.2 秋水仙碱诱导加倍的效果 研究发现，不同秋水仙碱浓度和处理时间对二倍体诱导频率存在差异。秋水仙碱浓度高或处理时间长时，都会显著促进二倍体加倍，然
9、而由于秋水仙碱有致死效应，浓度和处理时间要适当，才能取得更好的诱导效果9。小孢子再生植株群体倍性初步鉴定后，采用 200 mg/L 秋水仙碱溶液对单倍体植株诱变处理 20 h。从表 2 可以发现，秋水仙碱处理后的 3 个青花菜供试基因型的单倍体植株均发生了不同程度的倍性变化，其中以二倍体植株为主。3 个基因型存活率分别为 88.9%、90%和 100%，二倍体诱导率分别为 66.7%、70.0%和 77.8%。另外，美绿 410 还得到 1株四倍体植株。 2.3 不同倍性植株保卫细胞叶绿体数目差异 分别采用 FDA 荧光染色法和 1% I-KI 染色法观察不同倍性植株叶片的气孔大小、保卫细胞叶
10、绿体数差异，结果见表 3 和图 2。结果发现，不同倍性植株叶片的气孔大小和保卫细胞叶绿体数差异显著。3 个基因型单倍体植株气孔长度在 20 ?m 左右，二倍体约为 25 ?m，而四倍体均大于33 ?m，差异明显；单倍体保卫细胞叶绿体数为 7 个左右，二倍体为 13个左右，四倍体保卫细胞叶绿体数最多，超过了 23 个。2 种染色方法均能非常有效地对气孔及保卫细胞叶绿体进行染色，而区别仅在于所采用的试剂不同而已，其染色部位均是直接对保卫细胞叶绿体染色。 3 讨论 由于小孢子培养得到的再生植株群体中倍性混杂，需要对其中除二倍体外的其他倍性植株进行处理，在再生植株生长发育早期阶段快速、准确鉴定显得尤为
11、重要。不同倍性植株形态特征存在差异。单倍体植株生活力、生长势等较正常二倍体差，倍性水平高的植株形态比正常二倍体好。然而，植株形态鉴定法易受植株长势、养分条件等因素影响，且在倍性水平高时难以区分；染色体计数法能较准确鉴定植株倍性，但操作繁琐，费工费时，效率低；流式细胞仪倍性分析高效、准确，但所需仪器设备昂贵，成本较高10-11；因此显微结构法（气孔大小、保卫细胞叶绿体数计数）被越来越多地应用到植物倍性鉴定中。袁素霞等7研究发现，同一植株上的气孔保卫细胞叶绿体数不受植株大小、叶片部位及叶龄的影响，且操作简单，可以作为早期倍性鉴定的方法。FDA 荧光染色法和 I-KI 染色法都能对完整叶片叶绿体进行
12、染色，而不需要撕取表皮，观察简单、方便。但在采用荧光观察时，发现 FDA 荧光染色的荧光会发生淬灭，影响观察效果；同时，观察时需要配备荧光显微镜，因而提高了育种成本。而 I-KI 染色后不易褪色，且对显微镜要求不高，操作简便，适宜于普通单位应用。显微结构法简便、快捷且准确性高，但需要建立不同倍性叶绿体数目与倍性之间的关系，对染色方法、操作技巧等也有一定的要求。因此，寻找一种简便、可靠、经济的鉴定方法对小孢子培养技术的应用具有非常重要的意义。 参考文献 1 Fletcher R， Coventry J， Kottl S. Doubled haploid technology for spring
13、 and winter Brassica napusM. Revised edition. Canada： University of Guelph，1998：1-42. 2 Mathias R， Rbbelen G. Effective diploidization of microspore-derived haploids of rape （Brassica napus L.） by in vitro colchicine treatmentJ. Plant Breeding，1991，106（1）：82-84. 3 Lichter R. Efficient yield of embry
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