1、Marfey法与质谱联用技术及其应用,目 录,前言LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理 1. Marfey 法分离机制的探讨 2. Marfey法与质谱的联用 3. 衍生化过程小 结应 用 举 例,前 言,常见的确定化合物立体结构的方法有如下几种：（1）化学转变法；（2）旋光比较法；（3）旋光谱（ORD）和圆二色光谱（CD）；（4）单晶X射线衍射法；（5）核磁共振法；（6） Marfey法与质谱联用。,目前酶法和CD法已用于决定氨基酸的绝对构型，但这些都是直接的方法， 确定一种对映异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。 另一方面，色谱方法例如GC和H
2、PLC已经代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基酸的肽类是不适用的。,1984年，Marfey发明了一种用HPLC来决定氨基酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：通过手性试剂进行衍生化，将D-和L-氨基酸用HPLC分离成对映异构体。于是引入手性试剂FDAA（1-氟-2，4-二硝基苯基-5）-L-丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，4-dinitrophenyl-5)-L-alani
3、namide ），被命名为Marfey试剂。,氨基酸与Marfey试剂反应所得衍生物用常用的HPLC进行分离，并在UV340 nm处进行检测。L-氨基酸衍生物常常先于对应的D-氨基酸衍生物从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高的灵敏度。因此， Marfey法广泛用于肽类化合物的结构确证，证实肽类合成中的外消旋作用。但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。,常见的Marfey试剂如下所示： L-FDAA: (1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺 L-FDVA: .-L-缬氨酰胺 L- FDPA: .-L
4、-苯丙氨酰胺 L- FDIA: .-L-异亮氨酰胺 L- FDLA: .-L-亮氨酰胺 D-FDAA: .-D-丙氨酰胺,其结构如下：,为了将Marfey法与质谱联用的方法建立起来，必须解决如下三个问题：（1）解释Marfey法用作色谱技术的分离机制，及其局限。（2）如何在没有标准品的情况下有效地将Marfey法和质谱联系起来，来检测和确定目标氨基酸。（3）如何从一个肽类样品的L-或D-氨基酸中获得相应的对映异构体,LC/MS 决 定 氨 基 酸绝 对 构 型 的 原 理,Marfey 法分离机制的探讨Marfey法与质谱的联用衍生化过程,Marfey 法分离机制的探讨,下图是用LC/MS来决
5、定肽中氨基酸绝对构型的全过程，命名作“高级Marfey法”,如图所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成两部分（sample 1和sample 2)。Sample 1与FDAA衍生化后，直接用LC/MS分析，通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何种氨基酸，如果检测到有非常见氨基酸，其平面结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。Sample 2主要用来决定非常见氨基酸的绝对构型。由于天然存在的肽类往往由D-型或L-型氨基酸组成，在色谱图上，每个氨基酸给出一个峰，其绝对构型无法在这一步决定。因此，为了得到其对映体， Sample 2中的氨基酸必须在适当的条件下进行外消旋化。但是，与FDAA衍生化及外消旋化后
6、所得的色谱图变得复杂了，很难发现一对差向异构体。,在该法中使用了质量色谱。每对差向异构体有两个峰，在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片的m/z值为检测指标的质量色谱图上可以选择到这两个峰。然后，通过比较Sample 1中原峰的保留时间和Sample 2中新产生峰的保留时间，就可以根据Marfey法中的洗脱规律来判定绝对构型了。,本法将可购得的氨基酸分为四类：中性氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、碱性和N-甲基氨基酸，在同样的条件下研究其分离行为。 FDAA主要与氨基酸上未取代的氨基、酚羟基、巯基包括N-甲基反应。,每种氨基酸的非对映异构体对都是通过其D-异构体的保留时间(tRD)和L-异构体的保留时间
7、(tRL)的差值(t)来判定的。当t值大于1.0时，每组非对映异构体对完全被分离为两个非对映异构体。左边的表格显示了四种氨基酸的两种异构体保留时间及其差异。,对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有L-型非对映异构体都先于D-型被洗脱下来。随着烃基侧链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到两衍生物，因为FDAA会引入到NH2上，也会引入到酚OH上。,酸性或含OH氨基酸的判定相对于中性氨基酸要难一些。因为其保留时间变短。侧链含有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷氨酸更难判定。在含OH的氨基酸中，丝氨酸显示出最差的判定能力，但是高丝氨酸的判定稍好些，氧甲基丝氨酸
8、显示了与丙氨酸相似的判定能力。另外，-OH天冬氨酸的两个非对映异构体显示相反的洗脱规律，而且它们的保留时间极短,对于碱性氨基酸，赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生物：单-取代、单-取代和二取代衍生物；组氨酸有两种衍生物，单-取代和双取代衍生物。它们的单-取代和双取代可被判定，而单-取代衍生物无法判定，表明-氨基的衍生化对于判定是必要的。,但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相的PH大小，可能为L D的常规顺序，也可能相反。赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正常的洗脱规律，而鸟氨酸却显示相反的顺序，尽管它们有较长的保留时间。,购得的N-甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的N-甲基衍生
9、物，尽管其保留时间长于各母氨基酸，但其判定能力要低于母氨基酸。尤其是N-甲基丙氨酸无法判定， N-甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出。,综上，FDAA的L-氨基酸衍生物并不总是先于对应的D-氨基酸衍生物被洗脱下来。因此，阐明不了分离机制， Marfey 法就不能用于非常见氨基酸的判定。此外，实验结果表明以下两点对于洗脱顺序至关重要：氨基酸的疏水性；在分离过程中FDAA衍生物的构象。,使用UV（二极管阵列检测器）和NMR方法来解决该问题（因为，它们易受构象的影响）。,如上图所示，在340和414nm处有特征性最大吸收，是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及L-丙氨酰胺的NH2之间的氢键所形成的发色团产生的；
10、而且，D-缬氨酸衍生物的UV谱与其L-型衍生物的相符。所有被测氨基酸的衍生物显示非常相似的UV谱，脯氨酸和N-甲基氨基酸除外。尤其是给出相反洗脱顺序的双取代衍生物及D-和L-鸟氨酸显示了特征的UV谱，其吸收波长从340nm蓝移到320nm。,这些结果表明，稳定的构象，包括分子内氢键，形成了一个像蒽一样的三环系统的平面分子（如下图所示）。,综上，对于L-和D-氨基酸衍生物的判定基于其疏水性的差异，源于氨基酸和L-丙氨酰胺碳上两个疏水性取代基的顺反位置。于是，顺式排列的FDAA衍生物与ODS作用更强烈，比反式排列的衍生物有更长的保留时间。对于大多数氨基酸来说，由于氨基酸侧链取代基的疏水性往往小于C
11、OOH， D-氨基酸衍生物具有顺式结构，因此在Marfey 法中L-氨基酸衍生物往往先于D-氨基酸衍生物出柱。另有文献证明，氢键的形成对结构的判定也是很有用的。,L-缬氨酸的FDAA衍生物的NOE实验显示，缬氨酸的-质子及L-丙氨酰胺的-质子与苯环的H6之间存在着强烈的NOE，如上图所示；而H6与缬氨酸的异丙基和L-丙氨酰胺的甲基之间没有NOE。另外，D-缬氨酸的FDAA衍生物与L-衍生物几乎显示相同的NMR行为。这些结果表明，两-质子都在空间上位于苯环H6的附近，在L-和D-缬氨酸衍生物中均如此。由此，缬氨酸和丙氨酰胺的除NH2以外的其它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，在溶液中是稳定
12、的，也是占优势的。,如图所示：D-缬氨酸的FDAA衍生物为顺（Z）式排列，两个疏水性取代基在同侧；L-缬氨酸的FDAA衍生物为反（E）式排列，两个疏水性基团在异侧。,为了确定COOH是否对结构的判定必不可少，文章对氨基酸甲酯和脱COOH的氨基化合物的FDAA衍生物进行了研究。,所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上表所示，它们的UV谱与母氨基酸的完全相同，保留时间比母氨基酸长，氨基酸甲酯的判定能力下降。另外，丙氨酸甲酯的FDAA衍生物未得判定，丝氨酸甲酯衍生物显示相反的洗脱顺序。氨基化合物的保留时间和判定能力几乎与其母氨基酸相同。,结果表明， COOH对于氨基酸的判定并不总是必须的。前已述，
13、与中性氨基酸相比，酸性和含OH氨基酸及氨基酸甲酯的判定能力差，尤其是-OH天冬氨酸、丝氨酸甲酯,给出了相反的洗脱顺序（D L）。这些数据进一步证实一个氨基酸的FDAA衍生物在氨基酸和L-丙氨酰胺部分有两个处于反式的疏水性取代基，要比其相应的顺式氨基酸衍生物先流出反相柱。,以上结果也可如下证实，考察用FDPA、FDVA、FDIA、FDLA和D-FDAA的氨基酸衍生物的分离行为，如下表所示：,如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也增长，判定能力也增强；而D-FDAA的氨基酸衍生物则显示了相反的洗脱顺序。,本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸衍生物保留时间的
14、顺序来解释洗脱顺序。因为在氨基酸中COOH是一个常见的功能基团，而一个氨基酸的FDAA衍生物的疏水性也决定于该氨基酸的侧链，因此，DL-氨基酸的tR和洗脱顺序间的关系已如Table1所示。如Figure4所示，具有常规洗脱顺序（L D）的D-和L-氨基酸衍生物的tR要比侧链疏水性与COOH相当的氨基酸衍生物的长，例如丝氨酸和天冬氨酸。,另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生物具有相对较短的平均保留时间。,于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用L-和D-氨基酸衍生物的平均保留时间进行解释。DL-丝氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它们的平均保留时间位于洗脱顺序的临界点上。然而，鸟氨酸的二取代衍生物
15、表现出非常有趣的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管它们有相对较长的保留时间（27.3min），如Figure4所示。对这种分离行为的研究正在进行之中。,至此，第一个问题已基本得到解决。由于氨基酸与L-FDAA所得衍生物的热不稳定性和低疏水性，致使它们对LC/MS分析的敏感性很差。于是，选择电喷雾离子化和frit-FAB作为接口，并发展用 (1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-亮氨酰胺，即L-FDLA取代FDAA: (1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺，作为衍生化试剂，以便将Marfey法和质谱联系起来。,Marfey法与质谱的联用,在Marfey法中，氨基酸的L-FDAA衍生
16、物由常规的反相HPLC分离并在UV340nm处检测；在本法中，UV检测器被换成质谱仪，即氨基酸衍生物经LC/MS分析。为了顺利地将传统的HPLC条件改为适合LC/MS分析的LC条件，必须解决如下两个问题：,（1）将从HPLC洗脱出来的液体注入质谱仪时，其体积应大大减小，因为ESI和frit-FAB是最终被作为一种接口来使用的。（2）HPLC流动相中的非挥发性缓冲液应用挥发性缓冲液代替。解决方法：（1）应用半微量柱（1502.1mm I.d,），本法用该柱给予L-和D-氨基酸衍生物以足够的分离度。若为frit-FAB LC/MS 溶液流速应进一步减小至5l/min。（2）使用TFA或醋酸铵缓冲液
17、（PH3）作为流动相，与使用磷酸缓冲溶剂系统有几乎相同的分离度。,尝试了4种用于分析氨基酸L-FDAA衍生物的LC/MS接口，即ESI、大气压化学离子化（APCI）、TSP、和frit-FAB。极性氨基酸衍生物不能用TSP和APCI作为接口。尽管任何氨基酸都可以用ESI和frit-FAB接口，但它们的灵敏度特别低，这可能是由于氨基酸的L-FDAA衍生物的热不稳定性和低疏水性造成的，表明需要制备一种高疏水性的衍生化试剂。此外， ESI和frit-FAB被选作接口，还因为使用这种接口可以抑制温度诱导效应。在FAB-MS中，疏水性越强的化合物其分离效果越好。,衍生化过程,引入了一个外消旋化程序，使用
18、DL-FDLA代替传统的化学外消旋化，以得到L-或D-氨基酸相应的对映异构体。为了获得满足以下条件的衍生化试剂： （1）可获得更高疏水性的氨基酸衍生物； （2）不减少以前L-FDAA衍生物的特征UV吸收； （3）符合通常所言的分离机制。,尝试了4种衍生化试剂L-FDVA、L-FDPA、L-FDIA和L-FDLA，具体数据如Table1所示：（1）被测衍生化试剂的保留时间要比L-FDAA长；（2） L-FDLA M+H+的离子丰度最高，约为L-FDAA的30倍。,由 Table2可知，L-FDLA的分离效果要强于L-FDAA由Table1、Table2得，L- FDLA是用于LC/MS分析的最有
19、效的衍生化试剂。,为了确证L-FDLA的实用性， L-FDLA的氨基酸衍生物使用以frit-FAB 或ESI作为接口的LC/MS进行分析。为了比较氨基酸的L-FDAA衍生物和L-FDLA衍生物在相同条件下的电离情况，两种衍生物的等量混合物进行LC/MS分析。如Ffigure1所示,DL-丙氨酸的L-FDAA和L-FDLA衍生物的M+H+阳离子质量色谱，其整体质谱使用frit-FAB 作为接口。L-FDLA衍生物的灵敏度比L-FDAA衍生物的提高了三倍，这种趋势适合于任何常见氨基酸。对于ESI LC/MS，不管采用阳离子还是阴离子模式，灵敏度都提高24倍。由上可知， L-FDLA不仅适用于HPL
20、C分析，也适用于LC/MS分析。使用frit-FAB 和ESI LC/MS的检测限分别为10和5pmol。,通常，天然存在的氨基酸都是由D-或L-构型的氨基酸组成的，每种氨基酸只能在色谱图上显示一个峰,绝对构型不能通过其他方法来解决。因此，为了从D/L氨基酸获得一对对映体，进行外消旋化是很有必要的。最初使用的外消旋化方法为： 水解产物+醋酐+三乙胺 唑酮中间体 外消旋化的N-乙酰基氨基酸 水解 目标产物,优点：对于肽中少数氨基酸来说是简单可行的。缺点：耗时；难于终止外消旋化作用；当氨基酸中含两个不对称碳原子（如苏氨酸、亮氨酸）时，就不能给出对映异构体的混合物，而是非对映体的混合物。,如上图所示
21、，D-氨基酸的L-FDLA衍生物（DL型）和L-氨基酸的L-FDLA（LL型）衍生物是非对映异构体，在色谱图上给出不同的保留时间；另一方面，LD和DL型、DD和LL型是对映异构体，每一对都显示相同的保留时间，即某氨基酸的D- FDLA衍生物与该氨基酸的对映异构体的L-FDLA衍生物有相同的保留时间。据此，有望以D- 和L-FDLA的等量混合物代替只以L-FDLA做衍生化试剂，来得到前述的外消旋化作用。,上图还表明，用D/L-FDLA进行衍生化是可行的，该方法用于含两个不对称碳原子的氨基酸时，所得两个峰对应于原氨基酸和其对映异构体的L-FDLA衍生物。此外，化学外消旋化和D/L-FDLA衍生化相
22、结合用于含两个不对称碳原子的氨基酸时，可能在HPLC谱中产生四个异构体峰。,小 结,至此，LC/MS联用的三个问题已得到解决：问题一：采用什么色谱技术来分离氨基酸。我们采用Marfey法作为色谱技术。问题二：怎样有效地将Marfey法与质谱联系起来。我们采用ESI和Frit-FAB作为接口。问题三：怎样能得到D-或L-氨基酸的对映体。使用了用来衍生化的L-FDLA和用来外消旋化的D/L-FDLA代替FDAA。,这样就建立了一个运用LC/MS，称作“advanced Marfeys method”的非经验性方法，该法有三部分组成：用于分离氨基酸的色谱技术： Marfey法；通过质谱方法检验氨基酸
23、；从L-或D-氨基酸得到相应的对映异构体的过程。本法的突出优点是：可以在没有标准品的情况下确定绝对构型；可以同时分析肽链中的任何氨基酸。,应 用 举 例,该法已经成功运用于肽链中氨基酸的结构确定。还用于研究伯胺类化合物、仲醇类化合物和含噻唑环的氨基酸等的绝对构型。下面简要介绍一下运用该法对藻青菌（cyanobacteria）所产生的microcystin LR中的氨基酸的结构研究。,Microcystin LR是一种毒性环肽，由七个氨基酸片段组成，其中-甲基天冬氨酸（ -MeAsp）分子中有两个不对称中心。如下图,Microcystin LR的水解产物被分成两部分，一部分与L-FDLA进行衍生
24、化，另一部分与D/L-FDLA进行衍生化，衍生物先经过HPLC的二极管阵列检测器检测其UV谱，然后以阴离子模式进行ESI LC/MS分析。,如Figure5a所示为谷氨酸、 -甲基天冬氨酸（ -MeAsp）、丙氨酸和亮氨酸的L-FDLA衍生物以M-H值监测的质量色谱图，其中精氨酸的L-FDLA衍生物是以M+TFA-H值进行检测的。五个氨基酸的与其m/z值对应的峰在质量色谱图上都有明确地显示。该方法的另一个有点是能够发现任何非正常氨基酸的反应产物，在这里3（S）-Adda-L-FDLA峰就是这种情况。,在水解产物的D/L-FDLA衍生物的质量色谱上，有新产生的对映体峰（Figure5b），根据其洗脱顺序得出结论：在Microcystin LR中，精氨酸(arginine)、和亮氨酸(leucine)具有L-构型，而谷氨酸(glutamic acid)、丙氨酸(alanine)、和-甲基天冬氨酸( -MeAsp)具有D-构型。由于Microcystin LR中的-MeAsp的相对构型已被阐明为赤式，故它应为D-赤式构型另外，比较m/z值为706的衍生物峰发现，在质量色谱图上，L-FDLA衍生物要先于D-衍生物被洗脱下来，推测Adda中的不对称碳原子C-3具有S构型。,
