1、分子流行病学进展及其在疾病预防控制中的应用Molecular Epidemiology and its Application in Disease Prevention & Control,沈 洪 兵 南京医科大学公共卫生学院,分子流行病学的定义（Molecular Epidemiology）,分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关生物标志（或分子事件）在人群和生物群体中的分布及其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略与措施的科学。应用先进的技术测量生物学标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程。,Cancer,传统流行病学（宏观、群体）,E
2、xposure,传统流行病学和分子流行病学,传统流行病学,分子流行病学,传统流行病学与分子流行病学的关系（EDC模型）（Schulte,1993）,暴露,疾病,Medical Practice etiology diagnosis treatment prevention,分子流行病学？,Gene discovery &CharacterizationSNPsHaplotypes,Human Genome ProjectHapMap Project,分子流行病学的特点,与传统流行病学不同 研究的水平不同 所解决的问题不同 与分子生物学的区别 研究对象不同（人群） 研究内容和方向不同（强调与宏观
3、暴露的关系） 研究方法不同（流行病学思维和方法）宏观与微观相结合！,分支 肿瘤分子流行病学 传染病分子流行病学 ,分子流行病学的发展趋势 研究手段越来越多,技术越来越成熟研究内容(生物标志物)越来越丰富应用范围越来越广（病因、危险度评估、早期诊断、个体化治疗）,生物标志（biological markers, biomarkers）是可以测量的、能代表生物结构和功能的大分子物质，如DNA、RNA (miRNA)或抗原、抗体、蛋白质（酶）等。,分子流行病学的主要研究内容：生物标志,一、暴露标志（exposure marker）,（一）外暴露标志主要指环境因素暴露，包括生物性因素和非生物性因素1、
4、生物性病原因子的鉴定2、病原生物进化变异规律（进化树）3、环境化学污染物（非生物因素）暴露（二）内暴露标志1、传染性疾病： 感染状况、抗原抗体检测、病原体基因监测2、慢性非传染性疾病 内暴露剂量、 生物效应剂量,内暴露剂量包括对化学毒物、饮食中的营养素和可能致癌剂以及微生物感染的测定。例如：,吸烟 - 血或尿中的烟草代谢产物可替宁浓度（Cotinine）多环芳烃 - 尿中的1- 羟基芘水平饮食暴露- 黄曲霉毒素B1(AFB1)和尿中N-亚硝基化合物（ N - nitroso compounds）的浓度、血液中营养素水平工作暴露和环境污染 - 血清或脂肪组织中的杀虫剂DDT（dichloro-d
5、iphenyl-trichloroethane）、多氯联苯PCBs（polychlorinated biphenyl）、二氧杂芑（Dioxins）环氧化物含量吸烟和环境污染 - 尿中的致突变因子（mutagenicity）的测定。,体内剂量标志,可替咛（Cotinine）,香烟中的尼古丁,体液,铅,环境中的铅,体液和组织（发、指甲、牙齿）,二氯二苯二氯乙烯,二氯二苯三氯乙烷,脂肪组织,黄曲霉素,食物原料,体液,二、效应标志（effect marker）,传染病 酶学的改变，血液生化（免疫）指标的变化 病原体基因的整合慢性非传染性疾病（危险性预测） 主要是基因毒性标志物，包括癌基因激活、点突变和
6、染色体异常 基因表达异常和代谢异常 基因突变或染色体畸变,生物学效应标志,三、易感性标志（环境-基因）,（一）遗传性疾病 HNPCC, BRCA1/2（二）慢性病（易感性分子标志物） DNA修复通路（肺癌、肠癌） 代谢酶系统（膀胱癌）（三）传染病 免疫系统（HLA） 炎症通路,宿主易感性标志（非传染病）,传染病慢性丙肝病人中，HLA-B44出现频率高达30%以上对白喉毒素敏感的基因定位在5号染色体长臂对脊髓灰质炎病毒敏感性基因定位在19号染色体长臂,What is a SNP? 基因多态性,A mutation in the DNA sequence with a frequency of 1
7、%,遗传性多态性标志物,人类基因组计划研究结果表明，不同个体的基因99.9%是一样的，但在序列上有极小(0.1%)的遗传差异，其中主要是 SNP。 SNP是指在人群中出现的频率1%的先天突变。SNP存在于整个人类基因组中，可能每100300bp就存在一个SNP，估计总数在数百万个。 研究表明，正是这0.1%的差异授予你我他特有的表型；这个小小的差异还与个体对疾病(包括肿瘤)的易感性、对药物的反应性差别有密切关系。,单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP),人类基因组计划(HGP),基因组多态性数据库(SNPs),Human Genome Proj
8、ect,Biology,Response,Disease,Prevention,Collins et al., Nature, 2003,人类基因组计划,单核苷酸多态与人类个体差异,单核苷酸多态与个体疾病易感性差异,Cancer,Exposure,Cancer-free,CIR by 70 yrsM: 15.9% F: 9.5%,(Peto, BMJ, 2000),Genetic susceptibility?,Screening, prevention,研究问题 1:,Why only 20% smokers develop lung cancer?,SNPs？,NSCLC,No respo
9、nse,Response,Chemotherapy,SNPs & Chemosensitivity,SNPs？,研究问题 2:,Why some lung cancer patients have no response to chemotherapy?,基因检测-危险度评价,从科学研究临床实践,人类基因组流行病学,1998年由Khoury和Dorman提出人类基因组流行病学(human genome epidemiology, HuGE)的概念，定义：应用流行病学与基因组信息相结合的研究方法，开展以人群为基础的研究，评价基因组信息（基因或基因变异及其相应编码的产物）对人群健康和疾病的流行病学
10、意义。,分子流行病学常用技术及方法,核酸技术（DNA & RNA）核酸体外扩增 （PCR）核酸电泳图谱 核酸酶切电泳图谱 （RFLP）扩增片断长度多态性（AFLP）核酸分子杂交 有原位杂交、斑点杂交、转印杂交（包括Southern blot检测DNA和Northern blot检测RNA）等。核酸序列分析蛋白质技术 蛋白质分离鉴定技术主要有：电泳、凝胶电泳、蛋白质转印杂交（Western blot）、色谱分析、蛋白质测序等。,酶学技术 包括定性和定量检测，要求一定的条件。多位点酶电泳（multilocus enzyme electrophoresis, MEE）法。免疫学技术： 酶联免疫吸附试
11、验（ELISA）、荧光免疫试验（FIA）、放射免疫试验（RIA）、免疫细胞化学检测（ICC）等；色谱（质谱）技术： 高效液相色谱技术HPLC）、液相蛋白色谱技术（FPLC）等。,PCR-RFLPPCR-SSCP, PCR-based resequencingReal-time PCRMatrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight (MALDI) mass spectrometryDynamic allele-specific hybridization (DASH)DNA-chip analysisDHPLC,illumina
12、 高通量基因分型平台,SNPstream基因分型系统,Automated Liquid HandlerSpectroPREPTM,Nanoliter DispenserSpectroJETTM,MALDI-TOF Mass SpectrometerSpectroREADERTM,Automated AnalysisSpectroTYPERTM,Miniaturized BiochipSpectroCHIPTM,MassARRAYIntegrated Components,核酸分子杂交,蛋白质检测鉴定系统,SDS-PAGE,酶联免疫吸附试验（ELISA）,高效液相色谱(HPLC, LC/MS/M
13、S),Accessible Genome and GeneticVariation database,Affordable High-throughputPlatform Service,分子流行病学在疾病预防和控制中的应用,（一）病因的探讨及病因致病机制的研究 1、传染病病因及流行规律的探讨 研究已知或新发传染病的病原体和流行特点 病原学诊断（基因诊断）、基因分型 研究分布特点，传染源追踪和传播途径确定 观察病原体在体内持续时间和消长规律,丙型肝炎病毒基因分型,Simmonds双等级基因命名系统,病原体基因分型,不同基因型HCV，其临床表现以及对抗病毒治疗的敏感程度有显著差异。1b型对干扰素
14、治疗的持续应答率为20%，而非1b型对干扰素治疗的持续应答率可达60-70%。,1a, 1b 2a, 2b, 3a,1a, 1b 2a, 2b, 2c, 3a,4,5a,1b,1b, 6,1b, 3a,1b, 3a,3b,4,Clinical Microbiology Reviews, 2000, 13(2) 223-235,HCV 1b型是我国主要流行型,1a, 1b, 2b, 3a,2a,如SARS 在广东流行可分三个阶段:早期由病人分离到的SARS 病毒与果子狸分离到的SARS 病毒高度同源,因此怀疑SARS 是一种动物来源的疾病。,上海预防医学杂志2005,SARS病毒来源及变异分析,
15、中期SARS 病毒分子结构稳定, 病毒传播力强, 超级传播事件发生多。后期SARS 病毒碱基缺失可达几百个，病毒的传播力大大减少。,案例：1990年7月，美国佛罗里达州一名AIDS妇女，怀疑在当地一牙科诊所手术时感染了HIV，因为该诊所的牙科医生也是一名AIDS患者。随后当地卫生部门对该牙医诊治过的一千余名患者进行HIV检测，共发现7名HIV感染者有在该诊所的就诊史。那么这7名HIV感染者是否与该牙医有关呢？,传染病传播途径分析,Science 1992,针对这一问题可采取的分析方法：1、传统流行病学分析方法：接触者调查，分析感染者可能的危险行为如输血、静脉吸毒、不洁性交史等。2、分子流行病学
16、方法：比较HIV病毒基因序列的差异，分析不同病例感染株遗传关系的远近。,Science 1992,与牙医感染株的遗传变异性比较,与对照感染株的遗传变异性比较,病人D,当地对照,牙医及病人A,B,C,E,G,病人F,进化树分析,以结核为例：与结核病人密切接触，感染和发病的危险增加。这些接触者与源病例之间，是否产生了结核分枝杆菌的传播？开展结核病成“簇”性研究，可以从分子角度解答这样的问题。成簇的过程就是用聚类分析对分离株的基因进行分型或分群的过程，可以分析结核病的传染源和传播途径。,揭示传染病传播机制,结核杆菌DNA指纹图谱有助于基因分型,流行病学常用结核杆菌基因分型方法IS6110-RFLPS
17、poligotyping MIRU-VNTR,Bauer等对丹麦1549株结核菌进行IS6110为基础的DNA指纹分析，成簇率49%。同样方法检测格陵兰岛成簇率为79%。,J Clin Microbiol,1998,Beijing家族结核菌株在全球的分布,江苏省北部地区(苏北) 在2003年1-7月爆发了较大规模的无菌性脑膜炎,涉及范围之广、发病人数之多,在国内较少见。,不明原因疾病爆发调查,疾病暴发原因分析,问卷调查收集基本资料血清学检测病原体分离培养,Echo30 型肠道病毒感染,病毒序列测定和比对,均为Echo30型肠道病毒。进化树分析显示分离株与国外1999年和2000年分离株的亲缘关
18、系最近；但自成一簇，与国外毒株存在地区差别。,2、非传染病的病因及病因致病机制的研究 例：载脂蛋白与心血管疾病 HBV感染与肝癌（基因组整合） EBV感染与鼻咽癌 HPV感染与宫颈癌 HP感染与胃癌,心脑血管病的研究 载脂蛋白与心血管疾病 四组老年人apooA-I、apoB-100与apoA-I/apoB-100比值人群类别 检测例数 apoA-I（mg/dl） apoB-100（mg/dl） apoA-I/apoB-100 对照组 85 148.230.1 97.328.3 1.580.8冠心病组 146 141.651.9 113.935.8* 1.400.7*高血压组 90 135.13
19、2.9* 107.059.2* 1.441.07*高血压并冠心病组,57 140.231.3 110.934.2* 1.410.8*,注：病例组与对照组相比*P0.05；*P0.01,HBV肝癌,正常人,HBV感染,正常:HBV肝癌,AUC: 99.90.1%,2/5,灵敏度:0.969,特异度:0.994,HBV:HBV肝癌,AUC: 99.20.6%,MiRNA 谱(Profile),例：恶性肿瘤的形成过程及其影响因素,前致癌物,终致癌物,DNA损伤,基因突变,癌前病变,恶性肿瘤,遗传易感性因素,（二）疾病易感性的测定 （传染病和非传染病）,测定疾病易感性，可以进行高风险人群筛选，采取更有
20、效的预防和控制措施 高危险易感基因（高外显性） 连锁研究(linkage!) 如BRCA1、BRCA2与乳腺癌（40-80） 一般人群中频率T) (DNA pol, PARP domain ) Arg399Gln (GA) (PARP domain),1246-bp,5764%,Distribution of Select Variables and XRCC1 Variant Alleles in Lung Cancer Cases and Cancer-free Controls,XRCC1 T-77C Polymorphism and Lung Cancer Risk,Hu Z, She
21、n H. Pharmacogenetics & Genomics 2005 15(7): 457-64.,XRCC1 T-77C and Cumulative Smoking,Pack-years of smoking,-77TT -77CT/CC,Adjusted OR,Hu Z, Shen H. Pharmacogenetics & genomics 2005 15(7): 457-64.,P value for the test of additive gene-smoking interaction: 0.027,This significant association with lu
22、ng cancer was validated in another independent case-control study in a Chinese population,Hao et al. 2006 Oncogene,GWAS,（三）疾病防治措施的研究,1、传染病的预防 （1）新疫苗的研制核酸疫苗（2）研究疫苗预防效果与疫苗无应答的关系，如对乙肝疫苗低应答或无应答人群中，白种人和日本人携带HLA-DR3和HLA-DR7比率较高；而中国人HLA-DR14-DR52基因的携带率较高 （3）疫苗株引起的感染,2、非传染病的防治作为抗氧化剂的胡萝卜素可减少或防止DNA的损伤叶酸可改变DNA
23、甲基化或减少染色体断裂,（四）疾病诊治效果和预后评价,1、治疗效果评价 从分子水平研究药物治疗后体内某些指标的变化情况（传染病和非传染病）2、疾病预后的评价 胃癌病人nm23基因、P27KIPI基因、TGF-BRI基因表达与生存率的关系，结果发现，癌组织内上述基因高表达组手术后3年和5年生存率均高于低表达组或阴性组,我国2000年全国流调结核菌耐药状况,初始耐药：18.6% 初始耐多药率：7.6%获得性耐药：46.5% 获得性耐多药率：17.1%总耐药：27.8% 总耐多药率：10.7%,miR-196a2 rs11614913 多态性与肺癌生存率 (CC vs CT/TT),Hu Z She
24、n H. Journal of Clinical Investigation, July, 2008IF=16.9,(A) MMP9 Arg279Gln and NSCLC survival (P = 0.03); (B) MMP9 Arg668Gln genotypes and NSCLC survival (P = 0.01); (C) Combined effect of MMP9 Arg279Gln and Arg668Gln on NSCLC survival (P = 0.007),Arg279Gln,Arg668Gln,A,B,C,Jin GShen H. Int J Cance
25、r, 2009,The 4 miRNAs Expression and NSCLC Patients Survival of all Sample Sets,Risk Score Analysis of 303 NSCLC Patients,Each patient was assigned a risk score according to a linear combination of the expression level of the miRNA, weighted by the regression coefficients from the training samples,分子
26、流行病学研究中需要注意的问题,1、重视宏观流行病学研究设计（研究设计类型、样本量！）2、重视暴露因素和危险因素的收集和利用，提高研究质量和水平（很多时候缺乏环境暴露的评估和环境基因交互作用的分析；）3、分子标志物的检测同样要防止偏倚的产生（假阳性），注意重复性（大样本多中心）和生物学合理性4、分子流行病学亦存在流行病学的许多局限性,小 结,分子流行病学产生的原因？ （流行病学)实践的需求是学科发展的根本动力。分子流行病学怎样产生？ 学科分化、交叉和融合产生新的学科或学科分支。 分子生物学提供了条件。,分子流行病学是什么? 阐明人群和医学相关生物群体中生物标志的分布及其与疾病/健康的关系和影响因素，并研究防治疾病、促进健康的策略与措施的科学。,分子流行病学做什么？ 暴露测量及其与疾病的关系 效应测量及其与疾病的关系 易感性测量及其与疾病的关系 生物标志（测量指标）的研究,分子流行病学怎么做？ 研究目的 测量指标选定 测量方法选定：分子生物学技术 研究设计：流行病学调查研究方法 资料处理分析及质量控制,展 望,分子流行病学是一门新兴的边缘学科，尚有很多不成熟的地方，但已显示出了强大的生命力。随着先进的生物标志检测技术、计算机技术、信息技术和统计学方法等的不断引入，分子流行病学将把流行病学提高到一个崭新阶段。,Thanks！,
