1、,外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析,一.实验目的,了解动物细胞培养的方法掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备熟悉人类染色体的镜下检查和组型分析方法,二.实验原理,一、外周血培养 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。 用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体装片。 人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有 分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA 等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。,二
2、、组型分析,组别 染色体编号 大小 着丝粒位置 A 13 最大 中、亚中 B 4、5 大 亚中 C 612+X 中 亚中 D 1315 中 近端 E 1618 较小 中、亚中 F 19、20 小 中 G 21、22 +Y， 最小 近端,三.实验材料及用具,培养基：RPMI1640，含双抗和小牛血清肝素PHA秋水仙素：50ug/ml低渗溶液：0.075mol/L氯化钾固定液：甲醇：冰乙酸（3：1）Giemsa染液磷酸缓冲液（pH6.8）,四.实验步骤,（一）培养液配制培养基 5mlPHA40微升 依次将上述试剂加入细胞培养瓶中。 （二）采血与培养 到医院采血2ml常规消毒后，将灭菌小瓶送入超净工
3、作台，在火焰旁将血液滴入盛有5ml培养液的培养瓶接种0.3ml全血盖上橡皮塞，轻轻摇动 以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37恒温箱内静置培养72h。 （每天摇动培养瓶两次）,（三）标本的制备,1、秋水仙素处理：终止培养前4h加秋水仙素（终浓度为 0.07 ug/ml），混匀，37继续培养。2、收集细胞：终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内， 离心沉淀7分钟(1000rpm/min)，弃去上清液。3、低渗处理：先加入1mLmol/LKCL溶液，轻轻吹打，使细 胞重悬，然后补加6mlKCL溶液，37水浴中低渗20min。4、预固定：沿管壁慢慢加入1m1新配的carnoy固定液进行预 固定，轻轻吹打
4、混匀，离心7分钟(1000rpm/min)，去上 清液。,5、固定：沿离心管壁缓慢加入固定液6m1，用吸管轻轻吹打， 使细胞分散，固定15min，离心去上清液。6、重复第5步。7、滴片：沉淀物中加入0.2-0.5ml固定液，用吸管吹打使其 成为细胞悬液；用镊子取预先冰冻的干净载玻片上，迅 速滴上2-3滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细 胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热（或空气干燥）。8、染色：滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上，使片、板 之间有一缝隙，将稀释后的Giemsa染色滴在片隙中，室 温染色20分钟；自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面） 35秒钟，晾干；镜下观察染色体分带及染色情况
5、。,（四）镜检及染色体的组型分析,1、在低倍镜下找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散良 好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄。2、将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。3、根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对。4、测量出每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、 着丝粒指数、臂指数、记录原始数据。5、根据测量数据校正目测配对排列结果，进行调整排列。6、把染色体按一定顺序一对一对地排列，排列时注意短臂向上，长臂向 下，性染色体单独排列，之后把染色体贴成一完整的染色体核型图。7、翻拍。,五.实验结果,男,女,（1）镜检
6、结果,（2）组型分析结果,A, B, D, E, F, G,（2）组型分析结果,男,女,A组： 包括三对染色体，即1、2、3号。 它是最大的一组染色体，在长度上三者略有差别。l号最大，中央着丝粒。长、短臂差别不大。长臂有时可见一狭窄的次缢痕；位置大约在离着丝粒1/3处，由于次缢痕的存在，往往导致长臂的长度发生变异。2号较1号小，为亚中央着丝粒染色体，长臂和短臂易区分开。3号是第二大的中央着丝粒染色体。是A组中最小的l个。这个染色体大约比第1号染色体短1/31/4。,男,女,B组：,包括二对染色体，即4和5号。 这是二对最大的而又特别明确的亚中央着丝粒染色体。这两对染色体的短臂相对较短，故易于与
7、A组、C组相临号序的染色体相互区分。在非显带标本上，4号、5号不易区分。,男,女,C组：包括七对常染色体，即612号，X性染色体也列入此组。中等大小，具亚中着丝粒染色体。该组染色体数目多，它们的大小相差不大，在常规标本中是最难将它们一一识别的。一般说，6、7、8、11号和X染色体的着丝粒略靠近中央，短臂相对较长，而9、10、12号染色体的着丝粒偏离中央，既短臂相对较短。第9号染色体的长臂上常有一较大而明显的次缢痕，从着丝点处延伸到长臂的中部。有时第11号染色体的长臂也会发现有次缢痕，位置在长臂的14l3处，第12号是C组中最小的一对，但不易与组内其它4对较短的相互区别。X染色体的大小在第7、8
8、号之间。,女,男,.D组：,包括三对染色体，即13、14、15号，是一组大的近端着丝点染色体。常规标本不易将三对染色体加以区分，本组染色体的短臂上均具有随体，但不一定同时显现。随体的大小存在着个体差异。,男,女,女,男,.E组：,女,男,F组：,女,男,G组：,六.实验结果分析,我们组能观察到的染色体数目与正常值相同，但是染色体不是特别清楚，但总体来说符合正常人体染色体的形态特征。,（1）染色体不是很清晰的原因：,渗透，染色效果不好， 张相机的像素不清晰,（2）镜检分析：,现象： 染色体视野较少难找 （1） 由于不仅是细胞的分裂相少， （2） 而且整体的细胞数就少，原因 可能是由于在先倒培养基
9、时没有先吹打后在倒， 可能有一部分贴在培养瓶上，导致细胞损失。,（3）分裂相少：,离心速度不合适： 如果从培养瓶收集细胞后进行离心时的速度太低，细胞可能被丢失；如果细胞被低渗后离心速度过高，往往使分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相丢失，以致制出的标本分裂相较少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。,标本固定不充分： 如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。,六.实验总结,通过本次试验，我们成功地对人类染色体组型进行了分析。虽然结果还算理想，但在实验过程中我们也存在很多的纰漏。比如在试剂配制的失误、操作行为不恰当等使得我们组的实验难以持续。所以在做实验时要有严谨性，操作要得当。与此同时，在做实验时也更应该加强团队合作的意识。,
