口腔细胞培养及其应用.ppt

1、（本章所附照片除特别标注外均来自首医口腔基因治疗与牙再生分子生物学实验室）,第六章 口腔细胞培养及其应用,提要：本章介绍细胞培养的基本原理及基本方法；牙齿相关细胞、唾液腺细胞、口腔黏膜细胞、颌骨相关硬组织细胞、口腔肿瘤细胞的培养及特点；组织工程的基本原理、口腔组织特有的干细胞、再生医学技术在口腔医学中的应用；基因芯片、蛋白芯片、组织芯片，蛋白质组学、生物信息学、模式生物学、系统生物学等。重点掌握细胞培养基本原理及方法，口腔医学中相关细胞培养及其特点，了解口腔干细胞培养在口腔再生医学中的应用及口腔生物学其他研究方法。,第一节 细胞培养,一、细胞培养的基本原理,第一节 细胞培养的基本原理,细胞培养

2、的基本概念,细胞培养： 模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，并维持其结构功能原代培养： 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中,第一节 细胞培养的基本原理,体外细胞生物学,形态特点贴壁型细胞悬浮型细胞生长增殖过程培养细胞生命期培养细胞一代生存期,第一节 细胞培养的基本原理,贴壁型细胞,必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型：上皮型成纤维型游走型多形型,第一节 细胞培养的基本原理,悬浮型细胞,

3、于悬浮状态下即可生长不需要贴附于支持物表面多见于血液淋巴细胞,第一节 细胞培养的基本原理,几种常见细胞的形态,原代培养神经元细胞 （10）,原代培养星形细胞 （10）,神经细胞瘤细胞系 （10）N20Y,结肠癌细胞系（10）Caco-2,第一节 细胞培养的基本原理,培养细胞生命期,所谓培养细胞生命期，指细胞在培养中持续增殖和生长的时间 细胞全部生存过程大致分为以下三个阶段：原代培养期传代期 衰退期,第一节 细胞培养的基本原理,原代培养期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周 传代期：初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长衰退期：此

4、期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡,第一节 细胞培养的基本原理,细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，成为无限细胞系无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。可能恶性变细胞永生性和恶性性非同一性状,第一节 细胞培养的基本原理,第一节 细胞培养的基本原理,培养细胞一代生存期,所谓细胞“一代”，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，细胞传代后，一般要经过以下三个阶段: 潜伏期（游离期，贴壁期） 对数生长期 停滞期（平台期）,第一节 细胞培养的基本原理,培养细胞一代生存期,第一节 细胞培养的基本原理,细胞生长过程

5、中的重要现象,接触抑制：由于细胞的相互接触而抑制细胞运动密度抑制：细胞因营养的枯竭和代谢物的影响而停止生长,第一节 细胞培养的基本原理,培养细胞的体外生长环境,无污染环境基质气体环境和氢离子浓度液相环境温度渗透压,第一节 细胞培养的基本原理,无污染环境：高压蒸汽消毒器电热干燥箱滤器超净工作台紫外灯,第一节 细胞培养的基本原理,基质：玻璃基质塑料饲养细胞，又称滋养细胞生物性基质处理培养表面金属,第一节 细胞培养的基本原理,气体环境和氢离子浓度 ：5%二氧化碳 95%空气 pH为7.27.4,第一节 细胞培养的基本原理,液相环境：水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐液 ：Hanks液、PBS、Ea

6、rle液等天然培养基 合成培养基 无血清培养基,第一节 细胞培养的基本原理,温度维持 ：（36.50.5） 渗透压 ：290320 mOsm/kg,第一节 细胞培养的基本原理,细胞培养常见仪器,超净工作台,细胞培养箱,倒置相差显微镜,第一节 细胞培养的基本原理,二、细胞培养的基本方法,第一节 细胞培养的基本原理,无菌操作中的注意事项,对实验中可能用到的器具及培养用液进行严格消毒灭菌 培养室的消毒 ：培养室和超净台要用紫外灯和酒精严格消毒进入无菌室前要按照外科手术无菌要求进行洗手与着装 培养过程中要注意无菌操作 ：时刻铭记无菌物品与有菌物品要分开处理,第一节 细胞培养的基本原理,A,B,A 超净

7、工作台中的实验用品要摆放整齐B 实验前75%酒精喷洗双手,无菌操作技术,第一节 细胞培养的基本原理,C D 开启封闭瓶口等操作应在火焰就近的地方，并轻轻灼烧,C,D,第一节 细胞培养的基本原理,E,F,E F移液操作,第一节 细胞培养的基本原理,基本培养操作技术,培养细胞的取材与分离 体外培养细胞的纯化 细胞的冻存与复苏,第一节 细胞培养的基本原理,培养细胞的取材与分离 取材部位准确 严格无菌操作 尽快培养 减小损伤 制备标本,第一节 细胞培养的基本原理,体外细胞的纯化人工纯化：酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、培养基限定法、流式细胞仪分离法 等自然纯化,第一节 细胞培养的基本原理,细

8、胞冻存要点：冷冻过程要缓慢冻存细胞必须处在对数生长期细胞复苏要点：快速解冻解冻后的细胞应离心去除冷冻保护剂后再接种到培养基中,第一节 细胞培养的基本原理,细胞培养的污染、检测与控制,微生物污染：细菌，真菌，支原体等污染化学污染：指影响细胞生存的非细胞所需物质混入培养物中 ，应在操作中防止 细胞交叉污染：指目的细胞中混入其他种细胞 ，预防方法主要是严格按照规定操作，做好标记，避免发生混乱,第一节 细胞培养的基本原理,微生物污染：污染的途径：空气 、器材 、操作 、试剂 、组织标本 微生物污染的检测 微生物污染的控制：抗生素除菌法；加温处理,第一节 细胞培养的基本原理,FL cell pollut

9、ed by Staphylococcus FL cell polluted by G+ Bacteria,首都医科大学 细胞生物学系 张海燕提供,第一节 细胞培养的基本原理,FL cell polluted by escherichia coli FL cell polluted by mold fungus,首都医科大学 细胞生物学系 张海燕提供,第一节 细胞培养的基本原理,细胞培养常用方法：组织块培养法酶消化法,第一节 细胞培养的基本原理,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,一、牙齿相关细胞,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,牙周膜细胞,培养方法：组织块法；酶消化法细胞形态特点免

10、疫组织化学染色体外培养细胞的生长增殖特点功能特点牙周膜细胞增殖分化的影响因素,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,细胞形态特点,原代 人牙周膜成纤维细胞（10）,第3代人牙周膜成纤维细胞（10）,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,免疫组织化学染色,波形丝蛋白染色阳性（10）,角蛋白染色阴性（10）,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,体外培养细胞特点：成功率高于牙髓细胞，达40%80%可在体外长时间存活达412个月可持续传40代以上,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,功能特点分泌功能矿化功能收缩功能再生功能根面吸附等,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,牙周膜细胞增殖分

11、化的影响因素生长因子胰岛素纤维黏连蛋白抗坏血酸羟基磷灰石,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,牙髓细胞,培养方法：酶消化法；组织块培养法细胞形态特点：成纤维细胞型（与牙周膜细胞类似）免疫组织化学染色：波形丝蛋白（+）；角蛋白（-）体外培养细胞的生长增殖特点功能特点,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,生长增殖特点生长增殖较快可传代至第1520代长时间体外培养可呈复层生长,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,功能特点碱性磷酸酶活性矿化现象对钙调节因子的反应对细胞因子的反应对氢氧化钙、羟基磷灰石盖髓剂的反应,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,二、唾液腺细胞,第二节 口腔医学中相关

12、细胞培养及其特点,唾液腺细胞,形态特点免疫组织化学特点功能特点唾液腺细胞的增殖与分化调节唾液腺细胞增殖、分化和功能的因素,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,细胞形态特点腺泡上皮细胞：体外培养的腺泡细胞多呈“铺路石”样排列导管上皮细胞：导管上皮细胞呈多边形肌上皮细胞： 肌上皮细胞呈梭形或星形,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,导管上皮细胞（HSG 细胞系）,HSG细胞系（4）,HSG细胞系（10）,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,A 小型猪腮腺上皮细胞原代培养（10）B 小型猪腮腺上皮细胞alpha淀粉酶免疫组化染色（10）,腺泡细胞上皮细胞,第二节 口腔医学中相关细胞培养及

13、其特点,免疫组织化学染色腺泡上皮细胞：角蛋白、淀粉酶、对氨基水杨酸、 导管上皮膜、前角蛋白、单克隆角蛋白、分泌成分阳性反应导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗体染色阳性反应肌上皮细胞：肌动蛋白、S-100蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反应,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,功能特点：分泌腺泡细胞：淀粉酶、PRP、唾液过氧化物酶、特异蛋白等腺泡上皮细胞：顶端分泌、基底及侧膜分泌导管细胞：胶原肌上皮细胞：胶原,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,唾液腺细胞的增殖分化基底潜能干细胞理论单细胞全能干细胞理论双细胞亚全能干细胞理论,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,调节唾液腺细胞增殖

14、、分化和功能的因素细胞因子激素细胞外基质 钙离子,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,三、口腔黏膜细胞,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,口腔黏膜细胞培养方法：组织块法和酶消化法形态特点：卵圆形、多边形，呈“铺路石”样单层排列免疫组织化学染色：波形丝蛋白阴性，角蛋白阳性功能：分泌大量的胶原蛋白与非胶原蛋白,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,兔口腔黏膜上皮细胞,A,B,A 无血清培养基培养条件下（10）B 滋养细胞层培养条件下（4）,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,四、颌骨相关的硬组织细胞,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,破骨细胞形态学特点：体积大，多核组织化学染

15、色：破骨细胞单克隆抗体呈阳性反应，与降钙素反应呈蓝紫色，与抗酒石酸磷酸酶反应呈棕褐色功能：骨吸收功能影响破骨细胞功能的因素： 促进破骨细胞功能：破骨细胞激活因子、甲状旁腺素等 抑制破故细胞功能：-干扰素、降钙素等,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,成骨细胞形态学特点：不同培养方法所获得的成骨细胞形态各有差异免疫组织化学染色特点：BGP、型胶原、碱性磷酸酶活性功能：成骨作用 调节破骨细胞骨吸收作用,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,软骨细胞形态学特点：多角形，可形成甲苯胺蓝染色阳性的物质免疫组织化学染色特点：GAG、型和型胶原功能：形成软骨或骨影响软骨细胞功能、分化的因素：激素、细胞

16、因子、机械张力和压力、体外培养环境,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,五、口腔肿瘤细胞,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,口腔鳞癌细胞细胞系来源：舌鳞状细胞癌标本原代及传代培养生物学特性： 多角形上皮样细胞 核/浆比例高，多核仁 高贴壁率，克隆形成率和软琼脂集落形成率,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,唾液腺肿瘤细胞人黏液表皮样癌MEC-1细胞系：低转移细胞株Mc1、Mc2高转移细胞株Mc3、M3SP4腺样囊腺癌ACC-2、ACC-3细胞系,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,成釉细胞瘤细胞细胞系来源：肿瘤组织原代及传代培养生物学特性：生长增殖缓慢，二倍体细胞型应用：目前

17、已获得永生细胞系AM-1及 hTERT(+)-AM细胞系,第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,组织工程的基本原理口腔组织特有的干细胞再生医学技术在口腔医学中的应用,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,组织工程的基本原理,种子细胞体外扩增，与生物材料按一定的比例混合，将细胞-材料复合物植入机体的组织或器官的病损部位，以达到修复创伤和重建功能的目的目前组织工程常用的支架材料是合成的可生物降解的高分子聚合物是聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸和聚乙醇酸复合物（PLGA）等,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,口腔组织特有的干细胞,牙髓干细

18、胞牙周膜干细胞脱落乳牙牙髓干细胞根尖牙乳头干细胞唾液腺干细胞,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,牙髓干细胞比BMSCS具有更强的增殖率、克隆形成率和倍增率可被诱导分化为脂肪细胞、神经样细胞Stroo-1和CD146等干细胞表面标记阳性体内诱导可形成类似牙本质-牙髓复合体样的结构,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,脱落乳牙牙髓干细胞比BMSSCs具有更强的增殖率、克隆形成率和倍增率Stroo-1和CD146等干细胞表面标记阳性可诱导分化为神经细胞、脂肪细胞和成牙本质细胞体外可形成钙化结节内体可在免疫缺陷小鼠皮下成骨和产生牙本质样物质,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,牙周膜干细

19、胞Stro-1和MUC18及腱特异性标记SCX表达阳性可被诱导分化为牙髓母细胞、脂肪细胞、纤维母细胞、牙骨质细胞和成骨细胞体外可形成矿化结节，表达碱性磷酸酶或骨唾液蛋白体内试验牙周膜干细胞能产生沿牙周膜结缔组织方向走行的牙骨质样结构,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,根尖牙乳头干细胞比牙髓干细胞具有更高的增殖活性CD24是SCAP较特异的表面标志物在体外SCAP可横向分化为成牙本质细胞和脂肪细胞，并能产生比牙髓干细胞更多的牙髓-牙本质复合物,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,唾液腺干细胞 组织定位：导管上皮 停留在腺泡、间质中的前体细胞可诱导分化为表达肝细胞和胰腺内分泌细胞表型体外

20、培养后植入肝脏，可分泌白蛋白,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,再生医学技术在口腔医学中的应用,在颌面重建中的作用： 介导颌面部骨及软骨缺损修复在引导口腔组织再生中的作用：促进牙周组织重建组织工程化黏膜在口腔医学中的应用 组织工程用于人造唾液腺牙再生：组织工程方法-种子细胞+支架材料 发育生物学-模拟牙齿发育的过程,第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用,第四节 口腔生物学其他研究方法,口腔生物学其他研究方法,基因芯片、蛋白芯片 和组织芯片蛋白质组学生物信息学模式生物学系统生物学,第四节 口腔生物学其他研究方法,基因芯片技术,基因芯片技术，又称DNA微阵列技术，是将cDNA文库中已知和未

21、知的全长序列或寡核苷酸序列固定于玻片上，同时检测比较生物样品中多个已知或未知序列的表达状况基因芯片技术基本原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的基因芯片技术是高效地大规模获取相关生物信息的重要手段,第四节 口腔生物学其他研究方法,基因芯片技术的主要技术流程芯片的设计与制备靶基因的标记芯片杂交与杂交信号检测,第四节 口腔生物学其他研究方法,基因芯片技术的应用基因表达谱分析新基因发现基因突变及多态性分析基因组文库作图疾病诊断和预测药物筛选基因测序等,第四节 口腔生物学其他研究方法,基因芯片技术存在的问题设备昂贵，例如制造仪器，现代化的实验平台及激光共聚焦显微镜等，并且制造光刻掩膜需较高费用DNA芯片

22、上原位合成探针难免有错误核苷酸掺入及混入杂质，使整个杂交背景增高，降低特异性,第四节 口腔生物学其他研究方法,蛋白芯片技术,蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象，与在mRNA水平上的检测基因表达的基因芯片不同，它直接在蛋白水平上检测表达模式在基因表达研究中比基因芯片有着更加直接的应用前景,第四节 口腔生物学其他研究方法,蛋白芯片技术主要技术流程,第四节 口腔生物学其他研究方法,蛋白芯片技术的应用研究疾病的发病机制，协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子探讨作用物与酶相互作用的机制的分析开发新药以及协助蛋白质组的研究,第四节 口腔生物学其他研究方法,存在的问题固定于载体上的蛋白质结构单一，无法反应蛋

23、白质结构的多样性固定于载体上的蛋白质的稳定性直接影响蛋白芯片的稳定性蛋白芯片造价比较昂贵影响结果特异性的因素较多,第四节 口腔生物学其他研究方法,组织芯片技术,组织芯片技术是近年来基因芯片技术的发展和延伸它可以将大量临床组织标本排列在一张载体进行分析研究可以最大限度地利用组织资源所需样品少，是一种高通量、多样本的分析工具,第四节 口腔生物学其他研究方法,应用协助人类基因组学的研究疾病相关基因的验证新药物的开发与筛选治疗过程的追踪和预后等方面的研究,第四节 口腔生物学其他研究方法,蛋白质组学,蛋白质组学的研究对象是特定的时间和特定的空一个完整的生物体（或细胞）所表达的全体蛋白质的特征包括蛋白质的

24、表达水平，翻译后的修饰，蛋白质与蛋白质相互作用等在蛋白质水平上获得对于有关生物体生理、病理等过程的全面认识,第四节 口腔生物学其他研究方法,蛋白质组学的研究内容蛋白质鉴定翻译后修饰蛋白质功能确定服务于人类的健康,第四节 口腔生物学其他研究方法,蛋白质组学研究内容及方法,第四节 口腔生物学其他研究方法,蛋白质组学研究方法组成性蛋白质组学研究（compositional proteomics） 采用高通量的蛋白质组研究技术分析尽可能多乃至接近所有的蛋白质比较蛋白质组学研究（comparative proteomics） 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理/病理体系或过程的研究,第四节

25、 口腔生物学其他研究方法,蛋白质组研究中主要应用的技术：双相电泳（2-DE）新型质谱（MS）技术数据库设置与检索系统等,第四节 口腔生物学其他研究方法,生物信息学,生物信息学是对实验生物学资料进行的再加工整理，同时又通过检索等手段对进一步的生物学实验进行理论预测与指导的一门科学,第四节 口腔生物学其他研究方法,研究内容收集生物信息数据，建立生物信息学数据库根据生物学知识与统计学知识建立算法理论通过生物信息学的门户网站和检索与搜索工具有效促进与指导生物信息资源的共享与利用,第四节 口腔生物学其他研究方法,模式生物学,揭示基因功能的最有效方法之一是定向改变生物的某个基因从而观察其引起的表型，模式生

26、物学就是通过研究模式生物从而获得人类遗传生命奥秘的一门科学小鼠、果蝇、线虫是最常见最有效的实行大规模基因操作的模式生物,第四节 口腔生物学其他研究方法,模式生物的遗传学价值可以在条件严格控制的环境下进行遗传确定的种系间杂交可以收集大量样本进行研究能够产生转基因和利用基因定向突变而达到基因敲除的动物,第四节 口腔生物学其他研究方法,系统生物学,系统生物学（systems biology）是在细胞、组织、器官和生物体整体水平研究结构和功能各异的各种分子及其相互作用，并通过计算生物学来定量描述和预测生物功能、表型和行为的一门科学系统生物学将在基因组序列的基础上完成由生命密码到生命过程的研究，这是一个逐步整合的过程，由生物体内各种分子的鉴别及其相互作用的研究到途径、网络、模块，最终完成整个生命活动的路线图,第四节 口腔生物学其他研究方法,系统生物学的主要技术平台为基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、相互作用组学和表型组学等即分别在DNA、mRNA、蛋白质和代谢产物水平检测和鉴别各种分子并研究其功能,第四节 口腔生物学其他研究方法,