1、大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定作者：李显澎 樊粤光 刘建仁 范海蛟 江晓兵 孙志刚 曾建春 阳建权 【摘要】 【目的】研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力。 【方法】取 SPF 级 SD 大鼠 6 只，采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞，取传至第 3 代的 MSCs 进行细胞形态和免疫组化鉴定；应用含地塞米松、-甘油磷酸钠和维生素C 的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶（ALP）的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定。 【结果】全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓 MSCs，MSCs 在含体积分数为 10% 胎牛血
2、清的低糖 DMEM（L-DMEM）培养液中生长性状相对稳定，增殖速度快；诱导条件下，细胞 ALP 活性明显增高，并出现了矿化结节。 【结论】建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓 MSCs 的方法，成骨能力肯定，为中药蛋白质组学研究提供材料基础。 【关键词】 骨髓间充质干细胞/病理学； 细胞培养，体外的； 组织工程 骨髓间充质干细胞（MSCs）在体内外诱导因子的作用下，可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞和星形胶质细胞转化，具有很大的可塑性1 ，这使其在组织工程、细胞治疗等方面成为研究的热点2 。为更好地将 MSCs 应用于骨质疏松症、骨坏死、骨缺损，本实验通过体外细胞培养
3、的方法将 MSCs 从骨髓中分离纯化，观察MSCs 在体外的扩增、鉴定，并诱导其定向成骨分化。现报道如下。 1 材料与方法 1.1 动物 SD 大鼠 6 只，SPF 级，体质量 140160 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为：0025033。 1.2 主要试剂与仪器 低糖 DMEM （L-DMEM ，美国 Gibco 公司，GNM31600） ；兔抗大鼠 CD34（BA0532） 、CD44（BA0321） 、CD54（BA0541）（武汉博士德公司） ；高糖 DMEM（Hyclone，SH30022.01B） ；胎牛血清（Hyclone，SV30087.01） ；胰蛋白酶（H
4、yclone，SV30042.01） ；-甘油磷酸钠（美国 Simga 公司） ；地塞米松（美国 Sigma 公司） ；D-hanks（美国 Simga 公司） ；维生素 C（美国 Sigma 公司） ；生物素化抗生蛋白链菌素复合物（streptavidin biotin complex，SABC） （SA1022）试剂盒（武汉博士德公司） ；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB） （AR1022）（武汉博士德公司） ；其他试剂均为国产分析纯。 C02 恒温培养箱（Sheldon Manufactruing.Inc,model No: 2323-2 shellab，USA）
5、；3k-15 低温离心机（美国 Sigma） ；DL-CJ-IF 超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司） ，MPS 60 倒置显微镜（Leika DMIRB） ；超纯水系统（MILLPORE,SAS 67120MOISHEMA,France） 1.3 培养液配制 完全培养液：低糖 DMEM（含体积分数为 10胎牛血清，10 g/L 青霉素、链霉素） ；诱导分化培养液：高糖 DMEM（含体积分数 10胎牛血清，10 g/L 青霉素、链霉素）中加入 -甘油磷酸钠、地塞米松、维生素 C，终浓度分别为 10 mmolL、10-8 molL、50 mol/L。 1 .4 骨髓间充质干细胞的分离 3-
6、4 取健康成年 SD 大鼠（150 g 左右） ，1 g/L 新洁尔灭浸泡 30 min 后，断颈处死，碘伏消毒，体积分数为 75%的酒精消毒，铺无菌单盖住上身；无菌条件下取双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用 L-DMEM 浸泡清洗;用弯钳将两端骨骺切除，显露骨髓腔。用 10 mL 注射器吸取 L-DMEM 培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓；轻轻吹打，制成单细胞悬液；1 000 r/min 离心 20 min，离心后去上清，用完全培养液重悬，入培养瓶中，用完全培养液培养。 1.5 骨髓基质干细胞的原代和传代培养 将上述所得细胞悬液接种于 25 mL 塑料培养瓶中，置 37 、体积分数 5%
7、CO2 饱和湿度条件下培养。于培养后的第 3 天更换培养液以更新细胞代谢环境。以后每 3 d 换液 1次，去除未贴壁的细胞，待细胞汇合约 80时，用 2.5 g/L 胰蛋白酶+0.4 g/L 乙二胺四乙酸（EDTA）消化，按 1：2 传代培养。 1.6 大鼠骨髓 MSCs 的生长曲线测定 取生长良好的第 2、3 代细胞（P2、P3） ，2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1104mL 接种于 24 孔板，每天各取 3 孔消化计数，每孔计数 3 次，连续 7 d。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，描绘生长曲线（图 1） 。 图 1 大鼠骨髓 MSCs 生长曲线（略） Figure 1 Growth
8、curve of rat MSCs 1.7 骨髓间充质干细胞的鉴定5 （1）细胞形态：细胞呈梭形，边缘清晰整齐，贴壁生长，呈成纤维细胞形态生长，呈旋涡形（图 2） 。（2）免疫组化：P3 培养 3 d 后，去培养液，用 40 g/L 多聚甲醛固定；于体积分数 3%的双氧水中室温下放置 10 min；磷酸盐缓冲液（PBS）洗 2 min，共 3 次；滴加正常山羊血清，室温 10 min，除去多余液体，滴加多克隆兔抗大鼠 CD34、CD44、CD54，4过夜；0.01 mol/L PBS 洗 5 min， 共 3 次，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，37作用 20 min，0.01 mol/L PB
9、S 洗 5 min 共 3 次；滴加 SABC，37作用 20 min，0.01 mol/L PBS洗 5 min，共 4 次；DAB 显色，取 1 mL 双蒸水，加试剂盒 A、B、C 试剂各 1 滴，混和后加到切片，室温显色，镜下控制反应时间。双蒸水洗涤，苏木素复染 2 min，时间按所需要的着色强度而定，双蒸水洗涤 3 次，每次 2 min；放入烘箱 40烘干脱水，用树胶封片，干燥后观察。 1.8 骨髓间充质干细胞的诱导分化6 培养第 5 代 MSCs 以1105 个mL 的密度接种于 6 孔培养板（内铺有预处理的盖玻片） ，加完全培养液，48 h 后观察细胞融合 80%后，吸去完全培养液
10、。实验组加入诱导分化培养液，对照组加入等量完全培养液，每 3 d 换液 1 次。 1.9 成骨细胞鉴定7 1.9.1 钙钴法测定碱性磷酸酶（ALP）活性 将细胞接种于预先放有盖玻片的 6 孔板内，于第 5 天时吸取出培养液，用 PBS 冲洗 3 次，每次 1 min；中性福尔马林室温固定 10 min 后蒸馏水冲洗 3 次；加入新鲜的孵育液 37孵育 6 h，蒸馏水冲洗 3 次；20 g/L 硝酸钴水（现配现用）溶液浸泡 5 min，蒸馏水冲洗 3 次；10 g/L 硫化铵水溶液作用 5 min，水洗，中性树胶固定，标记，镜下观察。 1.9.2 矿化结节染色 诱导 10 d 后吸取出培养液，P
11、BS 清洗 3 次，体积分数 95%的乙醇固定 30 min，PBS 清洗 3 次，1 g/L 茜素红染色，双蒸水冲洗 3 遍，中性树胶固定，标记，镜下观察。 2 结果与分析 2.1 细胞的原代培养 培养的原代细胞接种 72 h 后，出现较多贴壁细胞，经冲洗和换液，去除悬浮细胞，贴壁细胞继续培养。4 d 后细胞开始增殖，生长良好，贴壁较均匀，倒置显微镜观察活体细胞形态：MSCs 呈纤维状，梭形，有突起；约 7 d 时，细胞汇合成片，其融合率可达到 80（图 2） 。 2.2 细胞的传代培养 将原代培养的细胞用胰蛋白酶消化并吹打制成单细胞悬液，传代培养。传至第 5 代，细胞密集重叠生长，梭形，呈
12、旋涡状。传代的 MSCs 生长快慢与接种密度关系密切（图 3） 。实验发现骨髓 MSCs 的生长性状基本稳定， 二代细胞的形态、生长曲线无显著性差异，细胞为均一的成纤维细胞样，潜伏适应期在第 12 天（约 24 h） ，对数生长期为第 35 天 （约 72 h） ，以后进入平台期，在对数生长期，群体倍增时间 34 h，传代周期约 6 d，每传代 1 次细胞增加约 2.2 倍，有学者统计单个 MSC 经 20 次扩增，细胞数可达 81 051.5106 个，说明 MSCs 适应能力强，增殖速度快，体外扩增容易，有巨大的扩增潜能。另外，从理论上讲，在体外设法诱导或用外源目的基因导入等技术，可使细胞
13、进行对称性有丝分裂，从而无限扩增而不分化。因此，MSCs 可作为组织工程的种子细胞及细胞治疗和基因治疗的载体，用于疾病和损伤的治疗。 P3 培养 5 d 后，进行细胞免疫组化检测。CD29、CD44、CD54、CD73、CD105、CD166 表达阳性 ,而CD14、CD34、CD45 表达阴性 ,我们选用 CD44、CD34、CD54 进行鉴定。图4 结果显示在 MSCs 膜上呈深红色，不透光为 MSCs 特性：CD44（+） 、CD54（+） ，不表达为造血干细胞的特性：CD34（-） 。 2.3 细胞 ALP 活性测定 经诱导后的细胞，碱性磷酸酶染色明显，胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块
14、状沉淀，ALP 活性部位呈棕黑色（图5） 。 2.4 细胞矿化作用检测 连续培养 10 d 后，细胞呈复层生长，茜素红染色可见红色的矿化结节颗粒，颗粒大小不均一，提示有矿化基质沉积（图 6） 。 图 2 原代培养第 7 天时形成的 MSCs 集落（50） （略） Figure 2 Feature of MSCs after primary culturing for 7 days 图 3 MSCs 第 5 代呈旋涡状（100） （略） Figure 3 Features of MSCs after subculture for 5 generationsa.CD34（-）b.CD44（+）c.
15、CD54（+） 图 4 MSCs 免疫组化鉴定结果（50） （略） Figure 4 MSCs feature detected by immunohistochemical method 图 5 成骨诱导后第 5 天（碱性磷酸酶染色，100） （略） Figure 5 Osteoblastic identification after induction for 5 days 图 6 成骨诱导后第 10 天（茜素红染色，50） （略） Figure 6 Osteoblastic identification after induction for 10 days 3 讨论 MSCs 在骨髓中
16、的丰度不高，约占有核细胞的 0.001 0.01 ，因此进行分离纯化和体外繁殖培养就显得尤为重要。研究表明4 ，骨髓液中的造血干细胞与基质细胞互相影响，相互作用，维持细胞生长。为此，我们采用了全骨髓结合贴壁法。早期，培养成分中骨髓造血干细胞对 BMSCs 的生长有利；待 BMSCs 贴壁、生长繁殖后，造血干细胞可被清除。因此，省略前期的细胞分离对骨髓 MSCs 的生长影响不大。 许多研究表明6-8 ，地塞米松、-甘油磷酸钠和维生素 C 是 MSCs向成骨细胞分化和体外成骨的必要条件。地塞米松可促进成骨细胞分化成熟，同时提高 ALP 的活性，调节成骨细胞分泌胰岛素样生长因子（insulin-li
17、ke growth factors，IGFs） ，促进细胞外基质胶原合成。维生素 C 能促进培养细胞合成胶原，形成钙化，并能调节 ATP、ALP 活性和非胶原基质蛋白的合成。-甘油磷酸钠能为成骨细胞提供磷酸离子，促进生理性钙盐的沉积和钙化，是 MSCs 发生矿化结节的必要条件。ALP是成骨细胞的功能性酶，在钙盐沉积中起关键性作用；ALP 能够水解有机磷酸酶，使局部磷酸根浓度增高，而且可以破坏钙化抑制剂，从而启动钙化。因此 ALP 活性的提高是 MSCs 向成骨细胞分化的重要标志。因而人们常用细胞中该酶的活性高低来检测成骨细胞的存在和成骨细胞的分化成熟程度。诱导分化的 MSCs 随培养时间的延长
18、，ALP 活性逐渐增高，大量成骨细胞形成。随着 ALP 活性的提高，钙盐沉积在胶原纤维上，形成钙化结节。 种子细胞的选择与培养是骨组织工程中的基本环节，目前可作为种子细胞的来源主要有：骨、骨髓、骨膜和骨组织中的干细胞。MSCs 有取材方便、安全，对供体损伤小，易于分离培养，体外增殖能力强等优点，在一定条件下，可以定向诱导分化为成骨细胞9 。本实验室正准备筛选出一批对促进 MSCs 和其成骨分化的补肾中药复方，拟建立用于防治骨质疏松症、骨坏死、骨缺损中药的蛋白质组学技术平台，利用此平台可将中药复方的多组分、多靶点、多途径作用特点与蛋白表达关联起来，比较不同治则中药复方的各自不同的蛋白表达靶点和对
19、促进 MSCs 以及其成骨分化能力的影响；根据表达水平差异，阐明补肾中药复方的分子作用机制。 【参考文献】 1 Ringe J，Kaps C，Schmitt B，et a1Porcine mesenchymal stem cells Induction of distinct mesenchymal cell lineagesJ Cell Tissue Res，2002，307 （3）：321. 2 Van damme A ，Vanden D esscbe T，Collen D，et a1Bone marrow stromal cells as targets for gene therapy
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