1、 在血管内皮细胞凋亡中的作用作者：李向东，鲁开化，郭树忠，高政慧 【关键词】 肿瘤坏死因子 关键词: 肿瘤坏死因子;脱噬作用;皮肤/损伤;内皮，血管 摘 要:目的 探讨 TNF 引起的血管内皮细胞（VEC）凋亡在皮肤撕脱伤早期血栓形成中的作用. 方法 分 2组，实验组:内皮细胞（EC）+TNF ，拮抗组:用 EC+TNF +TNF 抗体处理.采用流式细胞仪分别测定实验组 TNF 不同时间、不同浓度以及拮抗组 EC凋亡率. 结果 EC凋亡率随 TNF 作用时间增加，048h EC凋亡率为（2.60.42）%（40.58.3）%;EC 凋亡率也随 TNF 浓度而增加，03000u mL-1 EC凋
2、亡率分别为（2.60.42）%（13.72.6）%;TNF 抗体明显拮抗TNF 诱导的 EC凋亡（P0.01）. 结论 TNF 可引起 EC的凋亡和死亡，具有时间依赖性和浓度依赖性，人重组 TNF 单抗可消除因TNF 引起的毒性作用. Keywords:tumor necrosis factor;apoptosis;skin/injuries;endothelium，vascular Abstract:AIM To study the effect of TNF on apoptosis of vascular endothelial cells（VEC）in early second thr
3、ombosis after skin avulsion.METHODS It was divided into experi-mental group（EC+TNF ）and inhibitory group（ rhTNF Ab pretreatment of EC+TNF ）.According to various times and concentration，apoptosis rate of vascular endothelial cells was measured by FCM for experimental group and inhibitory group.RESULT
4、S TNF caused massive death of endothelial cells in primary culture in a concentration-and time-dependent manner.Apoptosis rate of EC was（2.60.42）%（40.58.3）%from0to48h and（2.60.42）%（13.72.6）%from0to3000u mL-1 in experimental group，and it de-creased significantly in inhibitory group.CONCLUSION TNF cau
5、ses apoptosis of EC in a concentration-and time-de-pendent manner and rhTNF monoclonal antibody can de-crease cytotoxic for EC caused by TNF . 0 引言 血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC）是机体调节心血管系统的内分泌器官.在创伤、动脉粥样硬化等疾病中，氧自由基、炎性介质、Ca2+ 超负荷等因素可引起损伤 EC，内皮细胞（endothelial cells，出现 EC）功能障碍1-3 .EC损伤除以“坏死”形式出现
6、外，还可发生“凋亡” ，即一种细胞自主的有序性死亡.在皮肤撕脱伤撕脱皮瓣中，血液和组织 TNF 明显升高2 ，VEC 的坏死除直接皮肤挤压撕脱因素外，是否存在着 TNF 的升高引起 VEC的凋亡不得而知.我们通过探讨 TNF 在 VEC凋亡中的作用，了解皮肤撕脱伤早期血栓形成所致的组织坏死机制. 1 材料和方法 1.1 材料 型胶原酶系 Sigma产品，DMEM 系 Hyclone产品，TNF 和 TNF 系 Promega产品;内皮细胞系获自娩出 30min人胎盘脐静脉. 1.2 方法 HUVEC 培养用 0.5g L-1 胶原酶从脐静脉中消化、分离 EC，含 200ml L-1 胎牛血清的
7、 DMEM培养，将培养的 EC第 2或 3代以 210 4 个细胞/cm2 接种到 25mL培养瓶，直至融合2 .分为 2组，实验组:EC+TNF （n=3） ，拮抗组 :预处理的 EC+TNF +TNF 抗体（n=3）.分别测定 TNF 浓度为 3000u mL-1 条件下 37，50mL L-1 CO2 培养箱孵育，时间为 0，8，24 及 48h实验组 EC的凋亡率;TNF 浓度分别为 0，50，200及 3000ku L-1 条件下孵育时间为 8h实验组 EC的凋亡率;以及拮抗组8h，3000ku L-1 条件下 EC凋亡率.人重组 TNF 抗体被稀释1/100（15mg L-1 ）
8、，预处理的方法:EC 与 TNF 抗体在 TNF 加入前37孵育 1h. 用细胞刮子将培养的 EC从培养瓶中刮出（避免用胰酶消化损伤细胞膜） ，在室温条件下离心（500r min-1 ，5min） ，弃上清液.向各离心管内加入结合缓冲液 490L，混匀，将 EC数量配制成 5105 110 6 个.先加入碘化丙啶（PI）10L，后加入结合素 V（Annexin V）5L 进行活细胞荧光双标记（Gibco 公司产品） ，孵育 20min.样品加入流式细胞仪（FCM）的样品室，计数 10000个细胞，测定其凋亡率.以上操作均在04进行. 2 结果 2.1 TNF 作用不同时间 EC凋亡率 EC凋亡
9、率随 TNF 作用时间增加，0，8，24 和 48h EC凋亡率为（2.60.42）%， （13.72.6）%， （16.72.1）%和（40.58.3）%，8h 出现低平凋亡峰，24 和 48h凋亡峰明显，各时相与 0时相差非常显著（P0.01，Fig1，2）. 2.2 不同浓度 TNF 作用下 EC的凋亡率 EC凋亡率也随 TNF 浓度增加而提高，0，50，200 和 3000 u mL-1 时 EC凋亡率分别为（2.60.42）%， （8.71.3）%， （17.12.8）%和（13.72.6）%，200 和 3000u mL -1 时凋亡率明显，各时相与 0时相差非常显著（P0.01，
10、Fig3，4）. 2.3 拮抗组 EC的凋亡率 对照组 10000个细胞，凋亡率为（13.72.6）%，而拮抗组为（5.11.0）%，两者相差非常显著（P0.01，Fig5）. 3 讨论 结合素 V（annexinV）是一种钙依赖性磷酸脂蛋 白，与磷酸酰丝氨酸具有较强的结合力.在细胞凋亡的早期，虽然细胞膜完整，但膜上的磷酸脂分布破坏，磷酸酰丝氨酸暴露于细胞的表面，因此 annexinV在细胞形态学改变和 DNA水解前与凋亡细胞可以结合1-2 ，是检测凋亡细胞的有效方法.PI 为核酸嵌入型染料，可嵌入双螺旋体多核苷酸结构使DNA和 RNA着色，它能透过死细胞膜，而不能穿过活细胞膜，因此死细胞着色
11、，活细胞拒染.我们采用 annex-inV和 PI双染，annexinV 与荧光素结合，具有检测凋亡细胞和死亡细胞简单、迅速（10min 完成） ，不用冲洗和固定等优点. TNF 对敏感细胞的凋亡效应是通过与细胞膜上特异性受体（TNFR，主要是 TNFR1 ）结合后，触发细胞内信号转导，既可介导细胞凋亡4 和激活核转录因子 NF-kB5 ，或作用于跨膜受体后，引起鞘磷脂水解，产生细胞内神经酰胺，活化 PKC而作为细胞凋亡的胞内信号，诱导 VEC凋亡6 .诸多病理因素可以引起细胞凋亡，如:胚胎发生7 ，激素缺乏8 ，免疫系统紊乱9 ，自由基 10，11 等.过去的研究认为，TNF 只引起某些敏感
12、的细胞凋亡或死亡 12 ，但现在报道，TNF 可引起许多正常细胞的凋亡.Robaye 等13 在原代培养的猪主动脉 EC中加入人重组 TNF（2000u mL-1 ） ，孵育 4h，结果 9.4%VEC凋亡，DNA 碎片定量为 11%，而 8h凋亡的细胞数达到 22%，DNA 碎片定量为 20%，具有明显时间依赖性，同时应用失活的人重组 TNF或抗人重组 TNF抗体，能够阻止 TNF诱导的 VEC凋亡.TNF 对 EC有毒性作用，它促进 EC损伤和血液凝固.Li 等 14 在人冠状动脉内皮细胞也发现 TNF 能呈时间依赖性诱导其凋亡，且能加重缺氧和缺氧再灌注时内皮细胞的凋亡.我们的研究显示，T
13、NF 不仅可以引起人脐静脉EC的 DNA断裂和形态学改变，而且引起 EC的凋亡和死亡，它具有时间依赖性和浓度依赖性.人重组 TNF 可消除因 TNF 单抗引起的毒性作用. 此外，TNF 与 TNFR2结合也可活化 NF-KB，抑制细胞凋亡15 .至于为什么 TNF作用于人脐静脉 EC改其凋亡和死亡以及诱导其凋亡和死亡的分子机制尚需进一步研究. 参考文献: 1Vermes I，Haanen C，Steffens-Nakken H，SReutelingsperger C.A novel assay for apoptosis:Flow cytometric detection of phospha
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