1、藏药独一味两种方法提取组分对小鼠镇痛作用的影响作者：林天慕，顾宜，方坤泉，张三奇，蒋永培 【关键词】 独一味 【Abstract】 AIM: To explore an experimental method for the study of effective components in traditional Chinese medicine by chemical separation technology integrated with pharmacological experimentation. METHODS: Lamiophlomis rotata, a medicinal
2、plant in Tibet, was chosen in our study and different compounds were separated by two methods: extraction with solvent and gradient elution with macroporous adsorptive resin. Effective components of analgesic were screened by acetic acid writhing and hot plate test in mice. RESULTS: Samples separate
3、d by the two methods had obvious analgesic action on writhing reaction by acetic acid in mice and could prolong the latencies of paw licking to gradient elution with macroporous adsorptive resin. Nbutanol extract, petroleum ether extract and water extract were the main effective components of analge
4、sic in extraction with solvent. 300 mLL-1 ethanol, 900 mLL-1 ethanol elution parts and precipitate were the effective components of gradient elution with macroporous adsorptive resin. CONCLUSION: Experimentation on effective components of traditional Chinese medicine has been conducted and effective
5、 analgesic components are found in Lamiophlomis rotata (Benth.) kudo. 【Keywords】 Lamiophlomis rotata(Benth.)kudo ; extraction components; analgesia 【摘要】 目的： 中药化学提取分离技术与药理学试验方法相结合，构建中药有效成分研究的实验方法. 方法： 以独一味为代表药物，采用溶剂萃取法及大孔吸附树脂梯度洗脱分离法两种方法制备样品，通过小鼠醋酸扭体法及热板法筛选镇痛有效部位. 结果： 两种方法提取分离的样品对醋酸引起的小鼠扭体反应有明显的抑制作用；大
6、孔吸附树脂梯度洗脱法分离的样品能明显延长小鼠热板的痛阈时间. 萃取法中镇痛有效物质主要集中在正丁醇部分、石油醚部分、水部分；大孔吸附树脂梯度洗脱分离法中主要集中在 300 mLL-1乙醇洗脱部分、900 mLL-1乙醇洗脱部分和沉淀物部分. 结论： 初步建立了中药有效部位的研究方法，找到了独一味中镇痛有效部位. 【关键词】 独一味；提取组分；镇痛 0 引言 我国拥有极其丰富的中药资源，却难以走向世界，参与国际竞争. 关键缺乏现代技术手段来说明中药作用的物质基础及作用机制，缺乏严格的、明确的质量标准. 以往对中药的研究过于片面，或侧重于化学成分研究，或侧重于药效研究. 忽视了化学成分与药效之间的
7、相关性. 因此，我们拟建立中药有效成分研究的实验方法，通过化学分离方法将中药中所有化学组分分成几部分，并结合药效试验筛选出有效部位，并进一步阐明其作用机制. 独一味 Lamiophlomis rotata(Benth.)kudo是我国藏、蒙、纳西等民族民间常用草药之一， 中国药典2000 版一部收载独一味胶囊. 临床主要用于多种外科手术后的刀口疼痛、出血，外伤骨折，筋骨扭伤，风湿痹痛等症1. 独一味中已分得的化学成分主要有黄酮类、环烯醚萜类、三萜皂甙类等2-4. 已有报道独一味浸膏具有镇痛活性5 ，而对独一味镇痛有效部位的研究未见报道. 因此. 我们以独一味为代表药物，用不同提取分离方法对独一
8、味的化学成分进行了初步分离，通过药效试验初步确定了镇痛有效部位. 为进一步研究其镇痛有效单体及镇痛机制奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料独一味药材，采自四川藏区，经鉴定为唇形科独一味属植物独一味全草 Lamiophlomis rotata(Benth.)kudo；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、醋酸均为分析纯；酮洛芬（ketoprofen，浙江湖州市合成药厂，010901） ，吐温 80（上海申隆药业，990602） ；昆明种小鼠，体质量 1822 g，由第四军医大学实验动物中心提供（陕医动字第 08-13号） ；D101大孔树脂（购自西安蓝深公司） ；自动恒温小鼠热板法实验装置一套自制
9、,(550.2). 1.2 方法 1.2.1 溶剂萃取法分离样品称取独一味药材粗粉 200 g，加 950 mLL-1乙醇回流提取 3次，第一次 10倍量溶剂，回流 2 h，第二次和第三次 8倍量溶剂，回流 1.5 h. 合并提取液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得 100 mL浓缩液. 浓缩液加 1倍量水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取. 分别萃取 3次，每次 100 mL，合并萃取液，回收溶剂至干. 得样品石油醚部分 6.6 g（A） 、乙酸乙酯部分 1.2 g（B） 、正丁醇部分 8.5 g（C） 、萃取剩余部分为水部分 24.1 g（D）. 以 254 mL 20 mLL-1吐温
10、 80溶解，为母液备用. 1.2.2 大孔吸附树脂梯度洗脱法分离样品称取独一味药材粗粉 200 g，置渗漉器内，800 mLL-1乙醇浸泡过夜后开始收集渗漉液. 至流出液薄层层析（TLC）检测无斑点为止. 减压浓缩渗漉液，回收乙醇至无醇味，加 1倍量水混悬，静置过夜，析出油脂状沉淀物，减压抽滤，得油脂状沉淀物 5.8 g（E）. 滤液浓缩至 50 mL，经大孔吸附树脂柱，以蒸馏水、100， 300， 500， 700和 900 mLL-1乙醇水溶液梯度洗脱. 经 TLC检测，合并相似部分，得水洗脱部分 8.2 g（F） 、100 mLL-1与 300 mLL-1部分合并为 300 mLL-1乙
11、醇洗脱部分 15.6 g（G） 、其余部分合并为 900 mLL-1乙醇洗脱部分 6.7 g（H）. 以 1810 mL 20 mLL-1吐温 80溶解，母液备用. 1.2.3 醋酸扭体法取小白鼠 132只，随机分为 12组，每组 1012只，、各半，分别 ig 20 mLL-1吐温 80（20 gkg-1,阴性对照组） 、酮洛芬（5 mgkg-1，阳性对照组） 、样品 A（130 mgkg-1） 、样品 B（24 mgkg-1） 、样品 C（170 mgkg-1） 、样品 D（480 mgkg-1）及样品 E（16 mgkg-1） 、样品 F（22 mgkg-1） 、样品 G（42 mgkg
12、-1） 、样品 H（18 mgkg-1）. 给药后 1 h，各组小鼠分别腹腔注射 6 mLL-1醋酸溶液 10 mLkg-1,给醋酸后立即计时，记录小鼠开始扭体时间及 515 min 内扭体次数. 1.2.4 热板法选痛阈值在 530 s的雌性小白鼠 144只，随机分为 12组，每组 12只. 给药前测各鼠痛阈值两次，取均值，分别 ig 20 mLL-1吐温 80（20 gkg-1,阴性对照组） 、酮洛芬（20 mgkg-1，阳性对照组） 、样品 A(520 mgkg-1)、样品 B (96 mgkg-1)、样品 C(680 mgkg-1)、样品 D(1920 mgkg-1)及样品 E(64
13、mgkg-1)、样品 F(88 mgkg-1)、样品 G(168 mgkg-1)、样品 H(72 mgkg-1). 于 ig后 1, 2和 3 h分别测定各鼠痛阈值两次，取均值. 纪录结果. 统计方法：所有试验数据用 xs表示，采用统计软件 SPSS10.0进行方差分析及 Dunnett t检验，对于方差不齐的资料，应用非参数秩和检验进行组间比较. 2 结果 2.1 对醋酸引起的小鼠扭体反应的影响样品 A, B, C, D, E, F及 G, H结果见 Tab 1. 结果显示，两种方法分离的样品中，萃取法中石油醚萃取部分、正丁醇萃取部分、水部分；大孔吸附树脂分离法中沉淀物部分、水洗脱部分、30
14、0 mLL-1乙醇洗脱部分、900 mLL-1乙醇洗脱部分均可显著减少小鼠扭体次数（Tab 1）. 正丁醇萃取部分明显延迟小鼠扭体反应出现的时间（P0.05） ，其他各组分对扭体出现时间无影响. 表 1独一味溶剂萃取法和大孔树脂法分离样品对小鼠醋酸扭体反应的影响（略） Tab 1Analgesic effects of samples separated by extraction with solvent from Lamiophlomis and gradient elution with macroporous adsorptive resin on the writhing react
15、ion induced by acetic acid in mice(略) 2.2 对小鼠热板法痛阈的影响结果见 Tab 2. 结果显示，萃取法中水部分组药后 1, 2及 3 h，大孔吸附树脂分离法中沉淀物部分和 900 mLL-1乙醇部分药后 2 h, 3 h及 300 mLL-1乙醇部分药后 3 h均能明显提高小鼠痛阈值（Tab 2）. 萃取法中其他组分，以及大孔吸附树脂分离法中水洗脱部分 3 h内对小鼠痛阈值有提高，但无统计学意义. 表 2独一味溶剂萃取法和大孔树脂法分离样品对小鼠痛阈的影响（略） Tab 2Effects of samples separated by extracti
16、on with solvent and gradient elution with macroporous adsorptive resin from Lamiophlomis on the pain threshold in mice（略） 3 讨论 3.1 不同溶剂提取部位与药效的关系本试验对独一味醇提物水混悬后，用不同极性溶剂由小到大依次萃取，将提取物中所有组分按极性差别分为几个提取部分. 石油醚部分主要为脂溶性组分6 ；乙酸乙酯部分主要为环烯醚萜类2 ；正丁醇部分主要为黄酮类及甙类3,4 ；最后水部分主要含糖类. 对各样品作平行药效试验，结果显示，正丁醇萃取部分对由醋酸引起的小鼠扭体反
17、应有明显的抑制作用，并可明显延长扭体反应出现时间；但对热刺激引起的疼痛影响不大；石油醚萃取部分和水部分可减少小鼠扭体次数，且水部分组对热刺激引起疼痛在 3 h时痛阈值明显提高；而乙酸乙酯萃取部分对两种疼痛试验均无统计学意义. 从全部结果看，只有乙酸乙酯组分对两种疼痛均无效，且各组分仍有强弱差异，一方面因为各组分含有不同化学成分，导致药效不同；也可能萃取不完全，组分间含有相似化学成分，有量的差异而导致药效强弱. 另一方面，两种药理试验方法可能存在误差，特别是热板法，误差较大，由于动物数有限，不排除假阳性的可能. 3.2 两种提取方法的比较大孔吸附树脂在分离、提纯中药有效成分过程中的应用日益广泛，
18、具有选择性好、吸附容量大、吸附迅速、解吸容易等优点，适宜大规模的中药现代化生产. 本试验同时选取溶剂萃取法和大孔吸附树脂分离法分离样品，并对二者分离的样品通过 TLC鉴别发现，溶剂萃取法中石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分分别与大孔吸附树脂分离法中沉淀物部分、900 mLL-1乙醇洗脱部分、300 mLL-1乙醇洗脱部分、水洗脱部分组分相似. 药理试验结果表明，两种提取方法中各组分对小鼠扭体反应试验结果基本一致，但热板法试验结果有较大差异，具体原因有待于进一步研究，寻求较佳的大规模生产转换工艺. 3.3 建立中药有效部位筛选方法通过中药化学提取分离手段与药效试验的紧密结合，建立了镇痛
19、中药有效部位筛选方法，初步完成了独一味镇痛有效部位的筛选. 本方法快速、简便，结果可靠，下一步将对独一味镇痛有效部位中的化学单体和镇痛机制进行深入研究. 进而建立完整的中药有效部位筛选的实验方法. 【参考文献】 1 Zeng Y, Chen XJ, Chen ZY. Advances in studies on traditional Tibetan herb Lamiophlomis rotata J. Zhong Cao Yao (Chin Tradit Herbal Drugs), 2001;32(12):1141-1143. 2 Yi JH, Zhong CC, Luo ZY, Xia
20、o ZY. Studies on the chemical constituents from the roots of Lamiophlomis rotata(Benth.)kudo，a medicinal plant in Xizang (Tibet) J.Yaoxue Xuebao (Acta Pharm Sinica), 1991;26（1）：37-41. 3 Yi JH, Yan XZ, Luo ZY, Xiao ZY. Studies on the chemical constituents from the roots of Lamiophlomis rotata (Benth.
21、) kudo，a medicinal plant in Xizang(Tibet) J. Yaoxue Xuebao (Acta Pharm Sinica), 1995; 30（3）: 206-210. 4 Yi JH, Huang XP, Chen Y, Luo ZY, Zhong CC. Studies on the iridoid glucosides of the roots of Lamiophlomis rotata (Benth.) kudo, a medicinal plant in Xizang(Tibet) J. Yaoxue Xuebao (Acta Pharm Sini
22、ca), 1997;32（5）：357-360. 5 Liang ZD. Studies on Tibetan medicinal herb DuYiWei Lamiophlomis rotata(Benth.) kudo J. Lanzhou Yixueyuan Xuebao (J Lanzhou Med Col), 1987;40(2):47-50. 6 Yi JH, Zhong CC, Luo ZY, Xiao ZY. Studies on the chemical constituents from the roots of Lamiophlomis rotata (Benth.) kudo J. Zhong Cao Yao (Chin Tradit Herbal Drugs),1990；21（12）：2-5.
