1、大鼠中脑导水管周围灰质内 GABA 与阿片 受体共存能神经元的观察 【关键词】 GABA 关键词: GABA;受体，阿片样，;水管周灰质;显微镜检查，共焦;免疫组织化学;大鼠 摘 要:目的 观察中脑导水管周围灰质（PAG）内是否存在 -氨基丁酸（GABA）与阿片 受体（MOR）共存神经元. 方法 免疫荧光组织化学双重染色技术，染色结果在激光扫描共聚焦显微镜下观察. 结果 GABA 阳性神经元主要见于 PAG 中、尾段内侧区和腹外侧区，阳性神经元多散在分布并多为小型，中型者较少;散在分布的 MOR 阳性神经元主要见于 PAG 中、尾段的腹外侧区，多为中、小型神经元;散在并同时呈 GABA和 MO
2、R 双重染色阳性的中、小型神经元主要见于 PAG 中、尾段的腹外侧区. 结论 PAG 内有 GABA 与 MOR 共存的神经元，提示内源性阿片物质对PAG 内的 GABA 能神经元可能有调控作用. Keywords:GABA;receptors，opioid，mu;periaqueductal gray;microscopy，confocal;immunohis-tochemistry;rats Abstract:AIM To observe whether-aminobutyric acid（GABA）andopioid receptor（MOR）co-exist in neurons of
3、 the periaqueductal gray（PAG）in the rat.METHODS Im-munofluorescent histochemical double-staining technique was used.The staining results were observed with laser scanning confocal microscope.RESULTS GABA-immunoreactive（GABA-IR）neurons were mainly seen in the medial and ven-trolateral subregions at t
4、he middle and caudal levels of the PAG.Most of the sparsely distributed GABA-IR neurons were small-sized and the number of medium-sized GABA-IR neurons was small.Scattered MOR-IR neurons were mainly observed in the ventrolateral subregion at the middle and cau-dal levels of the PAG.Most of the MOR-I
5、R neurons were small-and medium-sized.Small-and medium-sized neurons simultaneously showing both GABA-IR and MOR-IR were scattered in the ventrolateral subregion at the middle and cau-dal levels of the PAG.CONCLUSION There are GABA and MOR co-existing neurons in the PAG.The present results suggest t
6、hat endogenous opioid-like substances might regu-late GABAergic neurons in the PAG. 0 引言 以往的研究证明，中脑导水管周围灰质（PAG）内 5-羟色胺（5-HT）能下行投射系统在调控伤害性信息向中枢的传入过程中发挥着重要作用，而 -氨基丁酸（GABA）对 5-HT 能神经元具有抑制性调控作用1-4 .有人曾报道激活中枢神经系统内的阿片 受体（opioid receptor，MOR）具有直接调节 GABA 能神经元活动的作用5 .激活MOR 后调节 GABA 能神经元活动的结果能使 PAG 的下行投射神经元摆脱
7、GABA 能神经元的抑制（disinhibition，脱抑制）并发挥镇痛作用6 .但PAG 内的 GABA 能抑制性神经元是否呈 MOR 阳性，尚缺乏直接的形态学证据.本研究用免疫荧光组织化学双重染色技术，在激光扫描共聚焦显微镜下对 PAG 内 GABA 与 MOR 共存的神经元进行了观察. 1 材料和方法 1.1 材料 成年雄性 SD 大鼠 8 只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量 200250g.戊巴比妥钠（4gL-1 ）经腹腔深麻下开胸，经左心室插管至升主动脉，先以 150mL 的 9gL-1 生理盐水冲洗，再用含 40gL-1 多聚甲醛和 2gL-1 苦味酸的0.1molL-1
8、磷酸缓冲液（PB，pH7.4）500mL 灌注固定，灌注完毕立即取脑，置于上述新鲜固定液后固定 46h，再移入含300gL-1 蔗糖的 PB 中至组织块沉底（4）.将中脑用恒冷箱作连续冠状切片，片厚 15m，切片隔 2 取 1，分 3 组收集.用0.01molL-1 的 PBS（pH7.4）充分清洗切片. 1.2 方法 按 ABC 方法对第 1 组切片进行免疫组织化学染色，具体步骤如下:入兔抗 GABA 血清（11000;Chemicon）与豚鼠抗 MOR 血清（11000;Ding 等7 ）混合液，室温孵育 1824h;入 Biotin 标记的驴抗兔 IgG（1250;Jackson） ，室
9、温孵育 3h;入 FITC 标记的Avidin（13000;Vec-tor）和 Texas Red 标记的驴抗兔IgG（1200;Jack-son） ，室温孵育 3h.上述抗体和复合物的稀释均用含3gL-1 的 Triton X-100 和 5gL-1 正常马血清的 PBS，各步骤之间均用 PBS 彻底清洗切片.裱片，避光干燥，甘油与PBS（11）混合液封片，激光扫描共聚焦显微镜观察并摄片.用正常兔血清和正常豚鼠血清的混合液代替兔抗 GABA 血清和豚鼠抗 MOR 血清孵育第 2 组切片，其余染色方法同第 1 组切片，进行替代对照实验，结果为阴性.将第 3 组切片用于 Nissl 染色，以便对
10、照观察和定位免疫组织化学染色的阳性结果. 2 结果 本研究按 Beitz 的方法将 PAG 划分为吻、中和尾三段，各段均划分为内侧区、背侧区、背外侧区和腹外侧区，内侧区包绕在导水管周围8 .GABA 的免疫荧光染色阳性产物位于细胞质，胞核内的阳性产物较少（Fig1ad）.GABA 阳性神经元散在分布于 PAG 全长的各区，但中、尾段内侧区和腹外侧区内的 GA-BA 阳性神经元的数量明显多于其它区域.GABA 阳性神经元多为小型，胞体呈三角形（Fig1a） 、圆形（Fig1b）和梭形（Fig1c，d） ，阳性神经元的长径多在 1020m 之间;中型（2130m）梭形、圆形、三角形和多角形的 GA
11、BA 阳性神经元较少. MOR 的免疫荧光染色阳性产物主要位于细胞膜和突起的膜上，细胞质和细胞核内的阳性产物较少（Fig1ad）.散在分布的 MOR 阳性神经元也见于 PAG 全长的各区，中等密度且染色较深的 MOR 阳性神经元仅见于 PAG中、尾段的腹外侧区.MOR 阳性神经元多为中、小型三角形（Fig1a） 、圆形（Fig1b）和梭形（Fig1c，d）神经元;大型（30m）阳性神经元和多角形的 MOR 阳性神经元较少见. 在 PAG 全长的各区内均能见到少量的神经元同时呈 GABA 和 MOR 免疫荧光组织化学染色阳性（Fig1ad） ，GABA/MOR 双标神经元也主要呈三角形（Fig1
12、a） 、圆形（Fig1b）和梭形（Fig1c，d） ，双标神经元也主要见于 PAG 中、尾段的腹外侧区（Fig1a）. 3 讨论 中枢内具有调控伤害性信息传递作用的内源性下行抑制系统的主要组成结构是 PAG、延髓吻端腹内侧部（rostral ventromedial medulla，RVM）和脑干中缝核簇，该系统在调控伤害性信息向中枢的传入方面起着重要作用1-4 .PAG 在下行抑制系统中处在承上启下的关键地位，在启动和激活下行抑制系统的过程中具有举足轻重的作用.5-HT是下行抑制系统的下行投射纤维的主要神经活性物质，GABA 是广泛地存在于哺乳动物中枢神经系统（CNS）的一种重要的抑制性神经
13、递质，多数GABA 能神经元属于中间神经元1，2，6，9 .我们以往的研究已经证明中枢内源性镇痛系统内有 GABAB 受体阳性神经元和 5-HT 与 GABAB 受体共存神经元，GABA 阳性终末与 5-HT 和 GABAB 受体共存神经元形成密切接触10，11 ，提示下行抑制系统内的 GABA 阳性终末可能通过GABAB 受体对 5-HT 能下行投射神经元起着持续性抑制性调控作用. 阿片受体具有多样性和多源性.目前已知中枢内至少存在三类阿片受体（， 和 受体） ，各类受体有不同的亚型12，13 .一般认为，CNS 内 MOR 介导内源性阿片样物质和吗啡的镇痛效应，具有直接调节GABA 能神经
14、元的作用5，7 .PAG 内可能存在调控下行抑制系统的抑制性局部环路，该环路主要由 GABA 能神经元和含内源性阿片样物质的终末组成14 ，含内源性阿片样物质的终末通过 MOR 对 GABA 能神经元具有抑制作用5 . PAG 内的 GABA 能神经元是否也呈 MOR 阳性，尚无直接的形态学依据.我们观察到 PAG 内有 GABA 阳性神经元，它们可能属于对 PAG 内 5-HT能下行投射神经元具有的持续性抑制作用的中间神经元.此外，我们还在PAG 内观察到部分神经元同时呈 GABA 和 MOR 阳性，GABA/MOR 共存神经元主要分布在 PAG 中、尾段的腹外侧区.上述结果说明 PAG 内
15、的 GABA 能神经元表达 MOR，MOR 是内源性阿片样物质的特异性结合位点;含内源性阿片样物质的终末可通过与 MOR 的结合，使 GABA 能抑制中间神经元的抑制效应减弱或消失，导致 PAG 向 RVM 发出下行投射的 5-HT 能神经元摆脱GABA 能神经元的抑制（脱抑制） ，激活 RVM 内向脊髓和延髓背角的 5-HT能下行投射系统并直接发挥镇痛效应.本研究结果为以上假设提供了直接的形态学依据，也说明 PAG 是调控下行抑制系统并抑制外周伤害性信息向中枢传递的重要结构. 图 1 略 参考文献: 1Zhang YH，Li YQ，Shi JW.Connections between glu
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