1、1_基金项目:浙江省科技厅项目(2014C31138 )收稿日期:2018-05-11作者简介:蒋新龙,男,1963年出生,教授级高级工程师,生物工程 棠梨籽油的超声波- 微波协同提取及其脂肪酸组成蒋新龙,蒋益花,陈思晴,沈瑾,张洋彪,周佳文(浙江树人大学生物与环境工程学院,杭州 310015)摘要:以棠梨籽为原料,研究超声波-微波协同提取棠梨籽油的最佳工艺,分析其脂肪酸组成。在单因素试验基础上,选择微波时间、超声功率、料液比和超声温度为自变量,以棠梨籽油出油率为响应值,采用响应面分析法,考察超声波-微波协同提取棠梨籽油的最佳工艺;采用气相色谱分析棠梨籽油脂肪酸组成。结果表明,最佳提取工艺条件
2、:液料比为 3.45 mLg-1、超声温度为 70.00 、组合时间为超声 10 min-微波 30.00 s、组合功率为 超声 120 W-微波 480 W,棠梨籽出油率为 34.78%。棠梨籽油中脂肪酸组成以不饱和脂肪酸为主,其中油酸 24.29%、亚油酸 60.94%。本研究为棠梨籽油的进一步开发利用提供了科学依据和技术参考。关键词:棠梨籽油;超声波-微波协同提取;响应面法;脂肪酸组成中图分类号:TS225.1 文献标识码: A 文章编号:棠梨(Pyrus betulaefolia Bunge)属蔷薇科(Rosaceae) 梨属(Pyrus L.)乔木,又称杜梨、豆梨。棠梨原产我国,广泛
3、分布在我国的北部、东北部和中部各省,储量丰富。棠梨为梨属较为原始类型,其综合利用价值较高,集嫁接繁殖砧木、材用、药用和园林绿化于一身 1。关于棠梨的研究主要集中在种子萌发与幼苗生长的研究、幼苗根系生长状况的研究以及作为砧木嫁接梨树等方面 2。棠梨果实未成熟时很涩,无法食用,完全成熟后全果为黑色,鲜食口感香甜;另外成熟棠梨果实中矿物元素含量普遍较高,特别是 P、K、Ca 、M n、M g 含量较多 3,可以被开发生产野生棠梨果露酒 3及棠梨果醋 4。棠梨籽是棠梨在果品加工过程中产生的废弃物,目前基本废弃。目前对于棠梨籽油的提取及脂肪酸组成分析的研究未见相关报道。本试验在单因素试验基础上,运用响应
4、面法研究超声波-微波协同提取棠梨籽油的最优工艺参数,通过 GC 分析其脂肪酸组成及含量,以期为棠梨籽油的开发利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器棠梨籽市售,选取颗粒饱满,无霉烂变质的为试材。37 种脂肪酸混合标准品( Sigma Aldrich);所用试剂均为国产分析纯。所用仪器:FW80 高速万能粉碎机:上海科恒高速万能粉碎机;格兰仕微波炉 D80D20EP-A3 型(中火对应 60%,功率 480 W);AB204 型分析天平:上海垒固仪器有限公司;KQ5200DE 超声波清洗机:上海精密仪器仪表有限公司;RE-52AA 旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂; 101A-3B 电热恒温
5、鼓风干燥箱:上海跃进医疗机械厂;Agilent 7890A 气相色谱仪:安捷伦科技有公司。1.2 方法1.2.1 超声波-微波协同提取超声波提取法利用超声波空化作用伴随的热效应和机械效应,加速溶剂萃取过程,但超声波提取技术无法完全破坏细胞壁的束缚 5。微波萃取根据不同物质吸收微波能力的不同,呈现出选择性加热特点 6。极性越大,对微波能的吸收越大,升温越快,越有利于细胞壁的完全破裂,提取速度也就越快 6-7。理论上,用先超声波提取技术进行提取,可使细胞组织结构疏松,将细胞中极性成分释放出来,再用微波提取技术,使棠梨籽细胞完全破壁,将明显提高提取效果。本研究根据理论预测进行试验预试,先微波后超声、
6、先微波后超声再微波、先超声后微波这三种方案,发现先超声后微波这种方案提取效果比较好,与原先预测一致。具体流程:棠梨籽除杂烘干粉碎过筛称重加入石油醚超声波辅助提取微波辅助提取2抽滤浓缩棠梨籽油。将 3.000 0g 粉碎成 40 目的的棠梨籽粉装入烧瓶中,按一定料液比加入石油醚,于一定条件下先进行超声辅助提取,再调节微波功率继续进行微波辐射提取,结束后进行减压抽滤,滤液用旋转蒸发器蒸馏浓缩得到提取物,将提取物放恒温鼓风干燥箱干燥,直至恒重,每组试验重复 3 次,取平均值。按下式计算棠梨籽油的出油率 Y(%)。10 %2m)(式中:m 为棠梨籽质量g, m1 为空瓶质量g,m 2 为空瓶和棠梨籽油
7、的质量g。1.2.2 提取优化试验单因素试验:超声提取时间固定 10 min8-9,采用以上 1.2.1 提取操作方法,提取条件为:液料比 4 mLg-1,超声功率 160 W,超声提取 10 min,再放入微波炉中,在中火功率下加热 40 s,考察超声温度为(30、40 、50、60、70 )对出油率的影响;液料比 4 mLg-1,超声 50 以功率 160 W 提取 10 min,再放入微波炉中,在中火功率下,考察微波时间(20 s、30 s 、40 s、50 s、60 s)对出油率的影响;液料比 6 mLg-1,超声 50 ,超声时间 10 min,再放入微波炉中,在中火功率下,加热 4
8、0 s,考察超声功率(120、140 、160、180、200 W) 对出油率的影响;超声 50 ,超声时间 10 min 超声功率为 160 W,再放入微波炉中,在中火功率下,加热 40 s,考察料液比(2、3、 4、5、6 mLg -1)对出油率的影响。响应面优化试验:根据微波时间、超声功率、料液比、超声温度 4 个单因素平行试验的结果,采用响应面分析,以出油率为响应值,对这 4 因子在 3 水平进行优选。表 1 为响应面试验因素水平表。表 1 Box-Behnken 响应面设计试验因素与水平编码 超声温度 A/ 微波时间 B/s 超声功率 C /W 液料比 D/ mLg-1-1 50 3
9、0 120 20 60 40 160 4+1 70 50 200 61.2.3 棠梨籽油理化性质测定酸价测定采用 GB/T55302005 法;过氧化值测定采用 GBT55382005 法;碘值测定采用GBT55322008 法;皂化值采用 GB/T 55342008 法;密度测定采用 GB/T55261985 法;折光率测定采用 GBT55272008 法。平行三次,取平均值。1.2.4 棠梨籽油的 GC 成分分析脂肪酸组成测定参照 GB/T 5009.168-2016 的内标法气相色谱分析。色谱条件:色谱柱:CNW CD-2560(100 m0.25 mm0.20 m);进样口温度:250
10、 ;检测器类型:FID;检测器温度:260 ;进样量:1 L;分流比:10:1;载气流速:0.5 mL/min;升温程序:130 保持 5 min,以 4 /min 的速率升温至 240 ,在 240 保持 30 min。1.3 统计方法及分析软件以上指标均重复测定 3 次并取平均值,利用 Origin8 软件作图;应用 SPSS20.0 软件进行数据统计,并用 Duncan 多重比较(SSR 法)检验各处理平均数之间的差异显著性 (P0.05)。2 结果与分析2.1 单因素试验超声温度的影响:温度不仅影响溶剂和油脂的分子热运动,同时温度过高会造成石油醚挥发,还会引起油脂分子结构的改变。由图
11、1 可知,随着超声温度的升高,棠梨籽出油率逐渐增大,在 60 时出油率达到最大值。在较低的温度时,提高温度使分子运动加剧,溶剂和油脂的粘度同时降低,使出油率增大;当温度接近石油醚的沸点时,石油醚挥发加快,减少了石油醚与棠梨籽粉的有效接触面积,另外温度升高还使棠梨籽油脂分子的结构发生改变,从而使出油率下降。因此 60 为较理想的提取温度。微波时间的影响:由图 1 可知,随着微波时间的延长,棠梨籽出油率逐渐增大,在 40 s 时出油率达到最大值。出油率上升较快的原因可能是随着微波时间延长,微波辐射在短时间内对细胞壁的破碎作用较大,3加速了被萃取出的籽油向棠梨籽表面的扩散速度。但当溶解度达到饱和时,
12、油脂溶出减少,出油率不再明显提高 10。因此,本试验较适微波时间为 40 s。超声功率的影响:超声波功率越大,其产生的机械作用和空化作用越剧烈,油脂渗透出来的速度就越快 11。当超声功率太大时,超声波的传播出现衰减,导致出油率增加缓慢甚至下降 12。由图 1 可知,超声波功率 160 W 较为适宜。液料比的影响:有效浓度差是超声波-微波协同法提取油脂的主要推动力。石油醚用量的增加相当于降低了油的浓度,增加了石油醚与棠梨籽细胞中油脂的浓度差,油料细胞内外渗透压越大,增加了传质推动力,从而提高了油脂在石油醚中的扩散速度,油脂越容易浸出 13。当石油醚增大到一定程度后出油率反而降低,主要原因可能是棠
13、梨籽中油脂含量逐渐减少,渗透压的改变对棠梨籽油的提取不再起较大作用,再增加溶剂用量反而起到稀释作用 14;另外溶剂体积过多,提取溶剂对微波能的吸收增加,导致细胞对微波能吸收减少,细胞壁破裂不完全,油脂不能从细胞中充分溶出 15-16。当然溶剂体积过多还会造成溶剂和能源的浪费,并给后序的浓缩工作带来困难。由图 1 可知,液料比 4 mL/g 较为适宜。图 1 不同处理对棠梨籽油出油率的影响2.2 响应面试验结果2.2.1 响应面试验设计结果与分析响应面试验设计与结果见表 2。采用 Designexpert 软件对所得 表 2 试验数据进行多项拟合回归,得到棠梨籽出油率对超声温度(A)、微波时间(
14、B)、超声功率( C)、液料比(D)的二次多项回归模型方程:Y=+34.07+1.73A+0.2B+0.10C+0.68D-0.17AB-0.45AC-0.23AD+0.4BC-0.11BD-0.35CD-1.08A2-0.91B2-0.78C2-1.27D2由表 3 可知,整体回归模型具有高度显著性 (P0.000 1) ,失拟项检验的 P=0.876 6(不显著)。由Designexpert 软件分析可知,决定系数 2 = 0.944 3,校正系数 2Adj= 0.888 7,说明方程对试验拟合良好,试验误差小,可以用此模型对棠梨籽油提取工艺进行分析和预测。变异系数 CV 反映了模型的置信
15、度,CV 值越低,说明模型的置信度越高 17。本试验的 CV 值为 1.58%,表明置信度较高,模型方程能够较好地反应真实试验值,可用此模型分析响应值的变化 18。从 回归方程各项方差分析表明,A、D、 A2、B 2、C 2、D 2 对棠梨籽油 的提取影响极显著( P0.01),各交互作用不显著。方差分析说明各个试验因子对棠梨籽油的提取影响由大到小的顺序依次为:超声温度、液料比、微波时间、超声功率。其中超声温度、液料比对梨籽油的提取影响极显著。合理的超声温度可使超声波的热效应、机械效应和空化效应4最大限度增强提取混合物极性,以保证提取混合物吸收微波能最大化;合适的液料比可以调节油料细胞内外渗透
16、压,同时可保证微波热效应利用最大化,以促进细胞壁完全破裂。方差分析也说明各个具体试验因子与响应值都不是简单的线性关系,二次项与响应值都有很大关系。表 2 响应面试验设计与结果序号 超声温度 A/ 微波时间 B/s 超声功率 C/W 液料比 D/ mLg-1 出油率 Y /%1 -1 0 0 1 30.422 -1 0 0 -1 29.033 1 0 -1 0 33.784 0 0 0 0 33.655 0 1 1 0 33.176 0 1 0 1 32.387 0 0 -1 -1 31.078 0 0 -1 1 33.319 -1 -1 0 0 30.0210 0 0 0 0 34.5511
17、0 0 0 0 33.1012 0 -1 0 -1 30.9313 0 -1 1 0 31.5114 1 1 0 0 34.2315 1 0 0 -1 33.2916 0 0 0 0 34.4717 1 -1 0 0 34.0818 1 0 0 1 33.7519 0 1 0 -1 31.0220 0 0 0 0 34.6021 -1 0 -1 0 30.0022 0 0 1 1 32.7223 0 1 -1 0 32.2224 0 -1 0 1 32.7525 1 0 1 0 33.2926 0 0 1 -1 31.8727 0 -1 -1 0 32.2528 -1 1 0 0 30.862
18、9 -1 0 1 0 31.31表 3 回归模型方程方差分析方差来源 平方和 自由度df 均方 F值 P 值 显著性模型 62.47 14 4.46 16.96 0.000 1 *A 35.98 1 35.98 136.8 0.000 1 *B 0.46 1 0.46 1.73 0.209 0C 0.13 1 0.13 0.49 0.496 6D 5.49 1 5.49 20.89 0.000 4 *AB 0.12 1 0.12 0.45 0.512 1AC 0.81 1 0.81 3.08 0.101 1Comment m1: 建议删除图 2,改为简要叙述即可已按照要求处理Comment m
19、2: 放在后面的单位中,其他亦同已按照要求处理Comment m3: 后面加上“I ”其他亦同已按照要求处理Comment m4: 删除(),其他亦同已按照要求处理5AD 0.22 1 0.22 0.82 0.379 9BC 0.71 1 0.71 2.71 0.121 7BD 0.053 1 0.053 0.2 0.660 7CD 0.48 1 0.48 1.84 0.196 8A2 7.59 1 7.59 28.87 0.000 1 *B2 5.4 1 5.4 20.51 0.000 5 *C2 3.92 1 3.92 14.89 0.001 7 *D2 10.5 1 10.5 39.9
20、0.000 1 *残差 3.68 14 0.26失拟性 1.89 10 0.19 0.42 0.876 6纯误差 1.79 4 0.45总差 66.15 28注:* 表示差异显著(P 0.05),*表示差异极显著(P 0.01) 。2.2.2 双因素交互作用分析在超声温度、液料比、超声功率、微波时间4个因素中任取两个作为X和Y ,以出油率作为Z,由Design-Expert.V8.0软件处理作出相应的各因素交互作用的三维曲面图。表现为曲线越陡,说明交互作用对棠梨籽油出油率的影响越显著。三维曲面图分析可知,棠梨籽油出油率随任意两个变量的增加都呈现上升趋势,达到某一极大值后,曲面下降或趋向于平缓,
21、且A( 超声温度) 与C (超声功率)的交互作用对棠梨籽油出油率影响最显著,这与回归分析的结果吻合。2.2.3 提取工艺优化及验证 利用软件预测模型的极大值,并得出提取棠梨籽油的最优条件为:超声温度(70.00 )、微波时间(39.22 s)、超声功率(142.79 W) 和液料比( 4.57 mLg-1),在此优化条件下预测棠梨籽油出油率最大值为34.80%。结合生产实际的可操作性,将响应面优化分析所得到的各因素理论最优值修正为:超声温度为70.00 、组合时间为超声10 min-微波40 .00 s、组合功率为超声140 W-微波480 W、液料比为4.57 mLg -1。在修正条件下进行
22、验证试验,棠梨籽油出油率都达到34.78% 以上, 与预测值基本相符,验证了模型的有效性,可用于超声波- 微波协同提取棠梨籽油工艺条件的优化和预测。2.3棠梨籽油主要理化指标测定由表 4可知,棠梨籽油的过氧化值为 5.02 mmol/ kg,过氧化值是衡量油脂被氧化的程度,数值越高,油品越差,棠梨籽油的过氧化值低于食用植物油国家标准。棠梨籽油的酸值为 2.74 mg KOH/g,低于 3.00 mg KOH/g,符合食用植物油国家标准。碘值是判断油脂脂肪酸不饱和程度的指标,碘值越高,不饱和脂肪酸含量越高,棠梨籽油的碘值为 117.22 g I /100 g,属于半干性油。皂化值表示油脂中脂肪酸
23、相对分子质量的大小,皂化值越大,脂肪酸的相对分子质量越小,棠梨籽油的皂化值为 163.75 mg KOH/g。此外,棠梨籽油相对密度为 0.882 6、所制棠梨籽油为澄清透明的浅黄色液体。因此,以测定的理化指标判断,棠梨籽油达到食用植物油国家标准。表 4 棠梨籽油的主要理化性质酸值/mgKOH/g过氧化值/ mmol/kg 碘值/ g I/100 g 皂化值 / mgKOH/g 颜色密度20 折光率20 透明度2.74 5.02 117.22 163.75 浅黄色 0.882 6 1.465 0 澄清、透 明注:GB / T 2716-2005标准要求: 酸值/ mgKOH/g 3;过氧化值/
24、 g/100 0.25,1 mmol/kg=39.4 g/100g。2.4 棠梨籽油脂肪酸组成分析根据 1.2.4方法,对棠梨籽油进行 GC分析,棠梨籽油的脂肪酸组成分析结果见图 3和表 5。张钰斌 19研6究表明,加热温度为 150 时顺反异构化开始转化反应,油酸样品中开始有反式油酸生成。所以表 5 棠梨籽油的第 6 个组分是反油酸,应该是由 GC 分析预处理过程中油酸转变成的反油酸,该组分实际为油酸,这与郑联合等学者 20的研究结果一致。由表 5 可知,从棠梨籽油中共鉴定出 15 种脂肪酸,主要脂肪酸为反油酸(24.29%) 、亚油酸(60.94%)、顺-10- 十五烯酸(7.69%)、花
25、生酸(1.40%)、硬脂酸(2.21%),5 种主要脂肪酸含量占 96.53%。其中不饱和脂肪酸含量为 94.84%,尤其以不饱和脂肪酸亚油酸为主,高于一般植物油中亚油酸的含量,如油茶油 7.08%、菜籽油 23.57%、花生油 31.36%、芝麻油 42.75%21。亚油酸是人体必需脂肪酸,具有营养保健和药疗功效 22,可作为高血脂、冠状动脉粥样硬化、心血管病人的长期食疗保健油品,具有很好的开发应用前景。图 3 棠梨籽油脂组份分析色谱图表 5 棠梨籽油脂肪酸种类及其相对含量序号 测试名称 保留时间/min 相对含量/%1 C15.1(顺-10- 十五烯酸) 28.458 7.690 82 C
26、16.1(棕榈油酸) 29.800 0.114 13 C17.0(十七烷酸) 30.490 0.064 64 C17.1(顺-10- 十七烯酸) 31.377 0.036 35 C18.0(硬脂酸) 31.662 2.207 16 C18.1N9T(反油酸) 32.455 24.292 87 C18.2N6T(反亚油酸) 33.599 0.055 08 C18.2N6C(亚油酸) 33.840 60.885 39 C20.0(花生酸) 34.927 1.402 110 C20.1(顺-11- 二十碳烯酸) 35.757 0.489 311 C21.0(二十一碳酸) 36.819 0.019 5
27、12 C20.2(顺-11,14-二十碳二烯酸) 37.426 0.037 513 C20.3N6(顺-8,11,14-二十碳三烯酸) 38.167 0.169 914 C23.0(二十三碳酸) 39.881 0.044 415 C20.5N3(顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸) 41.452 0.093 1Comment m5: 英文作者姓也全部大写,其他亦同已按照要求处理73 结论在单因素试验的基础上,运用响应面方法,确定了超声波-微波协同提取法的最佳提取工艺:将 40目的棠梨籽粉按 3.45 mLg-1料液比加入石油醚,超声温度 70.00 、超声功率 120 W、超声辅助提
28、取 10 min,再调节微波功率 480 W微波辐射提取 30.00 s。此条件下 , 出油率为 34.78%。响应面设计结果较为准确可靠,可用于超声提取棠梨籽油工艺条件的优化。以测定的理化指标判断,所提取的棠梨籽油达到了食用植物油国家标准。GC 分析得到棠梨籽油主要成分有油酸、亚油酸、顺-10-十五烯酸、硬脂酸、花生酸 ,尤其以不饱和脂肪酸亚油酸为主。棠梨籽油可作为优质食用油源和功能性食用油开发利用。参考文献1 蒋学莉, 史锋厚, 沈永宝, 等.豆梨资源的保护与开发利用J.江苏农业科学, 2015, 43(3):162-165JIANG X L, SHI F H, SHEN Y B,et a
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40、, 2014, 28(8) : 1400-140619 张钰斌.高温条件下反式油酸生成机理的研究D.天津: 天津科技大学, 2014ZHANG Y B .Study on formation mechanism of elaidic acid under high temperature conditionsD. Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 201420 郑联合,赵阔,王涛.琼崖海棠籽油的理化性质及脂肪酸组成分析 J.中国油脂,2011, 36(9): 60-63ZHENG L H, ZHAO K, WANG T
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