1、1苦荞抗氧化性与生长条件的相关性 1国旭丹 1 王超楠 1 张婧 1 吴兰芳 2（河北中医学院基础医学院 1，石家庄 050200）（河北中医学院药学院 2，石家庄 050200）摘要：通过测定 2 个品种 3 个地域生长的苦荞全粉游离酚和结合酚提取物在不同体系中的抗氧化性、芦丁和槲皮素含量，以定量分析品种、环境条件及其交互作用对以上指标差异贡献的大小，并在此基础上分析环境参数与以上指标的相关性。结果发现环境的贡献率最大，其次是品种环境，品种的贡献率最低。环境参数如高海拔有助于提高苦荞芦丁含量（r=0.98，P 0.05） ，日照时间与槲皮素含量有显著的正相关性（r =0.98，P 0.05）
2、 ，海拔、降水量和日照时间与抗氧化性有显著的正相关性（ r0.98，P 0.05） 。该结果提示通过优化特定苦荞品种的生长条件便能培育出富含天然抗氧化成分的苦荞存在可能。关键词：苦荞 抗氧化性 芦丁 槲皮素 生长条件中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：慢性病惊人的增长速度引起社会各界的高度关注，机体内自身的抗氧化防御体系与活性氧（O 2-、H 2O2、ROO -、HO -、 1O2）的不平衡与慢性病密切相关。此种不平衡导致机体产生严重的氧化压力，不仅损害体内的大分子物质（如脂类、蛋白质、碳水化合物、DNA 等） ，而且损伤细胞甚至使细胞凋亡，最终引起与老化有关的一旦形成就无
3、法治愈的慢性疾病（如糖尿病、心脏病、癌症、Alzheimers 等）甚至加速疾病的发展 1。许多流行病学研究已经证明膳食抗氧化剂在预防以上慢性疾病上发挥着重要作用 2。多酚物质被认为是植物性原料中最有效的抗氧化成分 3。苦荞(Fagopyrum tatarium Gaertn.)含有丰富的酚类物质尤其是黄酮类成分，如芦丁和槲皮素含量和活性极为突出。实验研究和流行病学研究表明苦荞黄酮在控制体重、降低血糖、血脂、血压水平，抑制动脉粥样硬化发生和改善血管功能等方面的有益作用 4。抗氧化性是苦荞发挥以上保健功能作用的基础。研究发现生长地点、环境因素、生长季节及品种会影响荞麦的品质指标，但气象因子是影响
4、荞麦综合品质指标的最重要、最活跃的因子5，而气象因子对苦荞抗氧化性差异的贡献大小却鲜见报道。本研究以在 3 个不同环境条件下生长的 2 个品种的苦荞为原料，通过提取苦荞全粉中的游离酚和结合酚，并在不同的抗氧化体系考察它们的体外抗氧化性，以 HPLC 测定芦丁和槲皮素的含量，基金项目：中央财政公共卫生专项“2017 年中药资源普查项目” （Z135080000022） ，校博士科研基金（BSZ2018010）收稿日期：2018-06-20作者简介：国旭丹，女，1984 年出生，讲师，药食两用植物化学与营养分析通讯作者：吴兰芳，女，1985 年出生，副教授，药食两用资源开发与利用2进而定量分析品种
5、、环境条件及其交互作用对以上指标差异贡献的大小，在此基础上分析以上指标和生长环境的相关性。以期初步探讨通过选择优化特定品种和生长条件培育出具有更强抗氧化性的苦荞具有可能性。本研究结果将对苦荞的育种、生产和消费将有重要的科学意义。1 材料与方法1.1 材料与试剂采集生长在四川凉山、宁夏同心和甘肃定西的兴苦 2 号与迪庆苦荞种子，3 个地区的环境条件如表 1。表 1 3 个苦荞生长地的环境条件地区 平均气温 / 降水量/mm 日照时间/h 海拔/m 灌溉四川凉山 51.58 667.3 1 078.4 2 100 非灌溉宁夏同心 51.18 151.4 1 446.5 1 422 非灌溉甘肃定西
6、51.66 317 1 071.7 1 920 非灌溉DPPH、ABTS、Trolox、胡萝卜素均： Sigma 公司。Tween-40：Merck 公司。芦丁、槲皮素标品（色谱级）：天津一方科技有限公司。1.2 仪器与设备ESB-300 实验室乳化机； UV1240 紫外可见分光光度计；FW100 型高速万能粉碎机；高效液相色谱仪：SPD-M10A VP Shimadzu, LC-8A pump。1.3 方法1.3.1 样品预处理：采用万能粉碎机将苦荞种子粉碎，时间约 30 s，过 40 目筛，弃苦荞壳，得苦荞全粉。1.3.2 水分的测定将苦荞种子 97 干燥 16 h 后，放入干燥器中冷却
7、，称重，再干燥、冷却、称重，直至恒重，测得苦荞种子的水分含量。1.3.3 游离酚的提取1 g 苦荞全粉用 50 mL 80%丙酮均质 10 min，1 500 r/min 离心 10 min，取上清。此步骤重复操作3 次。收集 3 次上清液，于 45蒸干，甲醇定容至 10 mL，即为游离酚提取物。 -20避光储存 6。1.3.4 结合酚的提取1 g 苦荞全粉以 50 mL 80%丙酮均质 10 min，1 500 r/min 离心 10 min，弃上清。沉淀部分加入20 mL 2 mol/L NaOH，充氮气，摇床上消化 1 h，以 4 mL 浓盐酸调至中性，20 mL 正己烷去脂后，20 m
8、L 乙酸乙酯提取，离心后取上清，乙酸乙酯提取 5 次，合并上清 45旋转蒸干。甲醇定容至 10 3mL，即为结合酚提取物。-20避光储存 6。1.3.5 DPPH的清除能力1 mL 提取液与 1 ml 131.87 mol/L DPPH溶液混匀后室温下避光放置 30 min， 517 nm 处测吸光值。结果以 mol Trolox/100 g DW 表示 7。做 3 次重复。1.3.6 ABTS+的清除能力5 mol/L ABTS 溶液与二氧化锰室温下放置 30 min，过滤除去二氧化锰， 734 nm 下以 pH 7.4 的磷酸缓冲液将该溶液吸光值调至 0.7 得稳定的 ABTS+ 溶液。3
9、 mL ABTS+ 溶液与 200 L 稀释一定倍数的提取液反应，734 nm 下测其吸收值，3 mLABTS+ 溶液与 200 l 蒸馏水作对照。结果以 mmol Trolox/100 gDW 表示 8。做 3 次重复。1.3.7 -胡萝卜素-亚油酸乳化液法参照文献9的方法。抗氧化系数（AAC）的计算公式为：AAC = 1 000As(60) Ac(60)Ac(0) Ac(60)式中：As (60)为样品管 60 min 时的吸光值；Ac (60)为对照管 60 min 时的吸光值；Ac (0)为对照管 0 min 时的吸光值。1.3.8 芦丁和槲皮素含量的测定上清液经 0.45 m 过滤，
10、Phenomenex C18 反相柱(250 mm 4.6 mm，5 m)，流动相 0.4%磷酸-甲醇（体积比 40：60） ，流速 1.0 mL/min，柱温 20 ，检测波长 358 nm，进样量 100 L。标准曲线法定量，结果以 mg/100 g DW 表示。1.3.9 数据处理方差分析和显著性检验用 SPSS 软件处理。2 结果与分析2.1 苦荞全粉的抗氧化作用2.1.1 DPPH清除能力由图 1 可知，游离酚和结合酚提取液均表现出了较强的 DPPH清除能力，清除能力范围分别是（22 931.81496.80）（33 403.68393.55）mol Trolox/100 g DW
11、和（66.161.11）（ 245.8214.01）mol Trolox/100 g DW，显然游离酚提取物远远高于结合酚提取物的 DPPH清除能力，这是由于苦荞全粉中的抗氧化成分大多以游离形式存在。由图 1 还可看出，不同样品表现出了不同的 DPPH清除能力，这可能是由于苦荞生长的环境条件和品种的影响。例如，对于兴苦 2 号品种，3 个地区生长的苦荞全粉的结合酚提取物对 DPPH的清除能力有显著差异。对Comment U1: 请将每个柱形的下半部分标准差补全。余同。已修改，图 2也作了修改。4于迪庆品种，在四川生长的苦荞全粉的游离酚和结合酚提取物的 DPPH的清除能力都明显高于在宁夏和甘肃生
12、长的。不同品种的苦荞在相同地域如宁夏和甘肃地区生长时其对 DPPH的清除能力也具有显著不同。图 1 苦荞提取物的 DPPH的清除能力注：字母不同表示差异在 P 0.05水平显著。2.1.2 ABTS+清除能力由图 2可知，游离酚和结合酚提取液均表现出较强的 ABTS+清除能力，清除能力范围分别是（123.300.85）（ 139.1711.17）mmol Trolox/100 g DW和（0.420.04）（1.010.10 ）mmol Trolox/100 g DW，显然游离酚提取物仍远高于结合酚提取物的 ABTS+清除能力。虽然不同品种和不同环境条件下生长的苦荞全粉游离酚提取物对 ABTS
13、+的清除能力都没有显著差异，但它们的结合酚提取物之间的差异显著。Comment U2: 根据学报要求，请将2张图合并为 1张多坐标轴图。稀释倍数的问题可在图注中说明，就不会引起读者误解。已修改。5图 2 苦荞提取物的 ABTS+的清除能力注：字母不同表示差异在 P 0.05水平显著。2.1.3 抑制 -胡萝卜素褪色的能力由图 3可知，尽管游离酚提取物部分被稀释了一定倍数，游离酚提取液仍表现出了较强的抑制-胡萝卜素褪色的能力，其抗氧化系数范围是（518.1715.45）（701.4721.56） ，结合酚提取液的抗氧化系数范围是（178.888.30）（498.8256.74 ） 。在抑制 -胡
14、萝卜素褪色的能力上，相同品种不同地区生长的苦荞全粉游离酚或结合酚提取物具有显著差异；相同环境条件生长的不同品种的苦荞全粉游离酚或结合酚提取物也具有显著差异。图 3 苦荞提取物的抗氧化系数注：字母不同表示差异在 P 0.05水平显著。同一抗氧化系数下，自由酚被稀释了 6倍。2.2芦丁和槲皮素含量由表 2可知，苦荞全粉中以游离形式存在的芦丁和槲皮素含量远远高于以结合形式存在的芦丁和槲皮素，说明苦荞全粉中的芦丁和槲皮素主要以游离形式存在。芦丁和槲皮素含量分别是（518.54 4.32）（1 447.87 1.69）mg/100 g DW和（425.65 4.03）（857.62 3.66）mg/10
15、0 g DW。6 个样品的芦丁含量都有显著差异，除甘肃地区 2个品种的槲皮素含量没有显著差异外，宁夏和四川的槲皮素含量均有显著差异，表明生长条件或品种或者它们的相互作用都可能影响苦荞全粉中芦丁和槲皮素的含量。表 2 苦荞全粉中的芦丁和槲皮素含量 /mg/100 g DW品种 地区 游离酚提取物 结合酚提取物 总提取物芦丁组成四川 1 444.59 1.75 a 3.28 0.06 d 1 447.87 1.69 a6宁夏 1 213.98 9.05 e 2.94 0.04 e 1 216.92 9.09 e兴苦 2 号甘肃 1 344.47 5.86 b 3.83 0.04 b 1 348.3
16、0 5.90 b四川 1 322.00 10.59 c 3.59 0.06 c 1 325.59 10.65 c宁夏 517.45 4.34 f 1.09 0.03 f 518.54 4.32 f迪庆甘肃 1 247.01 6.74 d 11.49 0.04 a 1 258.50 6.77 d槲皮素组成四川 478.76 2.39 d 0.61 0.01 c 479.37 2.40 d宁夏 425.09 4.03 e 0.56 0.01 d 425.65 4.03 e兴苦 2 号甘肃 621.82 2.28 b 0.72 0.02 b 622.54 2.29 b四川 538.42 2.60 c
17、 0.61 0.02 c 539.03 2.61 c宁夏 857.23 3.66 a 0.39 0.01 e 857.62 3.66 a迪庆甘肃 626.59 3.14 b 0.86 0.03 a 627.46 3.12 b2.3 品种和环境对苦荞抗氧化性的影响以上 2 个品种 3 个生长地区的苦荞全粉在不同的抗氧化体系中表现出了显著差异，说明品种和环境对苦荞抗氧化性有较大影响。为了分离并定量品种、环境和品种环境（品种和环境交互作用）对苦荞抗氧化性的影响，基于 3 个地区 2 个苦荞品种的数据设计了一个 23 因子的 ANOVA 分析。品种、环境和品种环境方差贡献率（总均方的百分比）的大小可以
18、指出它们对苦荞抗氧化性影响的相对重要性。方差贡献率见表 3。结果表明品种、环境和品种环境都极显著影响着苦荞的 DPPH清除能力，芦丁和槲皮素含量（P 0.01） 。而对于抗氧化系数，环境对游离酚提取物总方差表现出了较高的贡献率，达 77.36%（P 0.01） ，而品种 环境对结合酚提取物总方差表现出了较高的贡献率，达 77.11%（P 0.01） 。总的来说，对于抗氧化性，环境贡献率（范围为 40%77%）高于品种和品种环境的贡献率（分别为 31%33%和 20%77%） ；对于芦丁和槲皮素含量，环境的贡献率也高于品种和品种 环境。说明环境对抗氧化性、芦丁和槲皮素含量的影响较品种和品种环境大
19、。表 3 品种、环境及交互作用对苦荞抗氧化性影响的比例方差分量抗氧化性品种 环境 品种环境DPPH清除能力 /mol Trolox eq./100 g DW 33.25 * 40.23 * 20.37 *ABTS+清除能力 /mol Trolox eq./100 g DW 31.47 * 7.42 n7游离酚提取物 AAC 2.45 77.36 * 6.33 *结合酚提取物 AAC 0.41 16.23 * 77.11 *芦丁含量 /mg/100 g DW 6.96 * 46.86 * 46.13 *槲皮素含量 /mg/100 g DW 19.40 * 72.87 * 7.69 *注：结果以总
20、均方的百分比表示；*表示显著（P 0.05） ，*表示极显著（P 0.01） ，n，代表没有贡献。2.4 抗氧化作用和生长条件的关系由 2.3 结果分析得到对苦荞粉的抗氧化性的影响因素中生长环境是最重要因素。所以，重点分析了环境参数包括平均气温、降水量、日照时间和海拔对苦荞抗氧化性的影响，苦荞粉抗氧化性与环境参数的相关性分析结果见表 4。结果显示，海拔与芦丁含量在 2 个品种中都表现出了显著的正相关性（r=0.98，P 0.05） 。对于兴苦 2 号品种，总 DPPH清除能力与海拔有显著的正相关性（r=0.99，P 0.05） ，游离酚提取物抑制 -胡萝卜素褪色的能力与降水量有显著的正相关性（
21、r=0.98，P 0.05） 。对于迪庆品种，结合酚提取物抑制-胡萝卜素褪色的能力（r =0.99，P 0.05）和槲皮素含量（r=0.96，P 0.05）与日照时间有显著的正相关性。表 4 苦荞抗氧化性与生长条件的相关性分析抗氧化性环境参数 品种DPPH AACF AACB 芦丁 槲皮素兴苦 0.72 0.22 0.26 0.50 0.98 *平均气温 /C迪庆 0.13 0.46 0.91 0.78 0.64兴苦 0.85 0.98 * 0.99 * 0.96 * 0.06降水量/mm迪庆 0.93 0.75 0.63 0.79 0.90兴苦 0.98 * 0.57 0.75 0.90 0
22、.72日照时间/h迪庆 0.44 0.11 0.99 * 0.99* 0.96 *海拔/ m 兴苦 0.99 * 0.77 0.9 0.98* 0.51迪庆 0.67 0.37 -0.91 0.98* -0.99*注：结果以 Pearson 相关系数表示；*表示显著（P 0.05） ； DPPH 代表 DPPH的清除能力， AACF 代表游离酚提取物的抗氧化系数，AAC B 代表结合酚提取物的抗氧化系数， 3 讨论在 3 种抗氧化体系中，苦荞表现出了很强的 DPPH和 ABTS+的清除能力及抑制 -胡萝卜素褪8色的能力（图 13） 。DPPH和 ABTS+的清除能力分别为 2.3104 3.3
23、104 mol Trolox eq./100g DW 和 1.2105 1.4105 mol Trolox eq./100 g DW，显然，苦荞的自由基清除能力高于小麦（ABTS + 清除能力为 14.3 17.6 mol Trolox /g DW)） 10、强化的胡萝卜（ DPPH的清除能力为 6.21 131.1mol Trolox/g DW、ABTS +的清除能力为 10.1 285.0mol Trolox/g DW） 11，暗示苦荞可以作为清除自由基的良好膳食来源。在抑制 -胡萝卜素褪色方面，苦荞游离酚提取物的 AAC 为 518701，结合酚提取物的 AAC 为 178501（图 3
24、） ，与甜荞籽、小麦胚芽、向日葵籽以及公认的强抗氧化性的蓝莓（抗氧化系数分别为 125、236、298 和 796） 12相比，苦荞的 AAC 较高，暗示在抑制 -胡萝卜素褪色方面苦荞同样具有较高的有效性。从图 13 可看出，游离酚提取物的自由基清除能力远远强于结合酚提取物。平均来说，游离酚提取物对总自由基清除能力的贡献大于 99%。因此，可以认为游离酚提取物是总自由基清除能力的主要贡献者。苦荞在食品及医药领域已广受关注，黄酮成分是其功能性开发基础，芦丁和槲皮素是其中含量最为丰富，活性最为突出的黄酮化合物。本研究中苦荞粉以游离形式存在的芦丁和槲皮素含量远远高于以结合形式存在的芦丁和槲皮素，说明
25、苦荞全粉中的芦丁和槲皮素主要以游离形式存在。由于游离酚和结合酚分别在人体的上消化道和结肠被吸收发挥它们对机体健康的保护作用，所以苦荞粉通过上消化道被吸收发挥保健功能的作用更大。由图 13 和表 2 可知， 在 3 个地区生长的 2 个品种的苦荞全粉在抗氧化性、芦丁和槲皮素的含量上均表现出了显著差异，说明品种和环境对它们有较大影响。本研究进而定量分析了品种、环境条件及其交互作用对以上指标差异贡献的大小。环境贡献率最大，其次是品种环境，品种的贡献率最低。发现日照时间、降水量、海拔与苦荞全粉的抗氧化性、芦丁和槲皮素含量有显著的正相关性，平均气温与槲皮素含量有显著的负相关性，文献5指出荞麦整个生育期降
26、水有利于荞麦品质指标的积累，充足的光照有利于作物生长，也利于各品质指标积累。较高的均温和日最高温大于 30时，对荞麦的生长有不良影响，不利于各品质指标的积累，以上报道支持本研究结果。芦丁含量和生长地的海拔高度在 2 个品种中表现出了一致的结果，说明苦荞全粉的芦丁含量与其生长地的海拔有显著的相关性。文献13 发现环境条件比品种更能影响苦荞药草的芦丁含量，而且苦荞叶中的芦丁含量受 UV B 照射和干燥处理的影响 14。以上说明海拔越高，紫外线越强，越有利于芦丁的产生。所以在高海拔地区种植苦荞有利于芦丁含量的积累。4 结论本研究结果指出环境对苦荞全粉抗氧化性、芦丁和槲皮素含量总方差的贡献率最大，其次
27、是品种环境，品种的贡献率最低。环境参数如高海拔有助于提高苦荞芦丁含量（r=0.98，P 0.05） ，Comment U3: BAUBLIS A J，其余请参照修改。已修改。9日照时间与槲皮素有显著的正相关性（r=0.98，P 0.05） ，海拔、降水量和日照时间与苦荞全粉的抗氧化性有显著的正相关性（r0.98，P 0.05） 。该结果提示通过优化特定苦荞品种的生长条件便可能培育出富含天然抗氧化剂的苦荞。参考文献：1 BAUBLIS A J, CLYDESDALE E M, DECKER E A. Antioxidants in wheat - based breakfast cerealsJ
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37、 1303-1307.Correlation between Antioxidant Properties and Growing Condition of Tartary Buckwheat Guo Xudan1 Wang Chaonan1 Zhang Jing1 Wu Lanfang2（ Basic Medical College, Hebei University of Chinese Medicine1, Shijiazhuang 050200 ）（College of Pharmacology, Hebei University of Chinese Medicine2, Shiji
38、azhuang 050200 ）Abstract: The free and bound phenolic extracts of two tartary buckwheat samples grown at three locations were analyzed for antioxidant properties in different systems and rutin and quercetin contents. Then, the relative contributions of variety and growing environment to antioxidant
39、properties and rutin and quercetin contents were determined, as well as correlations of these properties to growing conditions. The results showed that growing conditions had more contribution than the interaction between variety and environment and variety to individual the above indicators. For ex
40、ample, higher altitudes and more sunlight hours might have increasing effects on rutin（r=0.98，P 0.05）and quercetin, respectively. The positive correlations of altitude, amount of precipitation and sunlight hours and antioxidant properties were found(r0.98，P 0.05). This study suggests that tartary buckwheat antioxidant properties can be enhanced by optimizing the growing conditions of a selected variety.Keywords: tartary buckwheat, antioxidant, rutin, quercetin, growing condition
