1、1第 6 章 药物定量分析与分析方法的验证6.1 定量分析样品的前处理方法在采集药物样品之后，往往不能直接铡定，一般需根据药物的性状、结构与性质或组方采用一定的方法对样品进行前处理，使待测药物或待测元素转化为易于测定的形式后再进行定量、定性分析检测。多数化学原料药物具有特征结构或取代基可不经特殊处理，使用适当的溶剂溶解后直接采用滴定法、分光光度法或色谱法测定。对于药物制剂，其前处理方法着重考虑的是干扰组分的排除。而对于一些含有卤素或金属的有机药物，由于其所含金属或卤素在药物分子结构中结合的牢固程度不同，需要采用不同的方法对这些有机药物进行适当的处理才能进行准确地定量分析。本节主要介绍含金属或含
2、卤素、硫、磷、砷等特殊元素药物分析的前处理方法，这些药物的分析方法通常可分为两大类：一类是不经有机破坏的分析方法；另一类是经有机破坏的分析方法。6.1.1 不经有机破坏的分析方法本类分析方法不对药物分子中的有机结构部分进行完全破坏，仅选用适当的溶剂溶解样品，使待测元素离子电离或经简单的回流处理使有机结合的待测元素原子离解而转化为无机盐类后测定。本法主要是用于含金属有机药物或结合不牢固的含卤素等药物的分析。根据操作方法不同，主要以下三种方法：21. 直接测定法凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些 CM（金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物，在水溶液中可以电离，因而不需有
3、机破坏，可直接选用适当的方法进行测定。金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸、酚类等的金属盐或络合物，如葡萄糖酸钙、乳酸钙等；而另一种为金属原子直接与碳原子以共价键相连，如葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁等。例 6-1 中国药典 (2010 年版)收载的原料药富马酸亚铁的含量测定方法： 取本品约 0.3g，精密称定，加稀硫酸 15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml 与邻二氮菲指示液 2 滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L) 滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每 1ml 硫酸铈滴定液(0.1mol/L)相当于 16.99mg 的富马酸亚铁。原理：抗贫血药物富马酸亚铁，由于其在水中几
4、乎不溶而能溶于热矿酸如稀硫酸，同时分解释放出亚铁离子，可选用硫酸铈滴定液进行滴定，指示剂邻二氮菲与亚铁离子形成红色配位化合物，遇微过量氧化剂（硫酸铈）被氧化生成浅蓝色高铁离子配位化合物指示终点。此时所生成的富马酸没有干扰。2. 经水解后测定法 1）碱水解后测定法在含卤素的有机药物中，卤素原子一般以共价键与有机碳或芳环相连，因此在分析之前，需将有机卤素原子转变为无机卤素离子，然后采用银量法、碘量法等适宜方法进行含量测定。常用的本法是将含卤素有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中，在碱性条件下，加热回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Volhard 法）测定。本法适用于含
5、卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物（如卤原子和脂肪碳原子相连者） 。 例 6-2 中国药典 (2010 年版)收载的三氯叔丁醇的测定取本品约 0.1g，精密称定，加乙醇 5ml ，溶解后，加 20氢氧化钠溶液 5ml，加热回流 15 分钟，放冷至室温，加水 20ml 与硝酸 5ml，精密加硝酸银滴定液(0.1mol/L)30ml，再加邻苯二甲酸二丁酯 5ml，密塞，强力振摇后，加硫酸铁铵指示液 2ml，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L) 滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每 1ml 的硝酸银滴定液(0.1mol/L)3相当于 6.216mg 的 C4H7Cl3O.1/2H2O。三氯
6、叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解，氯元素全部转变成氯化钠，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量过量的硝酸银滴定液，使 Cl -生成 AgCl沉淀，过量的硝酸银，以 Fe3+为指示剂，用硫氰酸铵液回滴定。 原理：CCl3-C(CH3)2OH + 4NaOH (CH3)2-CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O 加 热 回 流NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO 3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH 4NO3 Fe3+ + SCN - Fe (SCN)2+A（淡棕红色）2）酸水解后测定法本法是将含卤素有机药物溶于适当的矿酸（如盐酸）加热
7、回流使其水解，将不溶性金属盐类水解置换为可溶性盐，然后选用配位滴定或剩余酸碱滴定法测定。例 6-3 硬脂酸镁的测定 中国药典 (2010 年版) 取本品约 0.1g，精密称定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L) 50ml，煮沸至油滴澄清，继续加热 10min，放冷至室温，加甲基橙指示液 12 滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每 1ml 硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于 2.016mg 的 MgO。原理：Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH 加 热 回 流2NaOH + H2SO4 Na2SO4 + 2H2O 3. 经氧化还
8、原后测定法1）碱性还原后测定卤素结合于芳环上时,由于分子中卤素的结合较牢固,需在碱性条件下加还原剂（如锌粉）加热回流，使结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Fajans 法）测定。本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。例 6-3 泛影酸的测定 中国药典 (2010 年版) 4取本品约 0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液 30ml 与锌粉 1.0g，加热回流 30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤 3 次，每次 15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸 5ml 与曙红钠指示液 5 滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。
9、每 1ml 硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于 20.46mg 的 C11H9 I 3N2O4。ChP(2010)收载的胆影酸、碘番酸、胆影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法测定。 原理： COHIIINHCO3CH3ON + 1NaOH +Zn II I+ 3NaI + 2CH3ONa + 3a2ZnO2 +3H2ONaI + AgNO3 AgI + NaNO32）酸性还原后测定法例 6-4 碘番酸的测定 日本药局方 (13 版)取本品的干燥品约 0.4g，精密称定，加锌粉 1g 及冰醋酸 10ml，加热回流 30min，放冷，冷凝管用水 30ml 洗涤，用脱脂棉过滤，烧瓶与脱脂棉用水
10、洗涤 2 次，每次 20ml，洗液与滤液合并，加四溴酚酞乙酯指示液 1ml ，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。终点时黄色沉淀变为绿色。每 1ml 硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于 19.031mg 的 C11H12 I 3NO2。6.1.2 经有机破坏的分析方法某些含金属原子、卤素的有机药物结构中的待测原子与碳原子结合牢固，用上述的水解或氧化还原的方法难以将有机药物中待测原子转变为无机形式。因此必须采用有机破坏的方式将药物分子中有机结构部分完全破坏，使得结合的待测原子转变成为可测定的无机形式。一般有机破坏被分为湿法破坏、干法破坏和氧瓶燃烧法。1. 湿法破坏（湿法消解）本法主要用于
11、含氮化合物的前处理，在生物制品分析中用于氮（包括蛋白质） 、磷及氯化钠测定法的前处理。另本法亦用于生物样品中金属元素测定时生物基质的去除。分解剂（消解剂或消化剂）主要使用硫酸，加入一些氧化剂（如硝酸、硫酸盐、高氯酸等）作为辅助消化剂，根据消解剂的组合不同，可有如下表 3-1 中几类常见类型：表 6-1 湿法消解常用类型5类型 特 点HNO3- HClO4反应激烈，破坏力强。适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，所得金属离子一般为高价态，不适宜含氮杂环类药物的处理。HNO3- H2SO4适用于大多数有机药物的破坏，所得金属离子一般为高价态，不适于碱土金属药物。H2SO4- SO42- 常用于含砷、
12、锑元素的有机药物的前处理，所得金属离子为低价态。凯氏定氮法就是以硫酸硫酸盐为基础的含氮有机化合物定量分析的常用方法。即将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，将其中含碳的有机结构被氧化分解成二氧化碳和水，有机结合的氮则转化成为无机氨，并进一步与过量的硫酸反应生成硫酸氢铵或硫酸铵，直到混合物变得无色透明后分解完成。接着向溶液中加入氢氧化钠进行碱化后释放氨气，并随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收，最后用标定过的酸或碱滴定液滴定，从而计算出总氮量。凯氏定氮法又可分为常量法、半微量法、微量法三种，而实际运用中主要使用前两种，实际流程即为消解、蒸馏、滴定、计算。消解过程反应一般较缓慢，因此，常在硫酸
13、中加入硫酸钾或硫酸铵以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，提高反应速度，促进反应。常用的催化剂有汞或汞盐、硒粉、铜盐、二氧化锰等。其中汞或汞盐虽催化作用最强，但是由于汞盐易与氨生成硫酸铵汞配位化合物，所以不使用；另因样品中有卤素存在时，卤素可与汞结合成难离解的卤化汞而失去催化作用，所以使用时要特别注意。另外，值得注意的是，辅助氧化剂的使用应慎重，不能在高温时加入，应待消解液放冷后加入，并再次加热继续消解。仪器装置 凯氏烧瓶为 30-50ml（半微量）或 500ml（常量法）硅玻璃或硼玻璃制成的硬质茄形烧瓶；蒸馏装置（半微量法）由 1000ml 的圆底烧瓶（ A） 、 （B ） 、连有氮气
14、球的蒸馏器（C ） 、漏斗（D） 、直形冷凝管（E） 、100ml 锥形瓶（ F）和橡皮管夹（G 、H）组成，见图 6-1。常量法 取供试品适量（约相当于含氮量 25-30mg） ，精密称定，若供试品为固体或半固体，滤纸称取，并连同滤纸置于干燥的 500ml 凯氏烧瓶中，然后依次加入硫酸钾（或无水硫酸钠）10g 和硫酸铜粉末 0.5g，再沿瓶壁缓缓加入硫酸 20ml；在凯氏烧瓶口放一小漏斗，并使凯氏烧瓶成 45斜置，用直火缓缓加热，使溶液的温度保持在沸点以下，等泡沸6停止，强热至沸腾，使溶液成澄清的绿色后，除另有规定外，继续加热 30 分钟，放冷，沿瓶壁缓缓加水 250ml，振摇使混合，放冷后
15、，加入 40%氢氧化钠溶液 75ml，注意使沿瓶壁流至瓶底，自成一液层，加锌粒防止暴沸，使用氮气球将凯氏烧瓶与冷凝管连接；末端500ml 锥形瓶中装入 2%硼酸溶液 50ml，另滴入甲基红-溴甲酚绿混合指示液 10 滴；将冷凝管的下端插入硼酸液的液面下，轻轻振摇凯氏烧瓶，是溶液混合均匀，直接加热蒸馏， ，至接收液的总体积约为 250ml 时将冷凝管尖端提出液面，使蒸气冲洗约 1 分钟，用水淋洗尖端后停止蒸馏；馏出液用硫酸滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验校正。半微量法 消解操作基本同于常量法，不同的是所取的供试样约相当于含氮量 1.0-2.0mg
16、，使用 30-50ml 的干燥凯氏烧瓶，硫酸钾（无水硫酸钠）的量 0.3g 与 30%硫酸铜 5滴，沿壁流下的硫酸 2.0ml。蒸馏与滴定操作如下：取 2%硼酸溶液 10ml，置 100ml 锥形瓶中，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液 5 滴，将冷凝管的下端插入液面下，将凯氏烧瓶的内容物经由漏斗进入蒸馏瓶，使用少量的水淋洗凯氏烧瓶及漏斗，再加入 40%氢氧化钠溶液10ml，用少量水再次漏斗数次，即开始进行蒸气蒸馏，至硼酸溶液开始由酒红色变为蓝绿色起，继续蒸馏 10 分钟后，将冷凝管提出液面，使蒸气继续冲洗约 1 分钟，用水淋洗尖端后停止蒸馏。馏出液用硫酸滴定液（0.005mol/L）滴定至溶液由蓝
17、绿色变为灰紫色，并将滴定结果用空白试验校正。图 6-1 半微量氮测定法装置图应用范围 中国药典中应用本法用于测定含氨基或酰胺结构的药物含量，对于以偶氮或肼架构存在的含氮药物，在消解过程中易于生成氮气有所损失，则在消解前加锌粉还原后再处理；杂环中的氮，难断裂，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再进行消解。某些含氮量较高的样品（超过 10%），可在消解液中加入少量多碳化合物，如淀粉、蔗糖等作为还原剂，以利于氨转变为氨。72. 干法破坏1）高温炽灼法本法系将有机药物灼烧灰化以达分解的目的。本法主要适用于湿法不易破坏完全的有机物（如含氮杂环类有机物）以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物，不适合用于含易挥
18、发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏。高温炽灼法主要用于含卤素药物的鉴别，亦用于含磷药物的定量测定和药物中砷盐的检查。根据分析对象的不同，常使用无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氢化锌等辅助灰化，方法如下：（1）含碘药物的鉴别：将样品置于坩埚中直火灼烧，或与无水碳酸钠混匀后，炽灼成紫色的碘蒸气产生。（2）含氟、氯、溴等元素药物的鉴别：将适量样品置于坩埚中，加入无水碳酸钠（或碳酸钠-碳酸钾混合物）混合，灼烧直至完全灰化，加水溶解后鉴别。（3）含磷药物的定量测定：如甘油磷酸钠注射液的含量测定：精密量取本品稀释液1ml，置坩埚中，加氧化锌 1g，加热碳化后在 600 。 炽烧 1h，放冷，加水与盐酸各
19、5ml，加热煮沸时溶解后，用钼蓝比色法测定。（4）砷盐的检查：有机结合的砷经与无水碳酸钠共热转化成为无机砷盐，依法检验。主要用于高分子化合物（如右旋糖酐铁）或植物提取物（如大豆油）中砷盐的检验，亦应用于少数有机药物（如布美他尼等）。操作中应注意炽烧温度不宜超过 700 .，温度过高导致砷酸盐挥发。2）氧瓶燃烧法本法适用于含卤素或硫、磷等元素的有机药物的鉴定、限度检查或含量测定，同时应用于药物中杂质硒的检测。系将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的待测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据待测物质的性质，采用适宜的分析方法进行分析、测定。本法是快速分解有机物的简单方法，不需
20、要复杂设备，就能使有机化合物中的待测元素定量分解为离子型。该方法被各国药典所收载。（1）仪器装置 燃烧瓶为 500ml、1000ml、或 2000ml 磨口、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞严密、空心、底部熔封铂丝一根（直径为 1mm），铂丝下端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的 23 ，如下图 6-2 所示。8燃烧瓶容积大小的选择，主要取决于被燃烧分解样品量的多少。通常取样量为 10-20mg，使用 500ml 燃烧瓶；加大样品取样量（200mg）使可选用 1000ml 或 2000ml 的燃烧瓶。燃烧瓶在使用之前要检查瓶塞是否严密。图 6-2 A-F 氧瓶燃烧装置及样品包装操作图（2）吸收液的选择：
21、适当的吸收液使样品经燃烧分解产生所需的各种价态的形式，定量地将其吸收并转变为一定的便于测定的单一价态，以选择适应的分析方法。如下几类药物选择的常用吸收液： 含氟药物一般选用茜素氟蓝比色法检测氟含量，一般燃烧产物为单一的氟化氢，可直接选水作为吸收液。 含氯药物采用银量法测定氯含量，燃烧产物亦为单一的氯化氢，但氯化氢在水中的溶解度较低，所以选用水-氢氧化钠溶液作为吸收液。 含溴药物采用银量法测定溴含量，分解产生的溴化氢可与氧气氧化成单质溴，故其燃烧产物为单质溴与溴化氢的混合物，运用水-氢氧化钠溶液构成的吸收液中加入还原剂二氧化硫饱和溶液，将单质溴还原为溴负原子。 含碘药物的测定过程中，分解产生的碘
22、化氢继续与氧作用，生成少量的五价碘（HIO 3）、一价碘（HIO）和微量的负一价碘（HI），以单质碘为主要产物。当使用硝酸银滴定法测定含量时，可用水-氢氧化钠-二氧化硫饱和溶液作为吸收液，均转化成碘化钠（NaI）；若使用间接碘量法测定，用水-氢氧化钠溶液做吸收液，此时待测元素转化成为9碘酸钾（NaIO 3）与碘化钠，可用溴-醋酸溶液将其氧化成为碘酸（HIO 3）后，再加碘化钾使之定量生成单质碘，再用硫代硫酸钠滴定液滴定生成的碘。 含硫药物的燃烧产物主要为三氧化硫，可使用浓过氧化氢溶液与水的混合液作为吸收液，燃烧产物经吸收后转变成为硫酸，加入盐酸溶液并煮沸出去剩余的过氧化氢后，加入氯化钡试液，使
23、硫酸生成硫酸钡，以重量法测定含量。 含磷药物（有机膦酸类）的燃烧产物为五氧化二磷，以水为吸收液，加少量的硝酸溶液并经加热煮沸使焦磷酸（H 4P2O7）和偏磷酸(HPO 3)n转化为磷酸后，采用钼蓝（磷钼蓝）比色法测定含量。 含硒化合物在有机物燃烧分解的同时转化 SeO2(含有少量的 SeO3)，经硝酸溶液吸收后转变为硒酸（H 2SeO4），再用二氨基萘比色法测定。（3）称样 固体样品：研细后，精密称取各药品项下的规定量，置于在无灰滤纸（亦称定量滤纸）（图 3-1B）中心，按虚线折叠（图 3-1C）后，固定于铂丝下端的网内或螺旋处，使尾部露出；液体样品：将供试品滴在透明胶纸和无灰滤纸做成的纸袋中
24、。纸袋的制法：将透明胶纸胶纸剪成规定的大小和形状（如图 3-1D），中部贴一条约为 16mm 6mm的无灰滤纸条，并于其突出部分贴一 6mm 35mm 的无灰滤纸条（图 3-1E），将透明胶纸对折，紧粘住底部及另一边，并使伤口敞开（图 3-1F）；精密称定质量，用滴管将供试从上口滴在无灰滤纸条上，立即捏紧粘住上口，精密称定质量，两次质量之差即为供试样品量；软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹。（4）操作方法 在燃烧瓶中加入规定的吸收液，并将瓶口用水润湿；小心急速通氧气约 1 分钟（通气管口应接近液面,使瓶内空气排尽），立即用表面皿覆盖瓶口，备用。点燃包有
25、样品的滤纸包或纸袋尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，用水少量封闭瓶口，待燃烧完毕（无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全被吸收液吸收，放置 15 分钟，用少量水冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液。同法另需做空白试验。例 6-5 盐酸胺碘酮的含量测定 中国药典（2010 年版） 取供试品约 20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用氢氧化钠试液 2ml 与水 10ml 为吸收液，俟吸收完全后，加溴醋酸溶液（取醋酸钾 10g，加冰醋酸适量使溶解，加溴 0.4ml，再加冰醋酸使成 100ml）10ml，密塞，振摇，放置数分钟，加甲酸约 1ml，用水洗涤瓶口并通入空气流约 35 分钟以除去剩余的
26、溴蒸气，加碘化钾 2g，密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液（0.02mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示剂 1ml，继续滴定至蓝色10消失。并将滴定结果用空白试验校正。每 1ml 硫代硫酸钠滴定液（ 0.02mol/L）相当于0.423mg 的碘。原理：盐酸胺碘酮用氧瓶燃烧分解，转化为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物和碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转化为碘酸盐，过量的溴以加酸及通空气除去。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点。反应式如下：C25H29I2NO3HCl I2O2I2 + 6Na
27、OH NaIO3 + 5NaI + 9H2ONaI + 3Br2 + H2O HIO3 + NaBr + 5HBrIO3 + 5KI +3H2SO4 3I2 + 3SO4 + 5K+ + 3H2OI2 + 6Na2S2O3 2NaI + Na2S4O66.2 药物含量测定方法药物的含量测定需在有效成分鉴别无误和杂质检查合格的基础上进行，是评价药品质量的重要内容之一。用化学方法或物理化学方法测定药物中有效成分的含量，称为“含量测定” ，测定的结果原料药用含量百分比表示，制剂用含量占标示量的百分比表示。用生物学方法或酶法测定药物的效价，称为“效价测定” ，测定的结果一般用效价单位（U）表示。本节仅对前种依据药物的理化测定法进行简要介绍，含量测定方法多种多样，其中容量分析法、光谱分析法和色谱法是中国药典 （2010 年版二部）收载最多的方法，下面分别加以概述，这些方法的具体应用将见诸于后续各章各类药物的分析中。6.2.1 容量分析法1. 容量分析法的特点容量分析法（也称滴定分析法）是将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到待测药物的溶液中，直到所滴加定液与被测药物按化学计量反应为止（通过适量方法指示） ，然后根据滴定液的浓度和消耗的体积，按化学计量关系就可以计算出被测药物含量的分析方法。药典中常用的容量分析法有酸碱滴定、非水滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法、氧化还原滴定法等。
