1、1 高效降解茶皂素菌株的分离鉴定及其发酵优化研究2 任泽文 1 肖志红 2 吴红 2 赵梦瑞 1 彭映辉 1 方勤敏 1 黎继烈 13 （中南林业科技大学 1，长沙 410004）4 （湖南省林业科学院 2，长沙 410004）5 摘 要 6 从自然发酵的油茶饼粕中筛选到一株对油茶饼粕中茶皂素具有较强的降解能力的菌株L-7 2。通过菌株的形态学鉴定和ITS 8 rDNA序列分析确定该菌株的系统发育地位。研究了固态发酵中发酵时间、发酵温度、初始9 含水量和初始加酸量对该菌株降解油茶饼粕中的茶皂素的影响。结果表明：菌株L-10 2为黑曲霉（Aspergillus 11 niger），经过单因素实验
2、和响应面实验优化后的最适降解条件为发酵温度31.3，发酵时12 间103.5 h，初始加酸量4.57 mL，初始含水量80%，此条件下可使黑曲霉L-13 2对油茶饼粕中茶皂素的降解率达到93.96% 。14 中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：15 关键词 油茶饼粕 黑曲霉 固态发酵 茶皂素16 the study of Isolation and Identification of Tea Saponin Strain in a Highly 17 Efficient Degradation and Optimization of its Fermentation18 Re
3、n Zewen1 Xiao Zhihong2 Wu Hong2 Zhao Mengrui1 Peng Yinghui1 Fang Qinmin1 19 Li Jilie120 (Central South University of Forestry and Technology1, Changsha 410004)21 (Hunan Academy of Forestry2,Changsha 410004)22 Abstract: A strain L-2 ,which screened out from naturally fermented camellia cake has stron
4、g 23 ability to degrade tea saponin in Camellia oleifera.The strain was identified on the basis of 24 morphological characteristics and the ITS rDNA gene sequence analysis.The experiment studied 25 the effect of the degradation of tea saponin in the solid-state fermentation ,which under the 26 diffe
5、rent condition of fermentation time,fermentation temperature, initial water content, and initial 27 acid addition.The results showed that L-2 was Aspergillus niger .And the optimum degradation 28 condition of the strain were fermentation temperature 31.3C, fermentation time 103.5 h, initial 29 acid
6、addition amount 4.57 mL, and initial water content 80%, which was optimized by single 30 factor experiment and response surface.Under the optimum conditions,the degradation rate of tea 31 saponin reacherd 93.96%.32 Key words camellia cake, Aspergillus niger, solid state fermentation, tea saponin3334
7、353637383940 基金项目：湖南省科技重大专项（2016NK1001）41 收稿日期：2018-06-2642 作者简介：任泽文，男，1994年出生，硕士，生物资源学43 通信作者：黎继烈，女，1959年出生，教授，博士生导师，农产品加工45 油茶（Camellia 46 oieifera），山茶科山茶属，为常绿小乔木或灌木，是我国南方主要的一种木本食用油料树47 种 1。油茶加工后产生了大量的油茶饼粕，未能得到充分的利用 2。油茶饼粕营养丰富，48 蛋白质含量在15%以上，适合作为微生物发酵的基质 3-49 5。但是油茶饼粕中的茶皂素含量一般在15%25% ，还存在少许的单宁、植酸等
8、抗营养成50 分，导致其在饲料方面的应用受到一定的限制 6。因此，寻求一种高效、安全的降解油茶51 饼粕中茶皂素的新方法尤为重要。利用微生物降解油茶饼粕中的茶皂素具有安全、高效、52 环保的优点，因此越来越受到研究人员的关注。目前，国外对于油茶饼粕中的茶皂素的降53 解的研究较少，国内对于油茶饼粕的研究较多，已有部分细菌和真菌被应用于茶皂素的降54 解研究上，如地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus 55 amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas 56
9、 aeruginosa）和桔青霉（Penicillium citrinum）等菌种，降解率在60%75%之间 7-57 11。本研究旨在筛选到能够更高效降解茶皂素的菌株，探究其固态发酵降解油茶饼粕中茶58 皂素的条件，为提高油茶饼粕的利用提供参考依据。59 1材料与方法60 1. 1材料61 油茶饼粕：湖南省林业科学院提供，105烘干粉碎后过40目筛，茶皂素含量为13.8%62 ；63 1.1.1 培养基64 真菌分离培养基 12：葡萄糖2%,琼脂2% ，KH 2PO4 0.1%，MgSO47H 2O 65 0.1%，链霉素30g/mL，pH自然。66 PDA培养基：去皮马铃薯200 g, 葡
10、萄糖20 g,琼脂15 g20 g,蒸馏水1000 mL,pH自然。67 PDA液体培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水1000 68 mL， pH自然（添加20颗小玻璃珠）。 69 油茶饼粕发酵培养基：30 g油茶饼粕，24 mL蒸馏水，pH自然。做法：3 0 70 g油 茶 饼 粕 添 加 24 mL蒸 馏 水 在 不 锈 钢 盆 子 里 拌 匀 并 覆 盖 一 层 保 鲜 膜 ， 静 置 30 71 min， 使 油 茶 饼 粕 与 水 混 合 均 匀 后 装 进 组 培 瓶 中 ， 121 灭 菌 20 min。72 1.1.2试剂与仪器73 真菌DNA试剂提取盒；无
11、水乙醇、香草醛、浓硫酸、氯化钠等均为国产分析纯；电子74 分析天平：梅特勒托利多仪器有限公司；CJ-75 1D洁净工作台：天津市斯泰特仪器有限公司；高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公76 司；SPX 智能型培养箱：宁波江南仪器厂；电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司77 ；自动高压灭菌锅：SANYO Electric Co.Ltd；PHS-78 3C精密酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；V-79 5100型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；80 1.2 方法81 1.2.1茶皂素含量及其分析方法82 茶 皂 素 的 提 取 方 法 采 用 微 波 辅 助 法 13， 测 量
12、 方 法 采 用 香 草 醛 -浓 硫 酸 显 色 法 14。83 1.2.2降解茶皂素菌种的筛选84 初筛：取自然发酵的油茶粕，准确称取10 g样品用90 mL无菌水稀释并震荡20 85 min，梯度稀释涂布到分离培养基上，30培养3 86 d，根据单菌落大小、表面结构、质地、光泽和颜色等特征，挑选形态特征差异明显的单菌87 落进行划线纯化，编号并保存。88 复筛：将上述实验所得菌株接种于PDA液体培养基中，30培养1 89 d后接种至油茶饼粕培养基中，30固态静置发酵,发酵72 90 h后测量茶皂素的含量，计算其降解率，并判断菌株降解茶皂素能力的强弱。91 1.2.3 菌株的鉴定92 1.
13、2.3.1 菌株的形态学鉴定93 按照真菌鉴定手册 15和中国真菌志 16的方法，将L-94 2菌株的孢子接种于PDA培养基平板上，30培养，分别于第 5 d和第 10 95 d观察菌落的颜色、质地、表面纹饰和生长速度等特征。96 1.2.3.2菌种的ITS鉴定97 从 PDA 培养基上轻轻刮取培养5 d左右的菌落边缘菌丝体5 98 mg，将其用液氮研磨成粉末状。采用真菌 DNA提取试剂盒提取供试菌株 DNA，引物：ITS99 1（5-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3 ）和 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-100 3）扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序
14、，测序结果在GenBank 中进行 BLAST 101 相似性比对，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining 构建系统发育树。102 1.2.4培养条件优化的单因素实验103 1.2.4.1种子液的培养104 将筛选出的菌种接种至PDA液体培养基中，培养温度为30、转速为180 105 r/min，恒温摇床培养18 h，作为发酵种子液备用。106 1.2.4.2 固态发酵的初始条件107 将油茶饼粕培养基进行灭菌处理后，接种10%的种子液，发酵温度为30，发酵时间108 为72 h。109 1.2.4.3发酵时间选择110 在其他条件不变的情况下，设置发酵温度为30，初始含水量
15、为80%，设置不同的发111 酵时间分别为12、24、36、48、72、96、120 h，之后检测茶皂素的降解率。期间每隔12 112 h摇瓶翻样一次，每个处理重复3次。113 1.2.4.5发酵温度选择114 在其他条件不变的情况下，选择最优的发酵时间，其他条件与处理同1.2.4.3，设置发115 酵温度为24、26、28、30、32、34、36。116 1.2.4.6初始含水量选择117 在其他条件不变的情况下，选择最优的发酵时间和发酵温度，其他条件与处理同1.2.4.118 3，设置初始含水量分别为为60、70、80、90、100、110、120%。119 1.2.4.7初始加酸量选择1
16、20 在其他条件不变的情况下，选择最优的发酵时间、发酵温度和初始含水量，其他条件121 与处理同1.2.4.3，设置不同的初始加酸量分别为0.01 mol/L 的HCl 2、4、6、8、10 mL。122 1.2.5黑曲霉降解油茶饼粕中茶皂素的条件响应面优化123 在 单 因 素 实 验 基 础 上 ， 本 实 验 采 用 Box-124 Bnhnken响 应 面 法 进 行 优 化 分 析 ， 设 计 温 度 、 时 间 和 初 始 加 酸 量 3个 因 素 ， 每 个 因 素 取 三125 个 水 平 ， 以 (-1,0,1)编 码 ， 根 据 相 应 的 实 验 后 ， 运 用 Desi
17、gn Expert 126 软 件 对 所 得 的 数 据 进 行 二 次 回 归 拟 合 后 得 到 二 次 回 归 方 程 ， 然 后 对 各 因 素 的 主 效 应 和 交127 互 效 应 进 行 分 析 ， 得 到 最 优 解 ， 优 化 发 酵 条 件 并 进 行 验 证 ， 最 终 确 定 利 用 黑 曲 霉 降 解 茶128 皂 素 的 最 优 的 发 酵 条 件 。129 2结果与分析130 2.1样品的筛选结果131 通 过 初 筛 得 到 6株 目 标 菌 种 ， 经 过 复 筛 后 得 到 目 的 菌 株 的 降 解 率 ， 目 的 菌 种 对 油 茶132 饼 粕 中
18、 的 茶 皂 素 的 降 解 率 如 图 1所 示 ， 各 菌 株 的 降 解 率 有 较 大 的 差 异 。 因 此 选 取 降 解 率133 最 高 的 L-2作 为 后 续 实 验 的 菌 种 。134135136137138139140141142143144145146147148 2.2菌种的形态学和分子鉴定149 菌 株 L-150 2的 平 板 培 养 正 面 形 态 图 （ 左 边 ） 和 平 板 反 面 形 态 图 （ 右 边 ） 如 图 2所 示 。 0 恒 温 培 养 L151 -152 2,培 养 初 期 ， 培 养 基 表 面 长 出 质 地 疏 松 的 较 干 燥
19、 的 白 色 菌 落 ， 外 观 形 如 丝 状 小 绒 毛 ， 与153 培 养 基 的 结 合 比 较 紧 密 。 5 154 d后 ， 表 面 开 始 出 现 黑 色 孢 子 ， 均 匀 分 布 在 菌 落 中 间 成 熟 部 分 。 菌 株 L-2 rDNA-155 ITS序 列 同 源 性 系 统 发 育 树 如 图 3所 示 ， 菌 株 L-2的 rDNA-ITS序 列 与 黑 曲 霉 Aspergillus 156 niger HQ305563.1相 似 性 达 到 了 99%， 结 合 形 态 学 特 征 鉴 定 为 黑 曲 霉 Aspergillus niger。157158
20、159160161162163164165166167图 2 菌 株 L-2的 平 板 培 养 正 面 形 态 图 （ 左 边 ） 和 平 板 反 面 形 态 图 （ 右 边 ）HQ305563.1 Aspergillus niger L2 Aspergillus nigerJN561261.1 Aspergillus tubingensis KU730351.1 Fungal sp. GQ153050.1 Eurotiomycetes sp. JX232270.1 Aspergillus flavipes KC253957.1 Aspergillus fumigatus AY373864.1
21、 Aspergillus restrictus JN850993.1 Aspergillus penicillioides HF546392.1 Aspergillus oryzae genomicHF548689.1 Aspergillus ochraceus genomic XM 020201184.1 Aspergillus aculeatus 9966703049990.10图1 目的菌种对油茶饼粕中的茶皂素的降解率L-12L-34L-560203405607降解率 (%) 降 解 率168169170 2.3 培养条件的优化171 2.3.1发酵时间对菌种降解茶皂素的影响172 发酵
22、时间对菌种降解茶皂素的影响如图4所示。发酵前期，随着时间的推移，降解率在173 逐步提高；96 174 h后，茶皂素的降解率趋于稳定，达到88.33% 。在油茶饼粕发酵初期，由于黑曲霉可以产175 生一些活性酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纤维素酶等，可以利用其产生的酶对油茶176 饼粕中大分子的营养物质进行降解，有助于黑曲霉L-177 2的生长。发酵中期由于营养物质的消耗，茶皂素作为营养物质提供菌体生长的需要，因此178 发酵中期茶皂素的降解率在不断的上升。发酵后期，油茶饼粕中的营养物质由于大量消耗179 ，不足以为黑曲霉L-2的生长提供保障，茶皂素的降解率也趋于稳定的状态。180 0.8.
23、416.825.3.642.00.60.81.01.21.41023045067089010.2.44.87.29.612.0001010发 酵 温 度 / 发 酵 温 度茶皂素降解率/% 初 始 含 水 量 /% 初 始 含 水 量初 始 加 酸 量 mL 初 始 加 酸 量发 酵 时 间 h 发 酵 时 间181 图4发酵时间、发酵温度、初始含水量以及初始加酸量对于茶皂素降解率的影响182 2.3.2发酵温度对菌种降解茶皂素的影响183 发酵温度对菌种降解茶皂素的影响如图4所示，随着温度的升高，茶皂素的降解率一直184 在升高，在32时，茶皂素的降解率达到了最大值86.12%。温度高于32
24、后，茶皂素的降185 解率下降的趋势很明显。温度对于菌株降解茶皂素的影响比较显著，因此选择最佳的降皂186 温度为32。187 2.3.3初始含水量对菌种降解茶皂素的影响188 初始含水量对菌种降解茶皂素的影响如图4所示，随着含水量的不断增加，茶皂素的降189 解率在不断的升高，在含水量在80%的时候达到最大88.15%。在含水量超过80%以后，茶190 皂素的降解率持续降低。固态发酵中，氧传递对于菌体的生长有至关重要的作用。含水量191 在80%以下，油茶饼粕培养基呈现一种疏松、多孔的状态，这对于氧气的传递有一定的促192 进作用；而随着含水量的升高，固体培养基越来呈现一种紧密的状态，影响氧
25、的传递。含193 水量太低也会导致菌体生长缺水分而不能大量的生长，进而影响茶皂素的降解。因此选择8194 0%的含水量作为最适含水量。图 3 菌 株 L-2 rDNA-ITS序 列 同 源 性 系 统 发 育 树195 2.3.4 初始加酸量对菌种降解茶皂素的影响196 初始加酸量对菌种降解茶皂素的影响如图4所示，随着加酸量的不断增加，茶皂素的降197 解率在不断的升高，在加酸量在4 mL的时候达到最大 89.31%。在加酸量超过4 198 mL以后，茶皂素的降解率持续降低。霉菌的最适生长环境为酸性条件，因此，添加一定的199 酸可以促进黑曲霉的生长，同时可以抑制其他有害微生物的生长，提高了茶
26、皂素的降解率200 。初始加酸量超过4 201 mL以后，降解率随着酸的量的增加而降低，推测降解茶皂素的酶最适pH在加酸量4 202 mL附近，此时的pH=4.58 。203 2.3.5 响应面分析方案和实验结果204 上述单因素实验分别从发酵时间、发酵温度、初始加酸量和含水量分析了不同的因素205 对于黑曲霉L-206 2降解油茶饼粕中的茶皂素的影响，为了更加准确简便的分析不同因素对降解茶皂素的交互207 影响，结合单因素实验的结果进行分析，选取对结果影响较大的3个因素发酵温度（A）发208 酵时间（B ）初始加酸量（C）进行Box-209 Bnhnken实验设计，以茶皂素的降解率（Y ）为
27、响应值在全局范围内进行寻优，实验设计及210 结果，Box-Behnken 实验因素与水平表见表1和Box-Behnken实验设计与结果见表2。211 表1 Box-Behnken 实验因素与水平表212213214 表2 Box-Behnken 实验设计与结果水平因素-1 0 1发酵温度A/ 30 32 36发酵时间B/h 72 96 120初始加酸量C/mL 4 4.5 5实验编号 A B C Y1 -1.000 -1.000 0.000 78.922 1.000 -1.000 0.000 79.123 -1.000 1.000 0.000 88.14 1.000 1.000 0.000
28、81.555 -1.000 0.000 -1.000 84.46 1.000 0.000 -1.000 82.197 -1.000 0.000 1.000 86.888 1.000 0.000 1.000 82.169 0.000 -1.000 -1.000 83.9910 0.000 1.000 -1.000 86.2511 0.000 -1.000 1.000 81.6612 0.000 1.000 1.000 89.2213 0.000 0.000 0.000 93.4414 0.000 0.000 0.000 93.115 0.000 0.000 0.000 94.3116 0.000
29、 0.000 0.000 93.97215216217218219220221 表3回归模型方差分析222 *为极显著（PAC226 ；ABC的二次项 A2、B 2、C 2对茶皂素的降解率的影响都达到了极显著水平（ PFA 22.04 1 22.04 49.65 0.000 2B 57.41 1 57.41 129.29 发酵温度初始加酸量245 。黑曲霉降解油茶饼粕中茶皂素的最佳条件为发酵时间取31.3，发酵时间取103.5 246 h，初始加酸量为4.57 mL，此条件下可使黑曲霉L-247 2对于油茶饼粕种的茶皂素有最佳的降解率，达到93.96%。248 3.2 249 利用黑曲霉发酵油
30、茶饼粕作为微生物饲料添加剂的基质，不仅能够有效去除茶皂素，而且250 由于黑曲霉可产生纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等多种酶系，可以将大分子的营养物质分解251 成为小分子的营养物质，使油茶饼粕的营养物质更加协调，为解决油茶饼粕在饲料方向的252 应用奠定一定的基础。253 3.3 254 本文中的菌株来源于自然筛选，对于油茶饼粕中的茶皂素具有天然的降解优势，黑曲霉L-255 2在自然条件下的降解率达到了60%以上，对比其他的菌种来说，菌种具有一定的优势性；256 固态发酵相比于液态发酵在降解油茶饼粕中的茶皂素更具有优势，推测可能的原因是黑曲257 霉L-258 2是丝状真菌，在固态发酵中能够使油茶
31、饼粕起到蓬松多孔的状态，增大了菌种接触营养和259 氧气的作用，液态发酵对于不溶于水的油茶饼粕的传质传氧有一定的限制作用。261 参考文献262 1胡芳名，谭晓风，刘惠民.中国主要经济树种栽培与利用 M.北京：中国林业出版社263 ，2005264 HU Fangming, TAN Xiaofeng, LIU Huimin. Cultivation and utilization of main economic tree 265 species in China M. Beijing: China Forestry Publishing House, 2005266 2陈莹,刘松柏,何良兴,
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