1、基质辅助激光解析电离 串联飞行时间质谱与电喷雾离子化 四极杆 飞行时间质谱分析蛋白质作者：倪国新 朱镭 马小土 徐学敏 胡晓芳 刘建华 李伟【摘要】 为比较基质辅助激光解析电离 串联飞行时间质谱(MALDITOFTOF) 和电喷雾离子化 四极杆 飞行时间质谱(ESIQTOF) 在蛋白质定性和定量分析方面的性能，分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7 细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明，用 MALDITOFTOF 和 ESIQTOF 方法分别鉴定出 1086 种和 848 种蛋白质，其中相同的蛋白质为 633 种;MA
2、LDITOFTOF 和 ESIQTOF 方法分别找到 38 种和 33 种表达差异在 0.5 倍以上的蛋白质，其中 3 种为相同的蛋白质。实验数据说明，两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性，将两种仪器结合使用，不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率，而且可提高分析的置信度。 【关键词】 等量异位标签， 基质辅助激光解析电离 串联飞行时间质谱， 电喷雾离子化 四极杆 飞行时间质谱， 定性分析， 定量分析1 引 言基质辅助的激光解析电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)是目前用于多肽和蛋白质电离的两种主要方法。这两种方法在多肽离子化方面具有很大的互补性1。研究表明，MALDI
3、有利于碱性氨基酸残基的离子化2，ESI 有利于疏水氨基酸残基的离子化3。ESI 源由于可与液相色谱分离的洗脱物在线连接，因此已成为蛋白质组学分析中广泛采用的离子化方式。但这种分析流程受到质谱分析的循环时间限制。近年来，LCMALDI技术的推广显著扩展了 MALDITOFTOF 在高通量蛋白质组学研究中的应用范围。由于多肽洗脱峰是离线收集的，因此不受质谱分析循环时间的限制。现阶段蛋白质组学定性和定量研究主要采用“鸟枪法”(Shotgun)进行，保证定性和定量的特异性的同时提高蛋白质鉴定的覆盖率，是一个迫切需要解决的问题。定量蛋白质组学是功能蛋白质组学研究的重要组成部分。稳定性同位素标记结合在线或
4、离线的液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)分析是目前定量蛋白质组学研究所采用的主要技术路线之一。常见的稳定性同位素标记方法包括 SILAC(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)体内代谢标记4、ICAT(Isotopecoded affinity tags)5、iTRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)6、体外化学标记及 18O 稳定性同位素标记7，8。SILAC 只适合细胞培养条件下进行氨基酸掺入标记，ICAT 方法只能用于含有半胱氨酸的多
5、肽标记和两组样品间的比较。iTRAQ 可高效率标记赖氨酸残基和 N 末端的氨基，能同时进行 48 种样品的比较分析，而且适用于所有来源的蛋白质样品，因此在进行多个样品分析时具有明显优势。MALDITOFTOF 和 ESIQTOF 是 iTRAQ 标记样品分析中常用的仪器，这两种仪器不仅采用不同的离子源，而且质量分析器构成也不同。前者的质量分析器是由两个飞行时间(Time of flight, TOF)分析器组成，后者的质量分析器则由一个四极杆和一个 TOF 质量分析器组成。已有研究者对上述两种仪器在大肠杆菌 DNA 结合蛋白质鉴定上的性能进行过比较9，但至今未见有关两种类型仪器在复杂蛋白质混合
6、物定量分析上的性能比较报道。为了比较这两种仪器在 iTRAQ 标记样品分析中的性能，本实验设计利用 iTRAQ 标记的雌二醇刺激前后的 MCF7 细胞内蛋白质来评估MALDITOFTOF 和 ESIQTOF 的分析性能。2 实验部分2.1 仪器与试剂HP1200 毛细管液相色谱系统(美国 Agilent 公司); QStar XL MS/MS 系统、Tempo NanoLC 分离点靶系统和 4800 MALDITOFTOF 蛋白质分析仪(美国 Applied Biosystems 公司)。雌激素受体阳性(ER+)的人乳腺癌细胞株 MCF7( 上海市肿瘤所);RPMI1640 培养基干粉、胎牛血
7、清和胰蛋白酶(美国 Gibco 公司);17雌二醇(17oestradiol, E2，美国 Sigma 公司);蛋白浓度测定试剂 Dc Protein Assay(美国 BioRad 公司);iTRAQ Reagent MultiPlex Kit(美国 Applied Biosystems 公司);HPLC 级超纯水和乙腈(美国 Merk 公司);其它试剂均为色谱纯。2.2 实验方法2.2.1 细胞培养与蛋白质抽提 MCF7 细胞株用含 10%胎牛血清的RPMI1640 培养液在含 5% CO2 的 37 孵箱中培养，用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化传代。17 雌二醇用无水乙醇溶解后制成 1.
8、0 g/L 的储存液，于-80 冰箱中保存备用。细胞实验分为溶剂对照组(加 10 L 乙醇)和 10 nmol/L E2 处理组。将细胞传代于 2 个 10 cm 培养皿中，待细胞生长至约 50%60%聚合度时，分别加入上述试剂，继续培养 24 h 后，收集细胞。清空各组培养皿中的培养基后，分别用 4 预冷的 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤 3 次，再将细胞刮下，转移至洁净的 1.5 mL 离心管中，离心后弃上清液。每管中加入 200 L 0.5 mol/L 碳酸氢三乙酰胺裂解液，超声波破碎 3 次(每次 10 s)，低温高速离心后，取上清液。测定各组蛋白的浓度后，-80 保存
9、备用。分 析 化 学第 37 卷第 9 期倪国新等：基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化 四极杆 飞行时间质谱分析蛋白质 2.2.2 蛋白质酶解与 iTRAQ 化学标记 每组样品取蛋白质 100 g，分别置于洁净的微量离心管中，按 iTRAQ 标记试剂盒所提供的实验方案，进行半胱氨酸的封闭、胰蛋白酶酶解和含 114，115 报告基团的 iTRAQ 试剂标记，最后混合标记好的两组样品。2.2.3 LCQTOF 分析与数据处理 标记好的混合多肽进行真空干燥除去有机溶剂，用 1 mL 上样缓冲液(10 mmol/L KH2PO4，pH 3.0)稀释后加载到 PolySulfoethyl
10、 A 强阳离子交换柱(50 mm0.32 mm, 5 m, PolyLC, Columbia, MD)上，用 1 mL 上样缓冲液洗去裂解和标记过程中使用的 TCEP，SDS，CaCl2 和 iTRAQ 试剂后，用含有 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 300 和 500 mmol/L KCl 的上样缓冲液步进式洗脱柱上吸附的多肽，并分步收集洗脱下来的多肽(每个组分约 500 L)，最后用离心式真空干燥装置抽干。干燥后的多肽样品用 100 L 含有 0.1% (V/V)甲酸的 2%(V/V)乙腈溶解后，用反相纳升级液相色谱 电喷雾串联质谱进行分析。采用HP120
11、0 毛细管液相色谱，每份样品上样 40 L 到富集柱(5 mm0.3 mm, 5 m, Michrom Bioresources, Auburn, CA)上，用缓冲液 A(含 0.1%甲酸的水溶液)以 10 L/min 的流速脱盐 10 min， 然后在线切换到反相C18 分离柱(5 cm 75 m， 3.5 m, Zorbax 300SB C18, Agilent 公司)。洗脱梯度为： 2%10%的缓冲液 B(含 0.1%甲酸的 90%乙腈)2 min，然后在 80 min 内升高到 50%缓冲液 B 以洗脱多肽，分流前后的流速分别为 160 L/min 和 250 nL/min。从反相色谱
12、柱洗脱出的多肽通过在线连接的 QStar XL MS/MS 系统进行串联质谱分析。分析在信息依赖性获取模式(Information dependent acquisition mode, IDA)下进行。在 IDA 模式下，先进行 m/z 3501700 范围的全扫描，然后选择其中离子强度最高的 4 个离子峰进行二级子离子扫描。子离子谱图在 m/z 1002000 范围内累加 2 s，Q2 设置为增强所有离子模式，动态排除采用150 ppm 的容许范围，排除时间设定为 2 min。将用 AnalystQS 1.1 软件采集到的质谱分析数据导入基于Paragon 算法10的 ProteinPil
13、ot 2.0 软件(Applied Biosystems 公司), 对 IPI 数据库(IPI_HUMAN335.fasta)进行检索鉴定蛋白，报告置信度在95%(Protscore 1.3)以上的蛋白质，同时用 114，115 报告离子的峰面积积分进行相对定量分析，以 114 为对照，按 115 与 114 的离子的峰面积积分比值选择 P0.05 的结果进行报告，上样误差通过软件自带的统计学偏畸值校正(Bias correction)功能进行归一化处理。对具有一个以上高置信度( 99%)唯一多肽匹配的蛋白不再进行人工确认，对不含高置信度( 99%)唯一多肽匹配的蛋白，用手工方法对 MS/MS
14、 图谱碎片离子进行检查确认。2.2.4 LCMALDITOFTOF 分析与数据处理 上述标记样品用缓冲液(10 mmol/L KH2PO4, pH 3.0)稀释 10 倍，上样到 PolySulfoethyl A 强阳性离子交换预装柱上，经上样缓冲液洗涤后，用含 KCl 浓度分别为35， 50， 75， 100， 125， 150， 175， 200， 250 和 300 mmol/L 的缓冲液分步洗脱并分别收集各盐浓度洗脱的多肽。收集到的各组分样品，用含 0.1% TFA 的水稀释后上 CapRod C18(15 cm0.32 mm, 5 m, Merck)反相柱进行梯度淋洗和点靶，流动相和
15、基质(溶解在含 0.1% TFA的 50%乙腈中，浓度为 5 g/L 的 氰4 羟基肉桂酸(CHCA)的流速均为 2 L/min，洗脱梯度为 035%乙腈，洗脱时间为 70 min，靶板上每个点的点样时间为 7 s。多肽的串联质谱鉴定和相对定量分析用美国 Applied Biosystems公司生产的 4800 蛋白质分析仪进行。具体操作参数如下：一级质谱(MS)激光激发 1250 次，在阳离子模式下用反射模式进行检测。选择信噪比大于 50 的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析，每个样品点上最多选择 15 个母离子。二级 MS/MS 激光激发 2500 次，碰撞能量 1 kV, CID 碰撞
16、小室内的氮气压力维持在 210-4 Pa。蛋白鉴定和相对定量分析与前述 QTOF数据处理相同。2.2.5 多肽数据比对分析 多肽的脂肪族常数和疏水性用在线的Expasy 分子生物学服务器的 ProtParam 工具完成(http:/us.expasy.org/tools/protparam.html)。氨基酸在用 MALDI 和 ESI 鉴定到多肽中的出现率用 SAS 软件(SAS Institute Inc.,美国)完成。3 结果与讨论3.1 两种分析方法在蛋白质定性和定量分析上的比较iTRAQ 标记的多肽样品用 QStar XL MS/MS 和 MALDITOFTOF 进行了分析，通过比较
17、获得的蛋白质定性和定量的实验数据发现，两者在定性和定量方面均存在显著差异。QStar XL MS/MS 共鉴定到置信度95%的蛋白质 1481 个，其中 E2 刺激前后差异在 0.5 倍以上的蛋白质33 个。MALDITOFTOF 鉴定到置信度95%的蛋白质 1719 个，其中E2 刺激前后差异在 0.5 倍以上的蛋白质 38 个。对两种仪器获得的数据进行对比发现，两种方法鉴定到的蛋白质中有 633 种是相同的; 找到上调或下调 0.5 倍以上的差异表达蛋白质中有 3 种是相同的。可见，MALDITOFTOF 无论是在定性上还是在定量方面均较 QStar XL MS/MS找到蛋白质多。文献9也
18、得出过相似结论。这可能与 MALDI 采用了离线的液相色谱分离方式，而 QStar XL MS/MS 采用在线的 LCMS/MS 串联方式有关。MALDITOFTOF 获得的子离子系列不仅离子强度较高，而且较为完整。比较两种方法找到相同蛋白质的差异表达情况(表 1)可见，蛋白质变化的方向是一致的，其中 E2 处理引起 MCF7 细胞中胰蛋白酶原 C 和 1型胰蛋白酶的含量降低，引起细胞内 EIF4A1 的含量显著升高。其中用QStar XL 获得的两种蛋白质下调的幅度和 EIF4A1 上调的幅度较MALDITOFTOF 检测到的变化幅度大。对两种不同类型仪器获得的多肽串联图谱(图 1)进行比较
19、发现，用 MALDITOFTOF 分析获得的子离子强度较用 QStar XL 获得的子离子强度要高，得到的 y 离子序列较完整，这可能与 MALDITOFTOF 采用高能碰撞(High collision induced dissociation, HCD)以及检测灵敏度较高有关。QStar XL 得到的 b 离子序列较 MALDITOFTOF 完整。根据文献11，12报道，这主要与碰撞诱导解离的方式有关。表 1 用 MALDITOFTOF 和 QTOF 找到的差异表达蛋白3.2 两种分析方法在多肽鉴定分析上的比较比较两种方法鉴定到置信度95%的多肽发现，ESIMS/MS 鉴定到 1660 种
20、多肽，MALDITOFTOF 鉴定到 1169 种多肽。其中 1096 种为ESIMS/MS 独有，605 种为 MALDITOFTOF 独有，564 种为两种方法共有。此结果与以往 MALDITOFTOF 鉴定多肽的数目显著高于 QTOF 的报道相反9。从结果可表 2 用 ESI QTOF 和 MALDITOFTOF 鉴定到多肽的分子量比较Peptide molecular weight (Mw)LowHighAverageMALDI0.042899.453789.071657.9ESI0.001399.218508.492028.2 以看出两种技术路线结合起来能够显著提高多肽鉴定的覆盖率。
21、通过比较两者鉴定到多肽的质量误差(表 2)可见，用 ESIMS/MS 得到多肽的质量误差(平均为 0.001 Da)低于用 MALDITOFTOF 得到多肽的质量误差(平均为 0.042 Da)。这与 ESIMS/MS 采用了全过程内参自动校正功能而 MALDITOFTOF 只在 MS 方式下进行分析前的一次校正有关。ESIMS/MS 得到多肽的分子量上限高于 MALDITOFTOF 的分子量上限，这与 ESI 的多价电荷产生功能有关，在本实验中，ESIMS/MS 的检测范围设定在 m/z 3001680，而 MALDITOFTOF 设定为 m/z 9004000 ，上述实验结果与文献9一致。
22、比较多肽的性质(表 3)可以发现，ESIMS/MS 和 MALDITOFTOF方法鉴定到多肽的 C 末端为 R 的多肽较 K 为多，两者的 K/R 比率分别为0.83 和 0.85, 这与文献9的结果不同。这可能是由于文献9中分析的是大肠杆菌中的 DNA 结合蛋白(DNA 结合蛋白大多为偏碱性的蛋白质)，而且多肽和蛋白质的数目均显著低于本研究所致。ESIMS/MS 较MALDITOFTOF 更易于疏水性多肽的离子化，这与文献9的结果相同。本研究中 ESIMS/MS 鉴定到的多肽共由 163330 个氨基酸残基组成，MALDITOFTOF 方法鉴定到的多肽由 82210 个氨基酸残基组成。对不同
23、氨基酸残基在总氨基酸数目中所占的比例进行比较(图 2)发现，ESI 倾向于离子化含疏水性氨基酸(A，F，G，I，L，P，V)较多的多肽，这与文献3报道的结论一致;MALDI 倾向于离子化含酸性氨基酸(D，E，N，Q)以及含羟基基团(S，Y)的多肽，这一现象还未见报道。 图 2 不同氨基酸残基在用 MALDITOFTOF 和 QTOF 鉴定到的多肽中的比例4 结 论在线 LCESIMS/MS 和离线的 LCMALDIMS/MS 是目前蛋白质组学研究中进行高通量定性和定量分析时最常采用的两种方法。本研究比较了 LCESIQTOF(QSTAR XL)和 LCMALDI/TOFTOF 在蛋白鉴定和 i
24、TRAQ 定量分析方面的性能。研究发现，MALDI 有利于含酸性氨基酸和有羟基基团的多肽的离子化，这有待用更多的实验数据进行证实。在蛋白质鉴定方面，尽管 LCESIQTOF 可鉴定到多肽的数目要明显多于 MALDI/TOFTOF ，但通过数据库搜索鉴定到蛋白质的数目却显著低于 MALDI/TOFTOF 。两种方法在蛋白质鉴定和定量方面有很大的互补性，将两种方法结合使用，将能够显著提高蛋白质定性和定量的覆盖率，分析出的交叉部分则有较高的置信度。【参考文献】1 Heller M, Mattou H, Menzel C, Yao X. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2003
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