1、罗布麻叶顶空气相色谱质谱指纹图谱的研究作者：相淞华,宋建平,刘训红,张月婵【摘要】 【目的】建立罗布麻叶挥发性成分顶空气相色谱质谱（HSGCMS ）指纹图谱分析方法,评价不同产地罗布麻叶药材的质量。【方法】采用 HSGCMS 联用技术对不同产地罗布麻叶的挥发性成分进行分析,测定其指纹图谱,确定共有指纹峰,并作模糊聚类分析和相似度评价。【结果】罗布麻叶挥发性成分中含有 14 个特征性指标成分,初步建立了以此 14 个共有峰为特征指纹信息的 HSGCMS 指纹图谱。 【结论】本方法准确可靠,重复性好,可作为罗布麻叶质量评价的依据。 【关键词】 罗布麻叶/化学；挥发性成分/分析；指纹图谱罗布麻叶为中
2、国药典收载的常用中药,系夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetom L.的干燥叶,具有平肝安神、清热利水之功效1 。现代用于治疗高血压、高血脂、冠心病、哮喘、气管炎等疾病有较好的效果2 。罗布麻叶挥发性成分为主要活性成分之一,如芳樟醇有镇静、降血压、抗菌等作用3,薄荷酮和胡薄荷酮有解热、镇痛、抗炎作用4,藏红花醛有较强的抗癌活性5,氧化石竹烯有平喘、镇静、抗癌作用,1 萜品醇有显著平喘功效6,但尚未见有关罗布麻叶挥发油指纹图谱研究的报道。本研究采用顶空气相色谱质谱（HSGCMS ）联用技术对不同产地罗布麻叶的挥发性成分进行分析，现报道如下。1 仪器与试药Agilent 6890/597
3、5B 型气质联用分析仪,G1701DAD.03.00.611工作站,Agilent G1888 顶空自动进样器(美国安捷伦仪器公司),NIST05标准质谱检索库。罗布麻叶各产地样品为实地采集或由当地药材公司提供,编号为：S1 江西,S2 安徽,S3 吉林,S4 山东,S5 山西,S6 江苏,S7 新疆,S8 河北,S9 内蒙古,S10 天津,S11 辽宁,S12 陕西。均经研究者鉴定为夹竹桃科植物罗布麻 Apocynum venetom L.的叶。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。2 方法与结果2.1 分析条件2.1.1 色谱条件色谱柱：HP5MS( 涂布浓度为 5%的苯甲基聚硅氧烷
4、弹性石英毛细管柱,30.0 m250 m0.25 m)；进样口温度：180；程序升温：50保持 20 min,以 4/min 的速率升至 200,保持5 min；载气：He 气,流量：1.0 mL/min,分流比 151。2.1.2 质谱条件电离方式：电子轰击离子源(EI)；离子源温度：230,四级杆温度：150,接口温度：280；电子倍增器电压：1 329.4 V；电子能量:70 eV；扫描范围：45.0650.0 aum。2.2 顶空供试品制备通过对药材粉碎粒度、体积装样量、顶空加热温度及顶空加热时间进行考察,确定罗布麻叶挥发性成分优化的顶空条件：取罗布麻叶粉末(过 40 目筛)3 g,精
5、密称定,置顶空瓶中,密封,放入顶空进样器,120加热平衡 30 min,供测试。2.3 方法学考察2.3.12 h 记录图取罗布麻叶挥发性成分进样分析,结果表明：60120 min 无出峰,提示 50 min 内挥发性成分出峰完全。2.3.2 精密度试验取罗布麻叶(S2)挥发性成分进行分析,连续进样5 次。结果表明：14 个指标成分群保留时间的相对标准偏差均小于 0.21%,相对含量的相对标准偏差均小于 5%,提示仪器精密度良好。2.3.3 稳定性试验取罗布麻叶(S2)挥发性成分进行分析,分别在1、3、6、24、48、120 h 进样 6 次,得 14 个主要特征峰保留时间、相对含量。结果表明
6、：14 个指标成分群保留时间相对标准偏差均小于 0.29%,相对含量的相对标准偏差均小于 5%,提示 120 h 内样品(溶液)稳定性较好。2.3.4 重复性试验取同一批次罗布麻叶(S2)5 份,提取挥发性成分后分别进样分析,得 14 个主要特征峰的保留时间和相对含量。结果表明：14 个指标成分群保留时间的相对标准偏差为 0%1.37%,相对含量的相对标准偏差为 1.83%5.15%,说明重复性较好。2.4 指纹图谱建立样品按选定的顶空条件及分析条件进行分析,测得所有供试品的气相色谱质谱（GCMS ）总离子流图；再对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得质谱图,所有组分质谱数据经计算机处理和 NIS
7、T05 标准质谱图库检索鉴定,并与有关标准谱图核对,初步确定出罗布麻叶挥发性成分中53 种化合物。根据罗布麻叶挥发性成分 HSGCMS 总离子流图所给出的峰数高、峰保留时间和峰面积值等相关参数以及成分鉴定结果,进行分析、比较,制定 HSGCMS 指纹图谱(图 1，见彩图页第 666 页)。2.5 指纹图谱分析2.5.1 共有指纹峰的标定经对挥发性成分 GCMS 总离子流图的分析、比较,罗布麻叶标定 14 个共有峰作为指纹图谱的特征峰,114 号峰化学成分依次为：2 戊烯1 醇、未鉴定、1,2,5,5 四甲基 1,3 环戊二烯、3,5 二甲基苯酚、安息香醛、2 戊基呋喃、顺式氧化芳樟醇、2,6
8、二甲基环己醇、薄荷酮、藏红花醛、 环柠檬醛、胡薄荷酮、大马酮、5,6,7,7A 四氢4,4,7a 三甲基(4H) 苯呋喃酮。以 2 戊基呋喃(6 号峰)为参照峰,分别求出各共有峰与之相比的 值(调整保留时间之比)和各共有峰的相对峰面积(峰面积之比)，见表 1。表 1 罗布麻叶挥发性成分中共有峰的相对保留时间 值和相对峰面积（略）2.5.2 指纹图谱的聚类分析选择罗布麻叶挥发性成分中 14 个比较明显的共有峰,根据表 1 中的数据,采用 SPSS 15.0 软件中的hierarchical cluster analysis 对 12 个罗布麻叶样品进行聚类分析,所用聚类方法为 average l
9、inkage (between groups),距离公式为 square euclidean distance,得不同样品罗布麻叶的聚类分析图。图 2 结果显示：当距离标尺在 1 时,样品 5、6、11,样品 1、3、10,样品 2、9 各归为一类；当距离标尺在 2 时,样品 5、6、11 与样品 4、8 归为一类；当距离标尺在 3 时,样品 4、5、6、8、11 与样品 1、3、10 归为一类,样品 2、9 与样品 7 归为另一类；当距离标尺在 8 时,样品1、3、4、5、6、8、10、11 与样品 2、7、9 归为一类；当距离标尺在 25时,样品 12 才与样品 1、2、3、4、5、6、7
10、、8、9、10、11 即全部聚为一类。2.5.3 色谱峰的重叠率以罗布麻叶 9 号样品图谱为基准,按以下公式计算重叠率=待测样品与标准样品共有的峰数2/(待测样品与标准样品峰数和)100%。分别求得另外 11 种样品色谱峰的重叠率依次为：64.0%、82.5%、72.7%、79.5%、78.9%、75.7%、76.3%、67.6%、64.7%、74.6%、92%。2.5.4 相似度评价将测试数据导入 Excel 表格,采用中位数夹角余弦法计算相似度,进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价。各相似度值如下：S10.959 、S20.925 、S30.977 、S40.986 、S50.991 、S
11、60.957、S70.979 、S80.963 、S90.973 、S100.987 、S110.932 、S120.888 。结果显示，罗布麻叶样品指纹图谱相似度较好,均在 0.88 以上。3 讨论挥发性成分顶空条件的优化：药材粉碎粒度的考察结果表明,60 目药材粉末所得色谱峰峰数比 40 目、30 目药材峰数明显减少,40 目所得色谱峰数峰高较 30 目高,故粉碎粒度选择 40 目药材粉末。体积装样量的考察测定结果表明,1.5 g 药材所测出的色谱峰数较少,2 g 药材峰面积较小,3 g 药材测出的色谱峰较多,峰面积较大,故体积装样量选择 3 g。顶空加热温度的考察测定结果表明,90和 1
12、00加热温度下检出色谱峰的峰数明显减少,110和 120加热检出的色谱峰中后者峰高较高,故样品加热温度选择 120。顶空加热时间的考察测定结果表明,4 个不同加热时间下的峰数相差不多,加热 30 min 的峰高较高,故样品加热平衡时间选择 30 min。不同产地罗布麻叶中均含有 2 戊烯1 醇、未鉴定、1,2,5,5四甲基 1,3 环戊二烯、3,5 二甲基苯酚、安息香醛、2 戊基呋喃、顺式氧化芳樟醇、2,6 二甲基环己醇、薄荷酮、藏红花醛、 环柠檬醛、胡薄荷酮、大马酮、5,6,7,7A 四氢4,4,7a 三甲基(4H) 苯呋喃酮等 14 种主要成分,占挥发性总成分的 60%左右,故以此 14
13、个特征性指标成分作为共有特征峰构建 GCMS 指纹图谱。应用模糊聚类法分析比较,能揭示挥发性成分中特征性成分质量分数的配比关系,更能全面、综合、准确地反映不同产地药材 GCMS 指纹图谱的关系,本实验初步建立了罗布麻叶挥发性成分 GCMS 指纹图谱分析方法,而且方法准确可靠，重复性好，为罗布麻药材的质量评价和 GAP实施提供了科学依据。【参考文献】1国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)M.北京：化学工业出版社,2005:147.2张振杰. 药用罗布麻(红麻)叶的化学成分研究J.中草药通讯, 1974(1): 21.3姚雷.吐露芬芳却为谁J？生命世界,2007(12):64.4刘森,郝保华,李伟泽,等.水凝胶型荆芥油泡沫气雾剂的制备及性质研究J.中草药,2008,39(2)：218.5邓颖,郭志刚,曾兆麟,等. 藏红花的药理研究进展J.中国中药杂志,2002,27(8):565.6范维刚,解成喜,李锋,等.罗布麻叶挥发油的气相色谱质谱分析J.质谱学报,2005,26(2):93.
