1、麻黄碱及其天然衍生物对大鼠海马齿状回突触可塑性的影响【摘要】 目的 观察麻黄碱 (ephedrine，EPH)及其天然衍生物甲基麻黄碱(methylephedrine，ME)和伪麻黄碱(pseudoephedrine，PE)对大鼠海马齿状回突触可塑性(synaptic plasticity)的影响。方法 采用电刺激成年大鼠内侧穿行通路(medial perforant path，MPP)，记录海马齿状回(dentate gyrus，DG)颗粒细胞诱发电位的方法，观察EPH(3、15、45 mg/kg，ip)及其衍生物 ME(10、30、90 mg/kg，ip)和PE(3、15、45 mg/kg
2、，ip)对以诱发电位的群峰电位(population spike，PS)幅度、潜伏期和高频刺激诱导 PS 幅度的长时程增强现象(the long-term potentiation，LTP)为指标的中枢突触可塑性的影响。结果 EPH 可缩短 MPP-DG 通路基础诱发电位的 PS 潜伏期(P0.05)，ME 和 PE则有延长 PS 峰值潜伏期的作用。EPH 和 ME 对以诱发电位 PS 幅度为观察指标的 DG 颗粒细胞兴奋性有促进作用，并对高频(60Hz，60 pulses)诱发的 MPP-DG 通路 PS 幅度 LTP 现象有促进作用(P0.05);PE 作用不明显。结论 EPH 及其天然衍
3、生物 ME 和 PE 可以对以海马齿状回诱发电位和LTP 为观察指标的突触可塑性有不同的调节作用。 【关键词】 麻黄;麻黄碱;甲基麻黄碱;伪麻黄碱;长时程增强现象;齿状回;突触可塑性药用植物麻黄(Ephedra Sinica)广泛分布于宁夏、内蒙古、甘肃等地区，麻黄碱(Ephedrine，EPH)、甲基麻黄碱(methylephedrine，ME)、伪麻黄碱(pseudoephedrine，PE)是其主要的天然药用有效成份。近来药效学实验发现，ME 及其天然衍生物对记忆障碍模型有改善作用1-3。海马细胞诱发电位及长时程增强现象(Long-term potentiation，LTP)作为重要的电
4、生理指标，用以神经细胞突触间信息传递强度及神经细胞突触的可塑性研究4。研究表明，LTP 现象与中枢肾上腺素能神经关系密切5-6。本实验采用电刺激成年大鼠内侧穿行通路(medial perforant path，MPP)，记录海马齿状回(dentate gyrus，DG)颗粒细胞层诱发电位的方法7，观察 EPH 及其两种天然衍生物 ME 和伪 PE 对以诱发电位及LTP 为观察指标的中枢突触可塑性的影响，为宁夏道地药用植物麻黄的经济开发提供药理学依据。1 材料和方法1.1 实验动物 雄性 SD 大鼠，体重 180250g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXY(宁)2005-0001
5、。1.2 试剂 盐酸麻黄碱(ephedrine hydrochloride)、盐酸伪麻黄碱(pseudoephedrine hydrochloride)、盐酸甲基麻黄碱(dl-methylephedrine hydrochloride)均为内蒙古赤峰制药厂生产(批号分别为：020602、020216、020422)。本实验测定得到盐酸甲基麻黄碱 LD50为(243267)mg/kg(ip)。根据 LD50，分别采用 1/3 LD50、1/9 LD50 和1/27 LD50 的实验剂量，即 90、30 和 10 mg/kg。根据文献8-9，设定盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的供试剂量同为：3、15、4
6、5 mg/kg。使用时均以生理盐水按 w/v 比例配制相应浓度，按 1mL/100g，ip 给药。乌拉坦(urethane)，分析纯，按 w/v 比例以注射用生理盐水配成 25% 浓度备用。1.3 主要仪器 大鼠脑立体定位仪(长春锻压设备厂);微电极放大器(FW-2，中国科学院上海生理研究所);电子刺激器(SEN-3201，日本光电公司);刺激隔离器(SS-201J，日本光电公司);刺激和记录电极为自制不锈钢针电极7：直径 0.25mm 的针灸针，外表涂绝缘漆，尖端裸露0.01mm;SMUP-PC 型生物信号处理系统(上海嘉龙教学仪器厂，93 版)。1.4 方法1.4.1 序贯法测定盐酸甲基麻
7、黄碱的 LD50 依照文献10，雄性SD 大鼠 10 只，体重 200250 g。按剂量对数间距 d=0.06，确定给药间距。按照 394、344、300、261、227、198 mg/kg 剂量，分别 ip 给药，观察 1h，室温 25。1.4.2 动物模型制备 依照文献7，大鼠 60 只，体重 180220 g，ip 乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉后，头部固定于立体定位仪上，暴露颅骨，按定位图谱进行定位11。依坐标(人字缝后 1.52.0mm，旁开2.03.5mm)钉入一枚连有导线的钢钉作为刺激电极的无关电极(stimulation indifferent electrodes);记录电极
8、的参考电极(recording reference electrodes)植入颅顶前部皮肉并与地线相连接;按记录电极(前囟后 7.8mm，旁开 4.0mm)和同侧的刺激电极(前囟后3.5mm，旁开 2.0mm)的坐标位置，用牙科钻在颅表面各钻直径约 0.4mm 的小孔后，依照相应电极位置缓慢插入电极记录电极：颅面下(3.20.2)mm，刺激电极：颅面下(3.00.2mm)，与此同时给予刺激(电刺激参数：频率 0.1Hz、波宽 80s，强度 510V)，并记录诱发电位。当记录到特征性群峰电位波形后(图 1)，将刺激频率定 1/60Hz，波宽不变，刺激电压固定在能诱发最大群峰电位峰值刺激电压强度的
9、二分之一(1/2 Max，一般 68V)，持续给予 1.5h 刺激，待系统基线恢复稳定后开始实验。1.4.3 供试药品对基础诱发电位的影响 待系统稳定后，以 1/60Hz刺激频率，1/2 Max 刺激强度引发的诱发电位为基础诱发电位，记录给药前 20min 的基础诱发电位作为标准基线，之后按 0.2mL/100g 体重给药，分别 ip 生理盐水(NS) 组及不同剂量的供试药品，继续记录 60min 的诱发电位。实施给药前后群峰电位(population spike，PS)峰值幅度值、峰值潜伏期与 NS 对照组相应各时间点的差别统计学比较，用以判断不同剂量的 ME 对基础突触传递活动的影响。1.
10、4.4 供试药品对 LTP 的影响 如前所述记录 15min 作为药品的起效潜伏期，一过性给予条件刺激(60Hz，60 pulses，80s 波宽，1/2 Max 刺激强度电压)，维持 1/60Hz 频率、1/2 Max 强度给予刺激，记录60min 的诱发电位，记录此 60min 内群峰电位相对值的变化，比较供试药品与 NS 对照组对诱发 MPP-DG 通路 LTP 的影响差别7。1.4.5 LTP 现象诱发成功的标准 给予一过性的高频刺激 60Hz，30 pluses 诱发 LTP 现象。前 30min 各时间点诱发电位 PS 相对值较给予 LTP条件刺激前增加 20%以上，为 LTP 诱
11、发成功;否则为实验条件不能引发LTP，实验结果不予统计。1.4.6 电极尖端位置的确定 实验完毕后，依普鲁士蓝法确定电极位置12。1.4.7 统计学方法 各供试药品组与 NS 对照组进行各对应时间点的 PS 相对幅值比较7，以及各供试药品组与 NS 对照组进行 PS 相对幅值的 HFS 刺激后 60min 记录时程内均值差别比较。单因素方差分析(One-way Analysis of Variance，ANOVA)及 Dunnetts t test 检验比较意义，P0.05 为差异有统计学意义。结果全部采用 GraphPad InStat(Instant Biostatistics Versi
12、on 3.06)软件实施分析。2 结果2.1 盐酸甲基麻黄碱的 LD50 为 250mg/kg(ip)，95%可信限(243267)mg/kg。2.2 供试药品对基础诱发电位的影响2.2.1 对 MPP-DG 诱发电位 PS 峰值潜伏期的影响 PS 峰值潜伏期的测量，如图 1。记录到正常大鼠在麻醉状态下刺激 MPP 后海马 DG 颗粒细胞层诱发电位的群峰电位(PS)峰值潜伏期为(4.30.64)ms(n=4)。在 ip 45 mg/kg 剂量 EPH 后，出现 PS 潜伏期的缩短，1015min 逐渐稳定，并且此现象出现在其剩余的各时间点记录中，平均缩短 0.10.2ms，为(4.10.34)
13、ms(n=4)。在 ip 90 mg/kg 剂量 ME 后，约 10min 左右出现 PS潜伏期的延长，一般延时 0.10.2ms 不等，在 15min 和 20min 时间点为(4.50.97)ms(n=4)，与对照组差别有统计学意义(P0.05)。此时间点与观察到的大鼠唾液分泌量增加的时间点基本吻合。同样的 PS 潜伏期的延时也出现在 ip 45 mg/kg 剂量的 PE 组中，但 PS 潜伏期的延时现象较 ME 持续时间长，出现较晚。在其余剂量的各实验组中未见 MPP-DG 诱发电位 PS 峰值潜伏期有影响。另外，在试验中观察到的 PS 峰值潜伏期的变化，被用于判断药物作用的最佳作用时间
14、，进而用于判断给予 LTP条件刺激的最佳时间点。在本实验中给予诱发 LTP 条件刺激的时间为 ip药物后 15min。图 1 DG 诱发电位图形(A+B/2：群峰电位幅度测量值;C 值为群峰电位诱发潜伏期)2.2.2 对 MPP-DG 诱发电位 PS 幅度的影响 45 mg/kg 剂量 EPH 在ip 后 1020min 出现 PS 相对幅度值的增强(P0.01)，且这种 EPH-LTP 现象与 EPH 对于 PS 潜伏期的缩短现象相同，可持续后续的各时间点记录中;15 mg/kg 剂量 EPH 在 ip 后可出现短暂的 PS 相对幅度值的增强。在 ip 90 mg/kg 和 30 mg/kg
15、 剂量 ME 后 PS 相对幅值均有约 20%的增高，但与对照组差别无统计学意义。给药各剂量组的 PE 对 MPP-DG 诱发电位以 PS 幅度为观察指标的突触联系强弱变化没有影响。2.2.3 对 MPP-DG 诱发电位 LTP 现象的影响 60min 记录时程内均值差别比较7，除 PE 外，高、中剂量的 EPH 和 ME 对 MPP-DG 诱发电位 LTP现象有促进作用。如图 2 所示，各组均 ip 给药后 15min 作为药物产生作用的潜伏期，之后给予一过性的 HFS 诱发 LTP 现象。45 mg/kg(P0.01)和 15 mg/kg(P0.01)剂量的 EPH 可以增强 LTP 现象
16、。90 mg/kg(P0.01)和 30 mg/kg(P0.01)剂量的 ME 可以增强 LTP 现象。对应时间点 PS 相对幅值统计学比较7，90 mg/kg 剂量的 ME 和 45 mg/kg 剂量的 EPH 对 MPP-DG 诱发电位 LTP 现象有促进作用(P0.05 或P0.01)。3 讨论突触(synapse)是实现神经元间信号传递的结构基础，它的活动是机体整个神经系统功能活动的基础和关键环节。突触在其结构以及功能方面的可变性被称为突触可塑性(synaptic plasticity)13，LTP 作为重要的电生理指标，常用以研究神经细胞突触间信息传递强度及神经细胞突触的可塑性4，L
17、TP 现象与中枢肾上腺素能神经关系密切5-6。细胞外记录到的 MPP-DG 神经通路中海马 DG 颗粒细胞诱发电位，反映了海马 DG 突触传递活动的状态。有学者提出14-15，在海马 DG 颗粒细胞诱发电位的成份中包括 PS 和群体兴奋性突触后电位(population excitatory postsynaptic potential，pEPSP)两个部分(见图 1)，其中群峰电位的峰值幅度(PS amplitude，PS 幅度)的变化是海马 DG 颗粒细胞接受来自 MPP 的诱发电位后自身兴奋性变化的反映。而 pEPSP 的斜率(slop)变化反映了突触间信息传递时的状态。两者在高频诱导的
18、 MPP-DG神经通路 LTP 现象中的变化，常被用以说明海马 DG 颗粒细胞可塑性的变化能力和状态。所以，可认为 PS 峰值幅度的潜伏期的变化的意义，与pEPSP 的斜率变化指标相似，同样可以反映 MPP-DG 神经通路传递联系的强弱变化。本文采用电刺激大鼠内侧穿行通路(MPP)，记录 DG 颗粒细胞层诱发电位为模型，研究 EPH 及其天然衍生物 ME 和 PE 对 MPP-DG 通路神经突触传递活动的影响。结果表明，EPH 和 ME 可以增强 MPP-DG 通路突触后DG 颗粒细胞的兴奋性，并且对条件刺激诱发的 DG 幅度 LTP 现象具有促进作用。表明 EPH 和 ME 可以对以海马齿状
19、回 LTP 为观察指标的突触可塑性有促进作用，而 PE 作用不明显。研究表明 PE 的中枢兴奋作用弱于 EPH8-9。在本实验中观察到PE 对 PS 峰值潜伏期有延长作用，而 EPH 有缩短作用。如果推测 PS 峰值潜伏期的生理意义与 pEPSP 斜率所代表的突触间信息传递强度一样，则其中枢兴奋作用弱于 EPH 可能与 PE 对 PS 峰值潜伏期有延长作用为表现的突触间消息传递过程的强度受到抑制有关，但具体的差别原因仍需要进一步研究。同样，本实验中 PE 对以诱发电位 PS 幅度为观察指标的 DG颗粒细胞基础兴奋性没有促进作用，及对于高频条件刺激诱导的 PS 幅度LTP 现象没有影响，均说明
20、PE 的中枢兴奋作用弱于 EPH。传统药理学认为麻黄碱及其衍生物做为拟肾上腺素药，其作用机制为 、 肾上腺素受体激动剂，并具有促进单胺类神经突触间递质释放的作用。麻黄碱及其衍生物主要的应用在外周，并在常规临床治疗剂量下具有中枢兴奋作用的不良反应16。对于含有麻黄碱类非处方药品(OTC)的中枢及心血管系统的不良反应，一直是此类药物关注的热点内容之一。近期，在动物实验为对象的研究发现，麻黄碱及其衍生物对实验动物记忆障碍模型有改善作用1-2。麻黄碱可以对脑缺氧损伤模型大鼠具有改善学习记忆能力的作用，并具体表现在以促进突触联系建立的相关蛋白质表达为指标的神经可塑性改善方面3。本文结果进一步表明，EPH
21、 及其天然衍生物 ME 对中枢神经突触可塑性有促进作用，可能是其对诸如学习记忆调节产生作用的基础。所以，麻黄碱及其天然衍生物对中枢功能的影响，特别是与学习记忆相关的高级中枢功能的进一步研究，可能对此类药物新的实用价值提供依据。【参考文献】1 常福厚，刘素珍，王艳秋，等. 甲基麻黄碱对小鼠记忆障碍的影响J.内蒙古医学院学报，1999，21(1)：28-30.2 常福厚，刘素珍，辛忠，等. 麻黄碱衍生物对小鼠学习记忆的影响J. 内蒙古医学院学报，2000，22(4)：252-255.3 Nong Xiaoa，Shizhi Lia，Xiaoping Zhang，et al.Effect of eph
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