1、脑缺血后血清 NSE 和 S100 蛋白含量变化与磁共振弥散成像关系【摘要】 目的 对比分析兔脑缺血后磁共振弥散成像（DWI）的信号、大小变化与脑组织神经元特异性烯醇化酶（NSE）和 S100 蛋白血清含量变化的关系，探讨血清 NSE 和 S100 蛋白诊断脑梗死及监测脑梗死动态变化的可行性。方法将制作成功的大脑中动脉栓塞(MCAO)模型兔 30 只分为 6 组，即缺血 1、3、6、12、24、48 h 组，每组 5 只。另取 5 只动物行假手术作为对照组。每组分别于各自时间点进行 MRI 弥散成像，分别测量弥散系数（ADC）值、相对 ADC（rADC）值和异常信号区的相对面积。免疫组化法检测
2、脑缺血不同时间脑组织 NSE 和 S100 蛋白的表达，ELISA 法检测血清 NSE 和 S100 蛋白的含量。结果 兔脑缺血 6 h 后血清中 NSE 和 S100 蛋白含量显著升高，至缺血 24 h 达到高峰，48 h 后下降；DWI 缺血 1 h 显示明显的高信号并伴有 ADC 值的下降，在不同的缺血时间点，各组平均 ADC 值呈先下降后上升的趋势，其中缺血 6 h 时 ADC值最低，以后逐渐升高，48 h 恢复至略高于 1 h 时水平。结论 NSE 与S100 蛋白血清学检测可以作为诊断脑梗死动态变化的一项指标，但不是早期诊断脑梗死的有效方法。 【关键词】 磁共振弥散成像；脑缺血；神
3、经元特异性烯醇化酶；S100 蛋白质 ABSTRACT Objective A contrast analysis was done on the association between diffusion weighted imaging (DWI) signal and its changes as well as neuronspecific enolase (NSE) and S100 protein, and explore the feasibility of the diagnosis of cerebral infarction and monitoring its dynam
4、ic changes by detecting serum NSE and S100 protein. Methods Thirty successfullycompleted middlecerebralarteryocclusion (MCAO) rabbit models were equally divided into six groups; 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h and 48 hgroups. Another five rabbits served as the control. An MRI was done for all groups at th
5、eir own time point, the apparent dispersion coefficient (ADC) and the rADC value and the relative areas of abnormal signal regions were measured. The expressions of NSE and S100 protein in brain tissue were determined with immunochemical assay, serum NSE and S100 protein were measured with enzymelin
6、ked immunosorbent assay (ELISA). Results The serum NSE and S100 protein dramatically increased starting six hours after the occurrence of brain ischemia, reaching the peak at 24 hours, and then declined. DWI showed marked high signal at one hour after ischemia following decrease of ADC value. At dif
7、ferent ischemic time points, the average ADC value in various groups showed a tendency of rising first and then breakdown, during which, the lowest ADC appeared at six hours after ischemia and gradually increased afterward, reached the level of a little higher than at onehourtimepoint level at 48 ho
8、urs. ConclusionA detection of serum NSE and S100 protein can be used as an index of dynamic changes of cerebral infarction, but it is not effective for an early diagnosis of this disease. KEY WORDS Diffusion weighted imaging; Brain ischemia; Neuronspecific enolase; S100 protein 缺血性脑损伤是多种酶和蛋白质共同参与的过程
9、，其中神经元特异性烯醇化酶（NSE）和 S100 蛋白被认为是诊断缺血性脑损伤敏感的神经生化指标1,2。NSE 是一种特异地存在于神经细胞和神经内分泌细胞中的蛋白质，神经胶质细胞和其他脑神经组织中不含 NSE，故 NSE 是神经元损伤的标志酶3。S100 蛋白是一类酸性可溶性蛋白质，主要位于中枢神经系统的星形胶质细胞、少突胶质细胞以及周围神经的雪旺细胞内，是神经胶质细胞的标记蛋白。作为神经系统损伤的特异性标志，NSE和 S100 蛋白在脑脊液或血液中的水平可反映神经系统损伤的程度和范围。本研究应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定兔脑缺血不同时间血清中NSE 和 S100 蛋白的含量，同时分析缺
10、血脑组织磁共振弥散成像（MRDWI ）病变面积、弥散系数（ADC）和相对弥散系数（rADC）的变化，通过对比分析，探讨血清 NSE 和 S100 蛋白诊断脑梗死及监测脑梗死动态变化的可行性。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料来源 选取成年健康新西兰兔 58 只，性别不限，体质量为 2.33.3 kg，由山东农业科学院实验动物中心提供。 1.2 实验动物模型建立和分组 应用线栓法建立大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，所有模型均于缺血 1 h 后行 MR 检查，DWI 上出现异常高信号区作为模型成功的标准4。将制作成功的永久性缺血动物 30 只分为 A1A6 组，即缺血后1、3、6、1
11、2、24 及 48 h 组，每组 5 只。另取 5 只作为对照组（A0） ，线栓插入颈内动脉后即刻退出，其余步骤同实验组。 1.3 MR 扫描方法 采用 GE Signa 1.5 T MR 扫描仪，标准头线圈，在定位像上以视交叉平面为中心行冠状位连续扫描 5 层，层厚 3.0 mm，层距 1.0 mm。DWI扫描参数：TR 7 000 ms，TE 84 ms，FOV 14 cm14 cm，矩阵128128，在 X、Y 和 Z 轴三个方向分别施加扩散敏感梯度（b 值取 0 和1 000 s/mm2） 。A1A6 组分别于缺血后 1、3、6、12、24 及 48 h 时间点行 DWI 检查。各组动
12、物的 DWI 原始图像转到 ADW 2.0 工作站进行图像后处理，Functool 软件重建 ADC 图。采集各模型 DWI 的 ADC，并计算rADC，计算方法为：rADC=（病侧 ADC/对侧 ADC）100%。在 DWI 显示病灶范围最大的层面上测量高信号区的面积，并计算其占同侧大脑半球面积的比率（p 值） 。 1.4 血清 NSE 和 S100 蛋白检测 各组动物在规定的时间点，经心脏穿刺取血 5 mL，4 000 r/min 离心 10 min，取上清，-20 冰箱保存待测。采用双抗夹心 ELISA 法检测血清中的 NSE 和 S100 蛋白含量。试剂盒由天津灏洋科技有限责任公司提供
13、。取出包被有抗 NSE 或 S100 蛋白特异抗体的酶标板，每孔加入100 L 标准品和待测家兔血清，37 温育 60 min。洗涤液洗板 3 次，用吸水纸拍干，加入 100 L 生物素化抗家兔 NSE 或 S100 蛋白抗体，37 温育 60 min。洗涤液洗板 3 次，吸水纸拍干，加入 100 L 辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素，37 温育 30 min。洗涤液洗板 3次，吸水纸拍干。每孔加入 100 L 的 TMP 显色液，置 37 暗处温育15 min，每孔加入 100 L 终止液，30 min 内在酶标仪于 450 nm 波长处读取吸光值，以吸光度值为纵坐标，以标准浓度为横坐
14、标，绘制标准曲线。根据样品吸光值在标准曲线上查出其浓度。 1.4 统计学处理 用 Excel 表格录入数据，所有数据以s 表示。统计学软件采用SPSS 13.0 及 PPMS 1.55。兔脑缺血后不同时间点血清 NSE 和 S100蛋白含量的变化，用多样本均数单因素方差分析及 q 检验。A2A6 各组模型内两个时间点的 ADC 值、rADC 值和 p 值间比较，用配对设计资料 t检验。 2 结果 2.1 缺血不同时间血清 NSE 和 S100 蛋白含量的变化 兔脑缺血 6 h 后血清中 NSE 的含量较 A0 组明显升高，至缺血 24 h达到高峰，48 h 后下降，但仍高于 A0 组（F=4.
15、28,q=5.136.03，P0.05） 。兔脑缺血 6 h 后其血清 S100蛋白的含量较假手术组明显升高，至缺血 24 h 达到高峰，48 h 后下降，但仍高于 A0 组（F=6.25,q=4.676.86，P0.05） 。见表 1。 2.2 缺血组平均 ADC 值、rADC 值和 DWI 高信号区的范围变化 A0 组 5 只动物行 MR 检查均未发现 DWI 高信号及 ADC 值的异常。缺血组缺血 1 h 的 DWI 上均显示明显高信号并伴有 ADC 值下降。缺血 1 h 时感兴趣区（ROI）平均 ADC 值为（55.343.45）10-5 mm2/s，rADC=（70.671.67）。
16、在不同的缺血时间点，各组平均 ADC值和 rADC 值呈先下降后上升的趋势。其中缺血 6 h 时 ADC 值最低，以后逐渐升高，48 h 恢复至略高于 1 h 时水平，其差异均有统计学意义（t=2.926.88，P0.05） 。A2A6 各组内前后两个时间点 p 值差异均有显著意义（t=2.7913.76,P0.05） 。见表 2。 3 讨 论 3.1 NSE 和 S100 蛋白的检测及其临床意义 表 1 血清 NSE和 S100 蛋白水平变化表 2 各缺血时间点高信号区平均 ADC 值和面积的比较生理条件下，体液中 NSE 和 S100 蛋白的含量很低。脑梗死后梗死区的主要病理变化是神经元和
17、神经胶质细胞的变性坏死，当细胞膜的完整性受到破坏，NSE 和 S100 蛋白便从神经细胞中漏出。当毛细血管内皮细胞受损，血 脑脊液屏障被破坏时，二者通过血 脑脊液屏障进入外周血，因而可在外周血中检测到 NSE 和 S100 蛋白浓度的升高6。文献报道，检测兔血清中 NSE 和 S100 蛋白的含量及大脑不同脑区 NSE和 S100 蛋白的表达，可反应脑损伤的程度7。 本实验结果显示，缺血性脑损伤早期（6 h 内） ，血清中 NSE 和S100 蛋白含量较低，在缺血 6 h 后血清中的 NSE 和 S100 蛋白含量显著升高，至缺血 24 h 达高峰，48 h 下降。因此，监测外周血中 NSE
18、和S100 蛋白变化，可了解神经元和神经胶质细胞坏死及血 脑脊液屏障破坏的程度。 3.2 MRDWI 对脑梗死的诊断价值 MRDWI 由于对缺血组织高度的敏感性，成为近年来脑梗死早期诊断的首选检查方法。有文献报道，与常规 MR 比较，DWI 对发病 6 h 以内的病灶能较早发现，有较高的灵敏度，对一些常规 MR 显示欠佳的小病灶或多发病灶，DWI 可清晰显示8。本文结果显示，缺血 1 h 的 DWI 上均显示明显高信号并伴有 ADC 值的下降，在不同的缺血时间点，各组平均ADC 值呈先下降后上升的趋势。其中缺血 6 h 时 ADC 值最低，以后逐渐升高，48 h 恢复至略高于 1 h 时水平。
19、这种变化与缺血区发生一系列病理生理学改变相对应。缺血初期细胞膜的 NaKATP 酶功能失常，细胞内水钠潴留，即细胞毒性水肿，此时 ADC 值降低。缺血 6 h 后，细胞内皮细胞开始坏死，血 脑脊液屏障破坏，水和蛋白漏出到细胞外间隙，即血管源性水肿，ADC 值又逐渐升高。缺血后 DWI 高信号面积随缺血时间延长逐渐增大。 3.3 血清 NSE 和 S100 蛋白与 DWI 变化的比较 研究证明，脑梗死灶的大小与脑脊液中 NSE 的水平有关，梗死面积大，脑脊液中 NSE 水平高9，LI 等10的结果表明，急性缺血性卒中病人脑脊液 NSE 明显升高，且后者浓度的变化与脑梗死范围明显相关。本研究显示，
20、梗死面积大小与血清中 NSE 和 S100 蛋白的浓度升高相一致，就此而言血清学检测可以作为脑梗死动态变化的一项指标。血清中NSE 和 S100 蛋白在缺血发生后 6 h 血清含量才出现显著变化，与 ADC值下降后的再升高同步，反映了血 脑脊液屏障的破坏和细胞间隙的水肿。DWI 图像在发病 1 h 就可显示明显的弥散加权高信号及 ADC 值的降低，反映了脑缺血后早期的细胞毒性水肿，因此早期诊断脑梗死首选MRDWI ，血清 NSE 和 S100 蛋白含量检测不是早期诊断脑梗死的有效方法。 【参考文献】 1BUTTERWORTH R J, WASSIF W S, SHERWOOD R A, et
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