1、克隆技术的发展过程及应用摘要：本文主要介绍了克隆技术的概念、发展过程、应用、优缺点以及发展前景。关键词：克隆技术、发展、前景0 引言克隆是英文“clone”的音译，是利用生物技术与无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程，科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，含义是无性繁殖。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术” 。作 为 新 世 纪 的 尖 端 科 学 ， 克 隆 技 术 从 它 诞 生 的 那 一 刻 起 就 吸 引 了 众 多 世 人 的目 光 。 目前，克隆技术、基因工程研究正突飞猛进向前发展，基因概念及其理论的建立，打开了人类了解生命并控制生
2、命的窗口。基因研究已成为当前科学研究中最有决定性的领域之一，成为推动生物、食品和制药产业发展的引擎。众所周知，20世纪遗传学的发展举世瞩目，由于遗传学的发展，科学的社会功能以及社会对科学的制约更受关注，从试管婴儿到克隆技术再到人类基因图谱的绘制无不牵动着世人的心。21 世纪是生物技术革命的世纪，克隆技术的应用将促进遗传学，细胞发育生物学，产科学等学科的研究进展，有利于整个世界的科学进步和生活质量的提高，对人类的生活将会产生深远的影响。 1 克隆技术简介克隆技术，是由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。 克隆的英文“clone”源于希腊语的 “kln”（嫩枝
3、） 。1963 年 J.B.S.Haldane 在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“ 克隆 (Clone)”的术语。在园艺学中， “clon”一词一直沿用到 20 世纪。后来有时在词尾加上 “e”成为“clone”，以表明“o”的发音是长元音。近来随着这个概念及单字在大众生活中广泛使用，拼法已经局限使用“clone”。该词的中文译名在中国大陆音译为 “克隆”，而在港台则多意译为“转殖”或“复制”。前者 “克隆”如同 copy 的音译“ 拷贝”，有不能望文生义的缺点；而后者“复制”虽能大概表达 clone 的意义，却有不能精确并易生误解之憾。 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖
4、方式或者自然的无性生殖方式（如植物） 。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一个生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样） 。但是我们通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。我们可将其研究或操作的对象分为基因克隆、细胞克隆和个体克隆三大类。 基因克隆是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物；细胞克隆则是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞；个体克隆则是经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体，这种克隆所用的生物材料可能是一个细胞，也可能是一个组织。可以看
5、出，基因克隆、细胞克隆和个体克隆是在三个不同的层次上开展的研究工作，以原有的基因或细胞或生物个体作为模板，复制出多个与原来模板完全相同的基因或细胞或生物个体来。这就有点像大家利用复印机复印资料，或用胶片冲洗照片一样，从原有的资料或底片复制出许多完全一样的资料或照片来。但实际上并非复制胚胎，只是从成年人体内的一个细胞抽取当中包含的基因资料，然后将植入一个没有核子的卵子细胞内，通过体外受精的方法使这个新细胞发育成一个胚胎。例如小羊多利就是利用体细胞进行细胞核移植而克隆成功的，多利羊的产生与三只母羊有关，其克隆过程如下：科学家选取了三只母羊，先将一只母羊的卵细胞中所有遗传物质吸出，然后将另一只 6
6、岁母羊的乳腺细胞与之融合，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，并促使它分裂发育成胚胎，当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊多利，出生的“羊多”小绵羊与 6 岁母羊具有完全相同的外貌。2 克隆技术的发展过程克隆技术经历了三个发展时期即微生物克隆、生物技术克隆和动物克隆。 （1）微生物克隆：即由一个细菌复制出成千上万个和它一模一样的细菌而变成一个细菌群。 （2）生物技术克隆：如 DNA 克隆。 （3）动物克隆：即由一个细胞克隆成一个动物。 在自然界，有不少植物具有先天的克隆本能，如番薯、马铃薯、玫瑰等插枝繁殖的植物。而动物的克隆技术，则经历了由胚胎细胞到体细胞的
7、发展过程。克隆技术由德国胚胎学家于 1938 年首次提出的，1952 年科学家首先用青蛙开展克隆实验，之后不断有人利用各种动物进行克隆技术研究，后来科研人员人用哺乳动物胚胎细胞进行克隆取得成功。1996 年世界上第一只克隆羊多利在英国爱丁堡的出世给克隆技术研究带来了重大突破，它突破了以往只能用胚胎细胞进行动物克隆的技术难关，首次实现了用体细胞进行动物克隆的目标，实现了更高意义上的动物复制。自克隆绵羊多利后，科学家又成功地克隆出了猪、鼠、兔、猴、牛以及猴等，他们所用的生物材料也都是体细胞，这对于挽救濒危动物具有重要意义。3 克隆技术的应用3.1 克隆技术应用实例1965 年生物学家童第周对金鱼、
8、鲫鱼进行细胞核移植。1990 年西北农业大学畜牧所克隆一只山羊。1992 年江苏农科院克隆一只兔子。1993 年中科院发育生物学研究所与扬州大学农学院携手合作，克隆一只山羊。1995 年 1.华南师范大学与广西农业大学合作，克隆一头奶牛和黄牛的杂种牛。2.西北农业大学畜牧所克隆六头猪。1996 年 1.湖南医科大学人类生殖工程研究所克隆六只老鼠。2.中国农科院畜牧所克隆一头公牛。（以上为胚胎细胞克隆研究）1999 年 1.中国科学家周琪在法国获得卵丘细胞克隆小鼠，在国际上首次验证了小鼠成年体细胞克隆工作的可重复性，于 2000 年 5 月用胚胎干细胞克隆出小鼠“哈尔滨”，并于 2000 年 1
9、0 月获得第一只不采用“多莉羊” 专利技术的克隆牛。 2.中国科学院动物研究所研究员陈大元领导的小组将大熊猫的体细胞植入去核后的兔卵细胞中，成功地培育出了大熊猫的早期胚胎。1999 年和 2000 年扬州大学与中科院发育所合作，用携带外源基因的体细胞克隆出转基因的山羊。2000 年我国生物胚胎专家张涌在西北农林科技大学种羊场接生了一只雌性体细胞克隆山羊“阳阳 ”。 “阳阳”经自然受孕产下一对混血儿女， “阳阳”的生产可以证明体细胞克隆山羊和胚胎克隆山羊具有与普通山羊一样的生育繁殖能力。2001 年：使用成年动物体细胞克隆猫和兔子成功。2002 年我国首批成年体细胞克隆牛群体诞生。3.2 我国在
10、克隆技术方面的成就我国早在 80 年代末就已克隆出一只兔子，1991 年西北农业大学发育研究所与江苏农学院克隆羊成功，1993 年中科院发育生物研究所与扬州大学农学院共同克隆出一批山羊，扬州大学的体细胞克隆技术及新型的“制备”技术，不仅把我国哺乳动物的克隆技术推进到可以采用体细胞产生克隆家畜的无性繁殖阶段，而且还可使这种转基因山羊在短期内扩展成一个群体。1995 年华南师大和广西农大合作克隆出牛，1996 年中国农科院畜牧研究所克隆牛获得成功。我国科学家已成功复制了羊颅骨、鸡肌腱和猪关节软骨等组织，这意味着复制人体组织器官研究已进入了一个新阶段。我国的组织器官复制研究即将进入临床实验，人体组织
11、器官复制阶段将在 35 年内将取得更大突破。我国目前已掌握了脐血干细胞分离、纯化、冷冻以及复苏的技术，专家们希望在 2002 年建成世界上最大的可保存 510 万份脐血干细胞样本库，为有相同遗传特征的全球华人患者提供干细胞移植。那时病人只要移植有自我修复功能的干细胞就可治病。中国干细胞的科研人员已利用干细胞技术克隆出人体组织，并将开展人体器官克隆计划。军事医学科学院已体外克隆出了人骨、血液、神经和皮肤等组织，接下来的工作便是克隆更复杂的器官。第一批被列入克隆计划的器官是血管、食道和膀胱。我国在“治疗性克隆”研究领域已获得重大突破，如果研究工作开展顺利的话，几年后就可以克隆出能够应用的人体器官。
12、上海市转基因研究中心有望在 35 年内成功克隆人体器官，以替代人体受损的器官。我国科学家在国际上首次完成了人类下丘脑垂体肾上腺轴这一神经内分泌重要系统的基因表达谱的绘制，同时在下丘脑垂体肾上腺轴克隆了 200 条人类新基因，这表明我国在人类功能基因的大规模研究方面获得重要进展。中国科学院发育生物学研究所研究人员与法国国家农艺学研究所专家合作发明了一种简单高效的成年动物体细胞克隆新技术，并利用它成功地培育出克隆鼠。它利用显微操作技术将植入过程中在卵细胞膜上造成的破损结构切除，既不需要使用培育多利羊的电融合方法，也不需要使用脉冲装置，便可高效地在不对卵细胞核染色的情况下去除卵细胞核，并直接将供体细
13、胞核注入到去核卵细胞中，这样使克隆胚胎受到的损害降至最小。哈尔滨工业大学的科研人员在世界上首次克隆出鸡肌肉生长的抑制基因。四川碧峰峡生态动物园，拟进行克隆大熊猫的工作。如果大熊猫一旦克隆成功，将对挽救这一濒临灭绝的物种做出巨大的贡献，同时也将为其他濒危动物的基因研究提供宝贵的经验。云南大学运用中空纤维反应器技术、抗体纯化技术、免疫层析胶体金显色技术、试纸膜材纸材筛选搭配技术等成功地掌握了从单克隆抗体规模化生产到自主开发生产单抗快速诊断试纸的全套技术，将开发前列腺癌、乙肝、丙肝、性病、艾滋病、重大胎儿缺陷等疾病的快速诊断试纸。一系列单克隆抗体生殖健康诊断试纸已在云南陆续投放市场，这标志我国的单克
14、隆抗体技术实现了突破并进入实用阶段。上海生物化学所的科学家已发现了人类附睾中的一些基因，有望通过控制精子成熟来计划生育和治疗男性不孕。我国科学家成功克隆了遗传性乳光牙本质 II 型病的基因，为遗传性乳光牙 II 型病的诊断和治疗带来希望，标志我国在人类遗传病基因克隆方面的研究取得重大进展。三峡植物园珍稀优良林木无性快速繁育技术攻关已取得阶段性显著成果，运用现代生物技术繁育的猕猴桃、非洲菊、芦荟、彩色马蹄莲等花草树木长势良好，珙桐、秃杉、木莲等珍稀濒危植物的“克隆”工程也展开。中国克隆动物基地在中国国家级农业高新技术产业示范区杨凌成立，这一基地将充分利用克隆技术培育养殖牛、羊良种，并进行深加工，
15、瞄准国际生物高科技前沿并进行研究、开发和产业化攻关。4 克隆技术的利与弊4.1 克隆技术的优点（1）克隆技术与遗传育种：在农工业方面人们了利用克隆技术培养出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。（2）克隆技术与濒危生物保护：克隆技术对保护动物特别是珍惜、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。(3)克隆技术与医学：在当代，医生几乎能在人类所有器官和组织上实施移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排异反应仍是最头痛的事。排异反应的原因是组织不配型导致相容性差异。如果把如果利用
16、克隆技术克隆器官做器官移植，则绝对没有排异反应，因为二者基因相配，组织也相配。克隆技术还可以用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过克隆技术生产出治疗糖尿病的胰岛素，是侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒的干扰素等等。4.2 克隆技术的弊端从道德价值的角度看待克隆人有以下几个方面：一是从社会伦理角度，克隆人是对人类发展的一种过强的干预，可能影响人种的自然构成和自然发展。二是从家庭伦理角度，会加剧家庭多元化倾向，瓦解正常的人伦秩序，改变人的亲系关系，丧失基本的归属感。三是从性伦理学角度，完全改变了人类自然的、基于性爱的生育方式，使人口的产生与性爱分离，破坏人类的感情。四是从
17、生命伦理学角度，破坏了人拥有独特基因的权利，有可能导致人种的退化，还会使正常的生与死的观念发生动摇。 有的学者还从更广阔的视野批判性地反省了克隆技术有可能带来的负面后果，除了上述的道德层面以外，这种还表现在：一是生态层面，克隆技术导致的基因复制，会威胁基因多样性的保持，生物的演化将出现一个逆向的颠倒过程，即由复杂走向简单，这对生物的生存是极为不利的。二是文化层面，克隆人是对自然生殖的替代和否定，打破了生物演进的自律性，带有典型的反自然性质。与当今正在兴起的祟尚天人合一、回归自然的基本文化趋向相悖。三是哲学层面，通过克隆技术实现人的自我复制和自我再现之后，可能导致人的身心关系的紊乱。人的不可重复
18、性和不可替代性的个性规定因大量复制而丧失了唯一性，丧失了自我及其个性特征的自然基础和生物学前提。 克隆人一直遭到全世界绝大多数人的反对原因 首先，克隆人的身份难以认定，他们与被克隆者之间的关系无法纳入现有的伦理体系。其次，人类繁殖后代的过程不再需要两性共同参与，这将对现有的社会关系、家庭结构造成难以承受的巨大冲击。第三，克隆人技术可能会被滥用，成为恐怖分子的工具。第四，从生物多样性上来说，大量基因结构完全相同的克隆人，可能诱发新型疾病的广泛传播，这对人类的生存是不利的。第五，克隆人可能因自己的特殊身份而产生心理缺陷，形成新的社会问题。5 克隆技术的发展前景克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起
19、来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了 10 多年，但目前在全世界范围内仅有 2 例药品进入 3 期临床试验，56
20、 个药品进入 2 期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如 Lag
21、Z 基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke 等（Bio Report，1997）已成功获得6 只转基因绵羊，其中 3 只带有人凝血因子 IX 基因和标记基因（新霉素抗性基因） ，3 只带有标记基因，目的外源基因整合率高达 50。Cibelli（Science ，1997）同样利用核移植法获得 3 头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开
22、发。胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪 ES 细胞转变为跳动的心肌细胞，使人 ES 细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠 ES 细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人 ES 细胞（Thomson 等 1998，Science） ，而体细胞克隆技术为生产患者自身的 ES 细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出 ES
23、 细胞，获得的 ES 细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞） ，用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。参考文献：1 沈明贤 人类基因组理论：问题与前景.医学与哲学， 20102 龙艺.人类胚胎干细胞研究的伦理问题，遵义医学学院报，20023 郭继志，朱亚楠，葛慧芳.关于克隆人的社会伦理问题再思考，中国医学伦理学，20034 李子银，陈受宜.植物的功能基因组学研究进展J.遗传，20025 Jo Seph Sambrook Mulecular CloningM.Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001
