1、Approaches and Techniques in Research on TumorA course for Ph.D. candidates,肿瘤的实验动物和细胞研究技术,The animal model and in vitro research of tumor,常用研究方式：In Vitro: 体外研究，细胞、组织培养下进行In Vivo: 体内研究，人类疾病的动物模型Ex Vivo: 细胞经体外实验处理后，再回输到体内 体外处理：转染基因或改变环境(用一些因子) 使其分化等,体外研究(In Vitro ) 原代培养肿瘤细胞: 从肿瘤组织中分离得到的细胞在体外成功地进行 培养称
2、为原代培养(primary culture)肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约710天传代一次） 半年以上,生长稳定, 并能保持肿瘤细胞的特性， 称为肿瘤细胞系(cell line)肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性 的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cell strain), 细胞具有 相同的基因型和表型(单克隆),肿瘤细胞株的建立： 1、 直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养 建系和建株; (从自发或诱发瘤) 2、从人或动物的移植肿瘤(如人肿瘤裸鼠移植瘤)组织分离 培养建系及建株; (从移植瘤) 3、用化学或生物(病毒)方法在体外转化正常的人或动物
3、的 细胞株而获得肿瘤细胞株。(体外转化),肿瘤细胞株的鉴定： 1. 有关的原始资料,包括供瘤病人的姓名、年龄、性别、病历号、 临床诊断（TNM）、活检病理诊断,手术切除日期、最后病理诊断等 2.形态学观察: 普通倒置相差光镜:活细胞的形态, 细胞间桥,分泌颗粒,重叠生长, Giemsa染色或H.E.染色的光镜 形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系: HeLa: 高浓度血清长梭形; 低浓度血清圆形细胞,排列如鹅卵石路面; 透射和扫描电镜 3D组织结构,3. 核型及染色体观察: 整倍体,异倍体,染色体畸变、标记染色体,染色体分带分析, 相隔一定时间重复观察数次 4.生长特性: 分裂指数（3H-thy
4、midine或5-BrdU的labeling index）、 生长曲线、 细胞群体倍增时间、 集落形成或贴壁率（plating efficiency） 半固体培养介质中的集落形成率 5.组织特性的鉴定: 免疫细胞化学方法,上皮性肿瘤标志: CK、上皮膜抗原（EMA）、 癌胚抗原（CEA）; 淋巴瘤抗原标志: 人白细胞分化抗原簇（CD）,有274个以上, T淋巴细胞: UCHL-1(CD45RO), B淋巴细胞: L26（CD20）, 软组织肿瘤标志：波形蛋白（Vm） 肌源性：结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白 神经源性： 神经微丝（NF）、S-100蛋白、 Leu-7、 神经元特异性
5、烯醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白(MBP) 组织细胞源性： -1抗胰蛋白酶、 -1抗糜蛋白酶、CD68 血管源性：八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素(UL) 基膜源性：纤连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN）体外培养时肿瘤细胞株有可能会失去原本表达的某些组织抗原,抗原标志要多选用几种抗体,以减少假阴性结果;,6. 其他特性： (a) 分泌激素和异位激素: 绒毛膜癌HCG 垂体瘤生长激素 肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌ACTH 人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）促性腺激素 肝癌HCG (b) 肿瘤细胞的受体表达: ER PR AR (c) 酶及同工酶活性: 酶活性保持(HTC酪氨酸氨基转移酶)、变
6、化 诱导剂 糖皮质激素、多肽激素 改变培养条件：谷氨酸替代谷氨酰胺脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶 活性增7倍左右 特异的同工酶谱： 绒癌T3M-3表达胎盘性碱性磷酸酶,(d) 癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达： 高转移人卵巢细胞系HO-8910PM 表达：p53 p16 bcl-2 nm-23 CD44v6 c-erbB-2 EGFR 等基因的蛋白产物 不表达：Bax基因的蛋白产物,7. 细胞株交叉污染的检测： 细胞遗传学方法： 染色体分析 特异的染色体标志探针作FISH G带核型分析鉴别同种肿瘤细胞 Q带分析检测人Y染色体 免疫学方法：HLA或动物的组织相容性抗原的测定 生化方法：同工酶谱或其它
7、生化指标,8. 微生物污染的检测： 细菌：培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体 真菌：培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子 病毒：病毒核酸和蛋白产物 支原体：以核酸（DNA）荧光染色即H-stain(Hoechst 33258， 即二苯并咪唑染色)较为常用, 356nm光的激发下 可发出458nm的强荧光,体外正常细胞恶性转化的鉴定 正常细胞体外恶性转化的鉴定指标(14项指标) （第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过） 核型分析出现非整倍体 能在软琼脂培养基中增殖并形成集落 异种动物接种能生成肿瘤 端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高,指标 正常细胞 转化的纤维母细胞 转化的上皮细胞形态
8、 伸展良好,折光较弱;核质比小, 梭形,伸展较差,折光较强;核质比大, 与正常细胞之间差别不如纤维母细胞 胞质嗜碱性弱;核仁较小较少; 胞质嗜碱性强,核仁较大较多;多核巨细胞 大;多形性较常见 多核巨细胞较少 较多 粘附性 细胞间粘附性较强,紧贴瓶壁生长 粘附性差,易脱落 差别不明显生长特性 排列有方向性,单层生长,存在密度 方向性消失,多层重叠,密度依赖性抑制消失 差别不明显,某些细胞株呈重叠生长 依赖性抑制 对血清的依赖 较高 较低 差别不明显扫描电镜观察 微绒毛少 微绒毛丰富 微绒毛不稳定,有时增多 植物凝集素引起的凝集 弱 较弱 较强细胞表面的糖蛋白和糖脂 正常 糖基化不完全 糖基化不
9、完全纤维连接蛋白 正常存在 减少或消失纤溶酶原激活酶 较低 增高 不稳定,某些株增高胞质中微丝微管的排列 规则 紊乱 不稳定胞质cAMP浓度 较高 较低 核型 二倍体 非整倍体或假二倍体 非整倍体琼脂培养 不生长 生长 生长接种异种易感动物 不长肿瘤 长肿瘤 长肿瘤,世界各国的细胞库（cell bank）及索引 美国 美国典型培养细胞库（American Type Culture Collection, 即ATCC, Rockville,MD） 人与动物细胞培养目录（Catalog of Human and OtherAnimal Cell Cultures, Naval Bioscience
10、s Laboratory, Cell Culture Department, Naval Supply Center, Oakland,CA) 人基因突变细胞及老年细胞培养库（Human Genetic Mutant Cell Culture and Ageing Cell, Culture Repositories, Institute for Medical Research, Camden, NJ) 欧洲 真核细胞培养库(Culture de Cellules Eucaryotes, Repertoire des Utilisateurs., M. Adophe, D. Gourdji,
11、 A.Tixier-Vidal, R. Robineaux, Inserm Publications,101 Rue de Tobiac,75654 Paris, Cedex 13 医学病毒学系（Department of Medical Virology,Institute de Pasteur, Paris) 欧洲动物细胞培养库（European Collection for Animal Cell Cultures,即ECACC, PHLS/CAMR, Porton, Salisbury, England) 欧洲人类基因突变细胞库(European Human GeneticMutant
12、 Cell Bank, Department of Clinical Genetics, Erasmus University, Rotterdam) 日本 癌细胞系库(Collection of Cancer Cell lines, National Institute of Hygenic Sciences, Tokyo) 普通细胞库( General Cell Bank, Institute of Physical and Chemical Research of RIKEN, Saitama) Flow Laboratories; GIBCO,特殊表型肿瘤细胞系（株）： 高转移 人肝细
13、胞性肝癌细胞株MHCC97 人黑色素瘤细胞株MV3、 卵巢癌细胞株HO-8910PM、 肺巨细胞癌细胞株PGBE1 高度耐药 人红白血病细胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增114.7倍 分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子 人肺小细胞癌细胞株LU-165抗利尿激素; 人肺腺癌细胞株LC-2/ad1-抗胰蛋白酶 人红白血病细胞株K562高表达端粒酶,体内研究(In Vivo) 肿瘤动物模型： 自发性肿瘤 诱发性肿瘤 移植性肿瘤.,一、自发性肿瘤 种系：大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见 Sinclair猪到一岁时有85%可发生恶性黑色素瘤 品系： C3H小鼠 乳腺癌发病率为97% BALB
14、/c 乳腺癌发病率低 AKR小鼠 淋巴细胞性白血病发病率为70%90% 近交系SJL/J小鼠 淋巴瘤(何杰金病)自发率高达91% 缺点：发病迟,发病时期不集中,发病率也不稳定,二、诱发性肿瘤 优点：发生率、发病时间、发生部位及组织学类型均易控制 实验结果重复性相对较好 1.化学诱癌动物肿瘤模型 1775年英国医师Pott 扫烟囱 阴囊癌 1914年,日本学者山极和市川 煤焦油 皮肤癌 1934年Yashida用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功 我国从1960年代开始进行化学诱癌动物模型的研究 1956年亚硝胺和1961年黄曲霉毒素的致癌作用相继被发现,(1) 化学致癌物 诱发时间相对较短 有剂量
15、-效应关系 基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性， 与生物大分子中富于电子的亲核残基相结合, 影响硷基对的正常配位或大分子的结构与功能 正常细胞的癌变. 直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）,常见化学致癌物: 1) 多环碳氢化合物: 25种以上, 以煤焦油的主要成分3,4-苯并芘 和3-甲基胆蒽的致癌性最强 2) 氨基偶氮化合物: 二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄(奶油黄), 3-甲基-4,4-二甲基氨基偶氮苯(3-Me-DAB) 3)芳香胺类: 苯胺印染工厂 吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出 联苯胺膀胱癌 2-乙酰氨基芴(2-AAF) 4)亚硝胺类: 亚硝酸盐+二级胺亚硝胺类化合物 强致癌物 致癌
16、谱甚广 不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官亲和性 对称衍生物如二烷基亚硝胺肝癌 不对称的亚硝胺食管癌,5)霉菌毒素: 种类较多 首推黄曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉变的花生、 玉米及谷物中, 6)金属元素 : 砷、铬、镍、肺癌 镉前列腺癌. (2)影响化学致癌的因素,1) 动物方面品系: 诱发肝癌时：F-344大鼠对DEN和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高 诱发皮肤肿瘤：BALB/c和SENCAR品系小鼠对DMNU、DENU的敏感性 大大高于Swiss品系小鼠性别: 2AAF诱发肝癌：小鼠60%发生肝癌,小鼠不敏感. F-344大鼠,比更敏感年龄: 一般而言,动物年龄越小,对
17、化学致癌物越敏感, 敏感性： 胎鼠新生鼠成年鼠,2) 化学致癌物方面剂量阈值: 启动因子（initiator）不表现明显的剂量阈值 促癌因子（promotor）则有剂量阈值 一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用,因此仍可表现有剂量阈值 如3-Me-DAB (60ppm)致癌强度: 诱发大鼠肝癌总剂量: DAB为1000mg 3-Me-DAB为600mg, 2-AAF为250mg, DMN只需100mg;,诱癌潜伏期: 诱发肝癌：AFB1需时约1年, 3-Me-DAB与2-AAF约半年左右, DEN一般只需3个月;诱癌靶器官: 诱癌谱：相对专一，如3-Me-DAB一般只引起肝癌, 较广，如亚
18、硝胺类可诱发多器官肿瘤; 化学致癌物的相互作用: 多数 协同作用而加速致癌, 少数 会产生拮抗作用. 有的化学物质单独使用时本身不致癌,但可增强致癌物作用（促癌物）,3)诱癌方案（carcinogenic regimen）和方法,半年后,12周后,喂正常饲料(代表1周),喂含0.06%3Me-DAB的饲料,喂含0.02%2-AAF的饲料,部分肝切除,苯并蒽(Benzanthracene),直接涂擦皮肤,注射至皮下,产生皮肤癌,产生纤维肉瘤,非基因毒致癌物(non-genotoxic carcinogen) 美国公布的301种化合物中,162种可致鼠类肿瘤 其中 36%不引起细胞DNA的改变 4
19、4%不引起细胞突变 致癌机制？ 促进细胞增殖？ 抑制细胞凋亡？ 其它未知？,2 生物因子诱发动物肿瘤模型 (1) 病毒诱发动物肿瘤模型 1908年Ellermann和Bang 白血病鸡的无细胞滤液诱发鸡白血病获成功 白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、肾癌等,与病毒感染有关 1) DNA病毒 多瘤病毒(PyV) 疱疹病毒(herpes virus sylvilagas) 2) RNA病毒 急性RNA肿瘤病毒：潜伏期较短(34周),大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、 个别小鼠白血病病毒(如Abl-MuLV)都属于本组. 该组病毒基因组结构常有缺陷,需辅助病毒协助才能复制 慢性RNA肿瘤病毒： 潜伏
20、期较长(412月)，大部分动物白血病病毒属于本组,（2）其它生物因子诱发的动物肿瘤模型 幽门螺杆菌感染SPF级的BALB/c小鼠,22月以后, 38%的实验小鼠胃有淋巴滤泡增生, 25%的小鼠胃出现形态类似人胃粘膜相关淋巴瘤的病变 （B细胞淋巴瘤）,3. 转基因动物肿瘤模型 Stewart等获得13个MMTV-LTR/myc融合基因的转基因小鼠系, 其中两株c-myc启动子为MMTV-LTR启动子中糖皮质激素受体 反应元件所取代,在早期妊娠时即发生自发性乳腺癌。 Chisari等 HHBV的S基因、病毒增强子和X基因转基因小鼠, HBsAg的积聚引起内质网明显扩张,出现肝细胞毛玻璃样改变, 1
21、00%小鼠发生肝脏肿瘤 X基因和病毒增强子的质粒X基因转基因小鼠, 21月龄时, 两个品系转基因小鼠肝肿瘤发生率分别为 75% 82.8%,三、移植性肿瘤 可移植瘤株：将一种动物肿瘤移植到同系同种或异种动物,经传 代（20代）, 组织形态特征逐渐稳定，即成为同种 或异种动物的可移植瘤株。 移植瘤来源：动物自发性肿瘤或诱发性肿瘤 我国用615近交系小鼠的自发瘤建立了： 肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株 用诱发瘤建立了： 小鼠宫颈癌（U27及U14） 小鼠前胃癌（Fc） 肝细胞癌等移植瘤株。,近交系动物的应用： 1962年,苏格兰医师Dssacson和 Cattanach发现（裸小鼠） *移植
22、性人肿瘤裸鼠模型广泛应用 1、免疫缺陷动物 (1) T细胞免疫功能缺陷动物 裸小鼠：*先天性胸腺发育不良(妊娠1415天可见少量胸腺 痕迹,并非全无胸腺) *胸腺依赖性T细胞明显减少或缺乏, *B细胞仍然存在,但功能低下,免疫球蛋白以IgM为主, *NK细胞有较强活力。 纯合子的裸大鼠：基因符号rnu。特征与裸小鼠相似 无胸腺大鼠,(2)B细胞免疫功能缺陷动物 B细胞功能衰退,血浆IgM、IgG低下,T细胞功能尚属正常 CBA/N系小鼠 Arabian和Quarter马(3)联合免疫缺陷及其它免疫缺陷动物 CBA/NNU小鼠 T、B淋巴细胞功能均缺陷; 严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）：突变基
23、因scid位于第16对染色体 纯合子小鼠T、B淋巴细胞极度低下, NK细胞和抗原传递细胞功能尚正常 先天性联合免疫缺陷型小鼠： NK细胞、T、B细胞功能联合缺陷裸小鼠： 缺点：*需在 germ-free或SPF条件下饲养，较苛刻 *平均寿命仅1430d。,2、人肿瘤免疫缺陷动物模型 移植成功率: 取决于 移植方法：人癌组织直接移植的成功率平均为30% 人癌细胞株为6070% 肿瘤本身：成功率最高结肠癌、胃癌、黑色素瘤; 其次胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、宫颈癌、食管癌等; 较低前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网织系统肿瘤和白血病 裸小鼠品系：人前列腺癌BALB/c成功率仅2%（3/150） NMRI裸
24、小鼠可达35%（6/16） 其它： 接种部位 宿主遗传背景 年龄和建康状况等,(1)人组织裸鼠诱癌模型 诱发鼻咽癌 青少年慢性鼻咽增殖体炎鼻咽活检或刮除组织移植于NC系裸小鼠 二亚硝基哌嗪（NDP）为致癌剂 鼻咽上皮增生 巴豆油A因子（TPA）为促癌剂 乳头状增生、不典型增生 原位癌 诱发肺癌 裸鼠体内人类气管、支气管培养成功也为用人材料诱发肺癌的实验奠定了基础,(2)人肿瘤裸鼠移植模型 *1969年丹麦的Ryggard 人结肠癌移植于裸小鼠 *100余种人类恶性肿瘤裸小鼠移植模型： 癌肿 肝、肺、胃、结肠、食管、胰腺、乳腺、 前列腺、鼻咽、 淋巴造血系统肿瘤 软组织肿瘤 其它 黑色素瘤、视网
25、膜母细胞瘤*1978年Festing首次进行裸大鼠人癌异种移植*1983年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型LTNR与LTMR2两株,(3)人肿瘤转移裸鼠模型 我国始于80年代中期 肺癌、肝癌转移及胃癌肝转移和淋巴道转移等1)人肺癌高转移裸小鼠模型 吴秉铨等将6株人肺癌细胞系移植BALB/cA,nu/nu/JCLB裸小鼠 其中一株肺巨细胞癌细胞系移植建成高转移模型,定名为PG 带瘤存活30天以上裸小鼠中 淋巴结转移(29/30) 肺转移(26/30) 传17代后,瘤组织再移植裸小鼠(存活30天) 淋巴结转移 (12/12) 肺转移(9/12) 转移率达100%2)人肝癌高转移裸小鼠模型 孙肪宪,汤钊猷等用30例人肝癌组织直接移植于46周龄的BALB/cA,nu/nu裸小鼠, 移植部位在小鼠肝实质内或肝包膜下 其中一例39岁男性(巨块型肝细胞癌伴肝内播散和淋巴结转移)其移植瘤育成 人肝癌高转移裸鼠模型,定名为LCI-D-20 鼠间连续传代(16代)成功率100%,间期为20天 肺、淋巴结及肝内转移(72/72), 腹腔种植转移(50/72), 转移率达100%,
