质粒DNA的提取、纯化和电泳检测.docx

1、质粒 DNA 的提取、纯化和电泳检测 姓名 学号 同组人 班级 实验时间 摘要： 质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的 DNA， 它 是基因工程中一种非常重要的载体。质粒 DNA 的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。碱变性提取法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法。 电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化 DNA 片段，是分子生物学的核心技术之一。本次实验 利用碱变法 对 E.coli DH5 受体菌中质粒 pUC19 的 DNA 进行提取、纯化和电泳检测，旨在学习并掌握质粒 DNA 提取的原理、纯化 及

2、琼脂糖凝胶电泳技术。通过此次实验，我们达到了预期效果。 关键词： 质粒 DNA、 碱变性提取法 、质粒 DNA 的纯化、 DNA 凝胶电泳 1.引言 质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的 DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从 1kb 至 200kb 以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状 DNA 分子（简称 cccDNA）。 由于质粒分子小、便于分离和提取的

3、特点，在 DNA 重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带 目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒 DNA。因此，质粒 DNA 的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。 提取和纯化质粒 DNA 的方法很多，目前常用的有：碱裂解 /碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、 EB-氯化铯密度梯度离心法和 Wizard 法等。其中，碱变性提

4、取法最为经典和常用，是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的，适用于不同量质粒 DNA 的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒 DNA 纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。 碱变性提取质粒 DNA 一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA。 在细菌细胞中，染色体 DNA 以双螺旋结构存在，质粒 DNA 以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体 DNA 和质粒 DNA 均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶 pH值不同。在 pH12.6 的碱

5、性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA 的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当用 pH 值 4.8的 KAc（或 NaAc）高盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒 DNA 可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体 DNA 不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质 -SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒 DNA 分离。溶于上清液的质粒 DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而 形成沉淀。由于 DNA 和 RNA 性质类似，乙醇沉淀 DNA 的同时，也伴随

6、着 RNA 沉淀，可利用 RNaseA 将 RNA 降解。质粒 DNA 溶液中的 RNaseA 以及一些可溶性蛋白，可通过酚 /氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒 DNA。 电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH 条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化 DNA 片段，是分子生物学的核心技术之一。 凝胶电

7、泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中 DNA 的位置可以用低浓度荧光插入染料如 EB 染色直接观察到，甚至含量少至 20pg 的双链 DNA 在紫外激发下也能直接检测到 。 溴化乙锭 （ EB） 是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到 DNA 或 RNA 分子的碱基之间，并在 300 nm 波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同 DNA 片段的大小（或数量）成正比。 核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素： （ 1）样品 DNA 分子的大小

8、：电泳时，线性双螺旋 DNA 分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。 （ 2） DNA 分子的构象：分子量相同而构象不同的 DNA 分子，其迁移速率不同。在抽提质粒 DNA 过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA（ cccDNA）的一条链断裂，变成开环 DNA（ ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状 DNA（ Liner DNA）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型（ cccDNA）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（ ocDNA）分子。 （ 3）琼脂糖

9、浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的 DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳 动速度不同。通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大， DNA 电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。 （ 4） 电泳所用电场：低电压条件下，线性 DNA 片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量 DNA 的泳动速率以不同幅度增加，因此凝胶电泳分离 DNA 的有效范围随着电压上升而减小，为了获得 DNA 片段的最佳分离效果，电场强度应小于 5V/cm。 （ 5）电泳缓冲液 : 在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有

10、： TAE、 TBE、 TPE 和 MOPS 等。电泳缓冲液的作用： 维持合适的 pH。电泳时，正极发生氧化反应（ 4OH-+4e-2H2O+O2），负极发生还原反应（ 4H+4e-2H2），长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的 pH 保持基本不变 ； 使溶液具有一定的导电性，以利于 DNA 分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有 0.01 0.04mol/L 的 Na+离子， Na+离子的浓 度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化 ； 电泳缓冲液还有一个组分是 EDTA，加入浓度为 1 2mM，目的是螯合 Mg2+等离

11、子，防止电泳时激活 DNA 酶，此外还可防止 Mg2+离子与核酸生成沉淀。 电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢， DNA 几乎不移动；而在高离子强度下（如错用 10电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使 DNA 变性。 （ 6）温度： DNA 在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小 DNA 片段的相对电泳迁移率在 4 30 内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于 0.5时凝胶很脆弱，最好在 4

12、 下电泳以增加凝胶强度。 2.材料和方法 2.1 材料和试剂 实验材料： E.coli DH5 受体菌（生长在 LB 固体培养基） 、 有 Ampr 标记的质粒 pUC19 实验试剂 ： LB 液体培养基 、 氨苄青霉素（ Amp）母液（储存浓度 100mg/mL） 、 溶液 、溶液 、 溶液 、 TE 缓冲液 、 Tris 饱和酚 、 氯仿 /异戊醇混合液 、 酚 /氯仿 /异戊醇（ PCI）（ 25：24： 1）混合液 、 3M NaAc 溶液 、 冰乙醇 、 70%乙醇 、 RNase A、 灭菌双蒸水 ddH2O、 50TAE缓冲液 、 10mg/mL 溴化乙锭（ EB）溶液 、 6上

13、样缓冲液（ 6loading buffer） 、琼脂糖、 Supercoiled DNA Ladder Marker、 pUC19、 pUC19/Hind 实验仪器 ： 接种环、三角瓶、天平、红盖瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、 100mL 离心管、1.5mL 塑料离心管、 4 离心机、 涡旋 振荡器、微量移液器、不同型号枪头、制胶板、制胶槽、样品梳、电泳仪、紫外灯、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、 记号笔、盛冰的搪瓷杯 、 离心管架 、 手套 2.2 方法 2.2.1 E.coli DH5 （ pUC19） 菌体培养 （ 1） 用 Amp 母液和 LB 液体培养基配制 LB+Amp（ Amp 工作浓

14、度为 100g/mL）液体培养基 。 （ 2） 用酒精灯灼烧且冷却后的接种环在 LB 固体培养基上挑取 E.coli DH5 单菌落，将接种环伸至 LB+Amp 液体培养基中，在液体培养基与三角瓶瓶壁交界面处向液体培养基中接种 E.coli DH5 （ pUC19） 。 （ 3） 将培养基在 37 、 200rpm 下振荡培养过夜 。 （ 4） 从过夜培养基中取 1%接种量接种到新的 LB+Amp（ Amp 工作浓度为 100g/mL）培养基，将新的培养基在 37 、 200rpm 下振荡 4 6 小时，最后得到菌液。 2.2.2 碱裂解 /变性法提取质粒 DNA （ 1） 取出一支灭菌的 1

15、00mL 离心管，标记上组号，用天平称量其重量，并记录为 W1。 （ 2） 向 100mL 离心管中倒入菌液至距瓶口 1/3 处，每两组的两支 100mL 离心管配平 。 （ 3） 将菌液在 4 离心机中 6000rpm 离心 5min，弃上清 。 （ 4） 向菌液中加入 5mL 溶液 ，涡旋振荡，将菌液在 4 离心机中 6000rpm 离心 5min，弃上清 。 （ 5） 将 100mL 离心管称重，标记其质量为 W2，计算 W2-W1。 （ 6） 每 100mg 菌体量，加入（按菌体量接近的重新分组，溶液 补平）： 1.0mL 溶液 ，充分涡旋振荡，用溶液 再次配平； 2.0mL 溶液 ，

16、轻柔颠倒混匀，冰浴 3 5min； 1.5mL 溶液 ，轻柔颠倒混匀，冰浴 5min。 （ 7） 将菌液在 4 离心机中 12000rpm 离心 15min，小心转移上清到新的离心管内，记录体积 V。 （ 8） 加入 2V 冰乙醇，颠倒混匀； -20 静置 15min。 （ 9） 将菌液在 4 离心机中 12000rpm 离心 15min，弃上清。 （ 10） 加入 5mL 70%乙醇， 12000rpm 离心 3min，吸弃上清。 （ 11） 重复 70%乙醇洗涤一次， 37 风干 5 10min。 （ 12） 分次加入 1mL TE 溶液并转移到 EP 管中，得质粒 DNA 粗提物。 （

17、13） 向质粒 DNA 粗提物中加入 5L RNase A（ 10mg/mL），终浓度为 50g/mL， 37 孵育 1 2 小时。 2.2.3 质粒 DNA 的纯化 将 1mL 质粒 DNA 粗提物分出 500L 到一新 EP 管中，使得每组两管。每个 EP 管进行如下操作： （ 1） 加入等体积的 Tris 饱和酚，涡旋振荡， 12000rpm 离心 5min； （ 2） 转移上清（上清体积是 V1）至新管，加入 V1 的酚 /氯仿 /异戊醇混合液，涡旋振荡，12000rpm 离心 5min； （ 3） 转移上清（上清体积是 V2）至新管，加入 V2 的氯仿 /异戊醇混合液，混匀， 120

18、00rpm离心 5min； （ 4） 转移上清（上清体积是 V3）至新管，加入 1/10V3 的 3M NaAc 溶液（ pH=5.2），再加入 2V4（ V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混匀， -20 保存 30min； （ 5） 12000rpm 离心 15min，弃上清； （ 6） 加入 500L 70%乙醇洗涤， 12000rpm 离心 2min，弃上清； （ 7） 重复洗涤一次，吸弃上清， 37 风干 5min； （ 8） 每管加入 25L TE 溶解沉淀，合并，得 50L 纯化质粒 DNA。 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测质粒 DNA （ 1） 1%琼脂糖凝胶的制备 。 配 制

19、 2L1TAE：取 40mL 50TAE，用双蒸水将其稀释至 2L。 正确组装 制胶槽 、 制胶板 、 样品梳 。 取 40mL 1TAE 至 250mL 干净 红盖瓶 中，称量 0.4g 琼脂糖，混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾 3-4 次，至溶液澄清无颗粒 。 待溶液冷却至 60 左右，加入 20L 1mg/mL 的溴化乙锭（ EB） 溶液，使 EB 溶液终浓度为 0.5mg/L，混匀后缓缓倒入架好样品梳的 制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min 以上）。之后轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入 1TAE 电泳缓冲液），即可上样。 （ 2） 电泳上样 。 取 2.0L 纯

20、化 DNA、 2L 双蒸水、 1L 上样缓冲液（ 6loading buffer），用微量移液器吹吸混匀 。 将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加 1TAE 至高出胶面约 1mm。 将 上述混合好的 DNA 样品，按照表 1 顺序，点样到凝胶中。其中第 11 泳道为对照组，在整个实验过程中没有用 RNA 酶处理粗提物，其他实验过程不变。 （ 3） 凝胶电泳与 DNA 分离 。 开 启电泳仪电源 。 选择合适的电压（ 100-120V）和时间（ 40min） 。 将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。 启动电泳，待观察到负极有

21、气泡升起方可离开 。 电泳结束，关闭电源，取出凝胶 。 紫外灯下观察电泳结果，摄片，保存，分析。 表 1 DNA 样品加样顺序 泳道 1 2 3 4 5 6 7 8 9 样品 超螺旋marker pUC19 pUC19/Hind 1 组DNA 样品 2 组DNA 样品 3 组DNA 样品 4 组DNA 样品 5 组DNA 样品 超螺旋marker 样量 6L 5L 5L 5L 5L 5L 5L 5L 6L 泳道 10 11 12 13 14 15 16 17 样品 6 组DNA 样品 6 组DNA 样品（对照组） 7 组DNA 样品 8 组DNA 样品 9 组DNA 样品 10 组DNA 样品

22、 pUC19/Hind pUC19 样量 5L 5L 5L 5L 5L 5L 5L 5L 3.结果 在碱裂解 /变性法提取质粒 DNA 中， W1 为 14.16g， W2 为 14.26g， W2-W1 为 100mg。 碱裂解法提取质粒 pUC19 DNA 的琼脂糖凝胶电泳得到的条带情况如图一所示。 在 溶液中，由于 DNA 核酸有磷酸基而带负电荷，在电 场 中 向 正极移动。 图上方是 17 个点样孔， DNA 条带离点样孔越远，说明 DNA 在 琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率 越快。 图 1. 碱裂解法提取质粒 pUC19 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

23、 11 12 13 14 15 16 17 bp 3,049 2,087 泳道 1 与泳道 9 加的样品是 Supercoiled DNA Ladder Marker。 Supercoiled DNA Ladder Marker 由 8 种超螺旋的质粒 DNA 构成， DNA 大小分别为： 2,087 bp、 3,049 bp、 3,997 bp、5,026 bp、 6,133 bp、 8,023 bp、 10,085 bp、 11,849 bp（如图 2 所示）。 其中 2 kbp 6 kbp 间约以 1 kbp 递增， 6 kbp 12 kbp 间约以 2 kbp 递增。每次取 6L 电泳

24、时，每条带的 DNA 量约为 50 ng，其中 5 kbp 条带的 DNA 量约为其他条带的 3 倍 （ 150ng） ，显示亮带。此 DNA 溶液中已含有 1Loading Buffer，可直接上样。 1Loading Buffer 中含有色素 Xylene Cyanol FF（ 0.01%） 以及 Bromophenol Blue （ 0.01%） 。 在 图 1 中 Supercoiled DNA Ladder Marker 形成的 DNA 条带 中 ， 可以 清晰 地 看清从下 往上 6 条 DNA 条带 （ 对应的 DNA 由小到 大 ） ， 而且 从下往上数 第 4 条 DNA 条

25、带 （ DNA 大小 为 5026bp） 最 明亮 ， 而其余 2 条 位置靠上（ DNA 较大）的 DNA 条带较不明显。 泳道 2 与泳道 17 加的样品是 质粒 DNA， 即 pUC19，可以起到对照作用 。 pUC19 的 DNA是 cccDNA，即超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA。 在图 1 中，可以看到 泳道 2 与泳道17 对应的 电泳图中有一 条清晰 明亮 的 DNA 条带。 泳道 3 与泳道 16 加的样品是 pUC19/Hind 。 Hind 是限制性核酸内切酶，可以酶切pUC19。 Hind 酶切 pUC19 的结果是使超螺旋的共价闭合环状结构的 pUC19 质粒

26、DNA 的链断裂， DNA 的链断裂的 pUC19 迁移速度变慢。但是 Hind 没有将所有 pUC19 酶切， 因此 泳道 3 与泳道 16 电泳后会形成两条条带 。在泳道 3 与泳道 16 对应的 DNA 带中，图中上面那条较细较暗的条带是 Hind 酶切后的 pUC19，图中下面那条较粗较亮的条带是没有被 Hind 酶切的 pUC19。 泳道 4 加的样品是 1 组 DNA 样品。其 DNA 条带很明亮而且宽 。这说明 1 组 样品中 DNA含量 较 高 。 泳道 5 加的样品是 2 组 DNA 样品，可以看见一条较暗的 pUC19 DNA 条带。另外泳道 11对应的电泳图中也可以看到一

27、条较暗的 pUC19 DNA 条带 。 在 pUC19 对应的 DNA 条带位置处全班 10 个 组均 无 明显的 DNA 条带。 泳道 6 加的样品是我们组（ 3 组） DNA 样品。 我们的 DNA 带较明亮，说明提取出的 DNA较多。但 DNA 条带位置没有在 pUC19 DNA 对应的位置。 我们 组 DNA 条带位置 比 pUC19 DNA对应的 条带 位置 靠下 ，说 明我们 组 DNA 迁移距离 比 pUC19 DNA 大 ， 我们 组 DNA 的相对 分子质量比 pUC19 DNA 小。 在 pUC19 DNA 对应 的 条带 位置 上 可以看到模糊的 DNA 条带，产生的原因

28、是因为下面的 DNA 条带中有些 DNA 因为迁移速度较慢而使 DNA 条带拉长。 泳道 11 加的样品是 6 组 DNA 样品（对照组）。该样品在实验过程中没有用 RNA 酶处理，其他实验操作不变。因此该样品中含有大量的 RNA，所以 在 DNA 带 下方 形成大片 很宽很明图 2. Supercoiled DNA Ladder Marker 的 DNA 条带 亮的 RNA 区域 。 泳道 4泳道 8、泳道 10 泳道 15 在电泳图 中都有明显 的拖尾现象，而且 在 电泳图 泳带 的 的中间 偏上 处 都有一条或亮或暗的 DNA 条带，这是 E.coli DH5 受体菌 的 DNA 碎片，

29、DNA 碎片相对分子 质量较大， 泳动得较慢 ， 所以形成的 DNA 条带较靠上 。 某些点样孔 的 边缘 （尤其 是下边缘 ） 出现荧光， 泳道 4、泳道 7、泳道 10、泳道 12等对应的点样孔 下边缘 可明显观察到 此现象。该现象 说明这些提取的质粒 DNA 中含有较多的蛋白质，蛋白质阻碍了部分 DNA 泳动， 从而 在点样孔 的边缘 形成荧光。 另外在 这些 点样孔 下边缘的下方还有一条 宽度 比点样孔下边缘宽 的 DNA 条带，这是 提取 的 样品中 残留的 E.coli DH5 受体菌 染色体 DNA 产生的 DNA 条带。 4.讨论 为获得高纯度的质粒 DNA，必须彻底去除杂蛋白

30、、染色体 DNA 和 RNA。在整个质粒提取过程中除去染色体 DNA 的关键步骤是 加入 溶液 、溶液 的变性和复性环节，应控制好变性和 复性的时机。 溶液 中含有 50mM 葡萄糖、 25mM Tris-HCl（ pH 8.0）、 10mM EDTA。加入溶液 后 溶液变浑浊 ，可剧烈振荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂。葡萄糖能使菌液密度增加，使大肠杆菌重悬并使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 因此， 沉淀菌体的量适宜即可，如果菌体过多，可能会导致 溶液 无法混匀，细胞裂解不充分。 加入 溶液 重悬要充分，如果细胞没有完全散开悬浮，将会影响溶液 裂

31、解细胞，最终导致提取产物中含较多的蛋白质，染色体 DNA 等杂质。 另外葡萄糖可以维持细胞渗透压，防止细胞提前破裂。 葡萄糖 还可以防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。 EDTA 具有螯合 Ca2+和 Mg2+的作用，而 Ca2+和 Mg2+是 DNase 的辅助因子，因此 EDTA 可避免 DNase 对 DNA的降解作用。 Tris-HCl 可以提供适当的 pH。溶液 在离心后要尽可能去除干净 溶液 含有 0.2M NaOH、 1% SDS。 溶液 使用前用 10M 的 NaOH 和 10%的 SDS 母液配制，配制时要防止 NaOH 吸收空气中的 H2O 和 CO2 而减弱了碱性。 加

32、入溶液 时，菌液变黏稠、透明，无菌块残留。 NaOH 可以使细胞溶解。同时，强碱性使染色体 DNA、质粒 DNA和蛋白质变性； SDS 在加入溶液 后起到使蛋白质变性的作用。 加入溶液 时摇匀一定要轻柔，剧烈会导致基因组 DNA 断裂；静置时间也不能过长，因为基因组 DNA 在碱性条件下会慢慢断裂。 溶液 含有 5M KAc 60mL、冰醋酸 11.5mL、重蒸水 28.5mL，溶液终浓度为： K 3M， Ac 5M。 加入溶液 时，会立即出现白色沉淀。 溶液 中的 SDS 遇到 KAc 后变成了十二烷基硫酸钾（ PDS），而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。 SDS 和蛋白质结合 ，钾钠

33、离子置换所产生的大量沉淀 将绝大部分蛋白质沉淀了，此外大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。HAc 起到 中和 NaOH 的作用 ，因为长时间的碱性条件下会打断基因组 DNA， 基因组 DNA 被打断就无法 被 PDS 共沉淀。同时 加 HAc 可以使 变性的质粒 DNA 复性。该步反应形成的高盐环 境进一步加速了这一沉淀。冰浴使反应更充分。 加入溶液 和溶液 后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在涡旋振荡器上剧烈振荡，否则，染色体 DNA 会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒 DNA 混合在一起，不利于质粒 DNA 提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要

34、使试剂与染色体 DNA 充分利用，又不破坏染色体的结构。 之后的实验操作是将菌液在 4 离心机中 12000rpm 离心 15min，小心转移上清到新的离心管内。上清液中含有大量 RNA、断裂的 DNA 片段和质粒 DNA。注意此时沉淀不实，宁愿少吸上清，也不要带入沉淀，因为带入的沉淀在之后操作中无法去除。在使用离心机时，样品放置要对称平衡，否则会严重损害离心机的使用寿命。 沉淀 DNA 通常使用预冷 无水乙醇 ，在低温条件下长时间放置可使 DNA 沉淀完全 。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是 DNA 以水

35、合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。在 pH 为 8 左右的溶液中， DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc 或 NaCl，使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀。 TE 溶液是 pH 缓冲液 ，含有 10mM Tris-HCl（ pH 8.0）、 1mM EDTA，呈弱碱性，有利于保护碱基对 ，为 DNA 提供稳定的生理状态 。同时 TE 溶液 含有 EDTA， EDTA 可抑制 DNA 酶的作用。 RNase A 是 一种 广泛 应用 的核糖核酸内切

36、酶，专一性催化 C-U 间 3-5磷酸二酯键的 裂开形成具有 2,3-环 磷酸衍生物寡聚核苷酸 ，可以 去除残留的 RNA。 寡聚 核糖 核苷酸 会 保存在质粒 DNA 溶液中，但不影响后续的常规操作。 质粒 DNA 中蛋白质的去除通常采用酚、氯仿抽提。质粒 DNA 纯化过程中使用酚 /氯仿 /异戊醇混合液。 苯酚 是强的蛋白阻断剂，可使蛋白变性 析出 。 同时 ， Tris 饱和 酚的 pH 在 8.0左右， 此时 DNA 分布于水相而 RNA 分布 于 有机相，从而可分离 上清 获得 DNA。 pH 为 8.0 的Tris 饱和酚 比重略大于 水 ，且与水有很大的互溶性，即酚可以进入水相从

37、而影响后续的酶 反应 。因此 ， 需要使用氯仿。 氯仿 也是蛋白阻断剂，但强度弱于苯酚，其主要作用是将同水以极小比例互 溶的苯酚萃取出来。如果不加氯仿，残留的苯酚会阻碍酶切反应等，且不利于获得含质粒的水相 。 加入氯仿后可以增加比重，使得酚 /氯仿始终在下层，方便水相的回收 。异戊醇 则可起消除抽提过程中出现的泡沫， 使 水相和 有机 相间的界面更清晰，从而便于回收质粒 DNA。采用酚 /氯仿去除蛋白质效果较单独用酚或氯仿好，但需要抽提多次。质粒 DNA溶解子在上层的水相中。在实验的时候要注意，酚有 强烈的 腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心 并且戴手套操作 。皮肤如不小心沾到酚，应立即用

38、碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。 应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。对于琼脂糖溶液来说，如果胶液温度过高，会使制胶板、制胶槽、样品梳变性，从而影响胶孔大小和胶形状，间接影响加样量和跑条带。如果胶液温度过低，琼脂糖凝胶会凝固，所以在胶液冷却至 60 左右倒胶。胶液冷却至 60 左右后需要加 EB， EB 是一种强烈的诱变剂，应戴手套进行操作。制胶的时候要除去气泡。 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄坏点样 。 拔梳子的时候要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。 电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响 电泳效果。配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液应与

39、电泳时使用的缓冲液为同一批配制的。注意使电泳槽中 1TAE 缓冲液高于琼脂糖凝胶约1mm。 DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动，因此点样孔在负极。电泳上样时要小心操作，枪尖应恰好置于凝胶点样孔中，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。同时不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。跑多个样时，应依次快速点样，否则时间一久，样品会弥散。 琼脂糖凝胶电泳检测质粒 DNA 过程中使用上样缓冲液（ loading buffer），其含有 30%甘油、 0.25%溴酚蓝（ BPB）、 0.25%二甲苯青 FF。 甘油的 作用 是 增大样品密度，确保 DNA 均匀进入样品孔内。 溴酚蓝

40、及二甲苯氰作为双色电泳指示剂，使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使 加样操作更为便利 ， 另外可以在电场中预测速率 。 在 凝胶 电泳 中， DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此 ， 该法还可用于相对分子质量的测定。将 未知 相对 分子 质量的 DNA 样品 与已知相对分子质量 的标准 DNA 片段进行电泳对照，观察 其 迁移距离，就可以获得该样品的相对分子质量的大小 。 紫外线对眼睛和皮肤均有危害性 ， 对眼睛尤甚 。 为了最大限度避免受到辐射 ， 要确保紫外光源得到适当遮蔽 ， 并应戴好目镜 （眼罩）或能够有效阻挡紫外线的全副完全罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。 参考文献 1 汪天虹 .分子生物学实验 .北京：北京大学出版社， 2009 年 .