1、 园林植物快繁技术 说 明 试题题型与题量 比较题： 5 个小题，每小题 6 分，共 30 分。 简述题： 5 个小题，每小题 8 分，共 40 分。 论述题： 2 个小题，每小题 15 分，共 30 分。 考试范围 全书 其他问题 考试时间 2 小时 满分为 100，及格分为 60 分 考试时无需带工具 绪 论 1、植物离体培养 是指通过无菌操作，使植物体的各类结构材料 (外植体 )，接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下，进行离体培养的一套技术与方法，通常称之为植物组织培养或植物的细胞与组织培养。 2、离体培养技术体系 胚胎培养及以胚胎为基础的培养技术 器官及器官原基培养 组织培
2、养 细胞培养 原生质体培养及以原生质体为基础的培养技术 第一章 离体培养的基本操作方法 1、外植体 植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。 2、外植体的选择 选择优良的种质 选择健壮的植株 选择外植体的大小 选取外植体的时期 选择细胞培养材料 3、培养材料的处理 母株的预处理 外植体休眠期的处理 外植体的灭菌 4、培养基 外植体生长的营养物质，通常 有两个水平，一是基本培养基，包括大量元素和微量元素、维生素和氨基酸，还有糖和水。二是完全培养基，即在基本培养基的基础上，附加各种植物生长调节剂以及其它的复杂有机附加物。 5、固体培养基和液体培养基的比较 固体培
3、养基 设备简单，使用方便 不能充分利用培养容器中的养分 易造成自我毒害 液体培养基 需要一定的的设备 有利于外植体的生长 避免上述固体培养基的缺点 6、无菌室 无菌室的要求 无菌室的灭菌 7、试材和器具的灭菌 培养基的灭菌 特殊药品的灭菌 器皿 (具 )灭菌 外植体的灭菌 8、无菌操作 无菌操作前 10min 先使超净工作台处于工作状态。 穿戴好工作衣帽后，用 70酒精擦拭双手和工作台面，操作期间也应再擦拭数次。 拔塞前，要用火焰灼烧瓶口。用硫酸纸等做瓶盖的，应在火焰附近打开盖子。 操作时，试管口应略略向下，避免尘埃杂菌落入管内，又便于操作。 第二章 胚胎培养和离体受精 1、胚培养的意义 促使
4、发育不良或中途败育的胚发育成熟 打破休眠期促进胚萌发 克服多胚品种珠心胚的干扰 快速繁殖良种砧木 诱导胚性愈伤组织 2、成熟胚的培养 材料的消毒与接种 培养基 种胚培养的外界条件 3、原胚培养 基本培养基 生长凋节剂及其它附加物的影响 4、离体受精 也称离体授粉或试管受精，它是把未授粉的胚珠或子房从母体上切离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌的花粉，使之在试管内受精，应用这种技术，可以使花粉不经柱头和花柱组织，直接进入子房中的胚珠，有可能克服所谓孢子体型的不亲合，从而得到远缘杂种。 第三章 器官和组织培养 1、器官培养 是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养，包括茎段、茎尖、叶片
5、、子叶、花序、果实、种子等等。 2、组织培养 广义：包括各种类型外植体的培养，亦即离体培养。 狭义：包括形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织的培养。 3、茎尖培养 其含义较广，包括小的仅 10 100um 的茎尖分生组织，大的几十毫米的茎尖或更大的芽的培养，前者主要用于无病毒苗的培养，后者用于无性系快速繁殖。 4、花药培养 5、花粉培养 第四章 细胞培养 1、成批培养 是把细胞接种到一个与外界隔绝的只允许气体和挥发性的代谢物质交换的，营养液体体积保持不变的密闭系统中培养。 2、连续培 养 是用一定容积的但非密闭的反应器来进行的，在培养过程中不断注入新
6、鲜培养基，而使其营养物质连续得到补充，细胞的生长和增殖连续进行。它可分为开放式连续培养和封闭式连续培养。 3、固相化细胞 把细胞固定在一种堕性基质，如琼脂、藻酸盐、纤维或膜上面或里面，细胞不能运动，而营养液可以在细胞间流动，供应其营养。 4、单细胞培养 也称单细胞克隆技术，它不是指培养的只有单个细胞，而是指接种的细胞群体中，不存在悬浮培养中所可能存在的小细胞团，而是纯粹的单细胞。各单离细胞不仅仅只留在增殖阶段，它可被 诱导再分化，形成完整植株。 第五章 原生质培养与融合 1、游离原生质体的一般技术程序 植物材料称重约 0 5g，常规方法灭菌、无菌水冲洗 5 遍，在无菌条件下把其搞碎，称重后放入
7、中 6cm 的培养皿，搞碎。 把预先配制好的 5ml 酶混合液经孔径为 0.2um 的过滤器过滤入培养皿。 用石蜡封住培养皿后，放在转速为 30 转 min、 25 30 ，微光或黑暗条件下保育几小时或过夜。 用倒置显微镜检查原生质体游离效果，确定保育处理时间。 把游离效果已达要求的酶 原生质体混合液在无菌条件下经孔径为 45um左右的尼 龙网过滤，滤去消解不完全的组织碎块和细胞团。 已过滤的混合液以 60 100g 重力离心 3 5min。 弃去上清液，原生质体用渗透压稳定剂再稀释，反复离心三次。在倒置显微镜下检查纯化效果，若效果好，最后一遍用原生质体培养基离心。 若纯化效果不好，可用 20
8、的蔗糖离心，使完整的原生质浮于液面，杂质沉于离心管底，也可用界面法收集。 计算原生质体的产率和原生质体活力测定 2、原生质体融合 也称体细胞杂交，就是使分离下来的不同亲本的原生质体之间在人工控制的条件下，像性细胞受精作用那样互相融合为一体。 第六 章 细胞全能性及其营养代谢 1、植物细胞全能性 植物细胞具有该植物有机体的全部遗传信息，并具有形成植物有机体所有细胞类型，直至发育成完整植株的能力。 2、植物细胞全能性的展现和利用 外植体在腋芽萌发等情况下可直接发育成苗，还可以在异养条件下脱分化，形成愈伤组织，愈伤组织可以再分化，也可以游离原生质体，用以遗传操作，或游离细胞用以次生物质生产。操作的原
9、生质体和细胞均可象愈伤组织一样，实现再分化。 再分化可以是胚状体途径，也可是不定器官途径，前者可以用以制备人工种子，胚状体和不定器官均可以种质保存 ，也均可形成试管苗，用以快速无性繁殖。试管苗经培育成为进行植物生命周期一样的成年植株，开花结果，完成离体培养周期。 3、培养物的营养 碳源 氮源 无机营养 维生素 生长调节剂 生长素类 细胞分裂素类 第七章 外植体的脱分化与生长 1、脱分化 是指外植体己分化的细胞，在切割损伤和培养物内外因素作用下，逐渐丧失其原有的分化的结构和功能，合成代谢变得旺盛，细胞壁由厚变薄，其内部结构也发生变化，细胞高度液泡化，形成无组织的细胞团或愈伤组织。 2、与脱分化有
10、关的因子及其作用 损伤刺激 培养细胞的异质性 生长物质的影响 光线的影响 第八章 培养物再分化 1、再分化 是指离体培养物由脱分化状态再度分化。再分化可 在细胞水平、组织水平和器官水平递进地进行，最后再生完整植株。培养物的再分化，通过胚胎发生和直接分化器官再形成植株这两个途径实现。 2、拟分生组织 是指培养物中出现的类似分生组织的细胞群，它是脱分化后的培养物发生的一系列细胞分裂而产生的一团小型、薄壁、液泡小、细胞核和细胞质染色较深的细胞组成，它具分化上的可塑性。 3、维管组织结节 是一个区域的愈伤组织转化为 韧皮分子和木质分子的混合体结构，这样的形成层状的细胞向外延伸与拟分生组织连接，形成根原
11、基或芽原基。可以认为维管结节是试管植株的维管束的前身。 4、器官分化的调控 控制器官分化的激素模式 生长素激动素 培养基组分和附加物的作用 物理环境 5、植株的形成 体细胞胚 植株 根茎两极器官 植株 外植体脱分化 不定器官 单极器官 先茎后根 植株 先根后茎 植株 6、各种培养类型的离体胚发生 外植体直接发生二倍体胚 愈伤组织产生胚状体 悬浮细胞产生胚 单倍体产生胚 7、影响离体胚胎发生的因素 外部因素 生长调节剂的作用 氮源 其它因子（糖、培养基中可溶氧、活性炭） 内部因素 细胞的隔离 遗传基因型的影响 外植体来源和年龄 其它因素 第九章 培养物的遗传与变异 1、培养细胞变异的遗传机理 染
12、色体断裂、染色体数增加 染色体断裂、染色体数减少 染色断裂并引起染色体数目改变 染色体断裂但并不引起染色体数目的变化 体细胞核内再复制 单个核基因的突变 转座子的作用 2、异核体的核和染色体形为 核分裂同步，核融合，且两亲本的染 色体未出现不亲和现象。 核分裂同步 (或相互影响后同步 )、核融合，但在不同培养期发生染色体变化 (染色体重组或丢失 )。 核不融合，且两个核间重又产生新膜，两个子细胞的以后各自分裂。 核不融合，形成多核细胞，细胞周期混乱 第十章 离体繁殖 1、离体繁殖 也称微型繁殖或快速无性繁殖，是农业生物技术重要组成之一，在农业生产上应用最广泛最成功的一个领域。 2、离体繁殖的特
13、点 繁殖速度快 占用空间小 便于种质贮存和交换 离体繁殖诱变 培育无病毒苗 3、外植体发育的途径 腋芽的萌发 不定芽的 产生 离体胚胎发生 4、无菌材料的建立 材料的选取 必须选取优良的母株 种源可靠 性状稳定 生长健壮 成年的母株，切忌用实生苗繁殖良种 材料的灭菌 正确的消毒措施 还须注意几方面的改进措施 还应注意防治褐变 培养基 一般建立无菌株系的培养基多采用 white 或 MS 培养基，并附加低浓度的生长素或细胞分裂素。 5、培养材料的增殖 增殖的方式 增殖的方式有四种途径，即腋芽的萌发，产生不定芽和胚胎发生以及原球茎增殖途径。 增殖的培养基及附加物 增殖的基本培养基 植 物生长调节剂
14、 增殖培养的其它因素 增殖体的大小与继代培养的间隔 培养的光照与温度 增殖培养注意事项 芽苗的变异 玻璃苗的控制 6、芽苗生根培养 基本培养基 降低无机盐浓度，有利于根的分化 生长调节剂 通常不用细胞分裂素，添加低浓度的生长素。 其它附加物 添加活性炭或间苯三酚等有利于生根 7、小苗移植驯化 移植之前，提高光强进行炼苗 移植时，先把附着于根部的琼脂冲洗干净，同时注意避免根颈部破伤 移植的小苗注意湿度和光照的驯化，即湿度逐渐降低，光照强度逐步加强 8、人工种子 狭义：将植物离体培养中产生的胚状体，包裹在含有养分和具有保护功能的外皮中，在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。 广义：人工种子包括胚状体、
15、芽体及小鳞茎，用凝胶包裹成球体或块状或其它形状的种物。 9、人工种子制作方法及其程序 研制流程 体细胞胚的发生系统 人工种子对胚状体的要求 胚状体的发生与同步化筛选 人工种皮 一般是指人工种子中胚状体及其类似物以外的部分的统称。据有关报道有多种水溶性胶均适用，其中以海藻酸钠、明胶、树胶、 Gelrite 为最佳。包制人工种子的方法有：干燥法、离子交换法和冷 却法。 人工种子贮存 由于农业生产的季节性限制，人工种子需要贮存一定时间，但人工种子含水量大，容易萌发，种球易失水干缩，贮存难度较大。人工种子贮存技术还存在不少问题，有待进一步研究。 第十一章 离体培育无病毒苗 1、茎尖培养脱毒原理 分生组
16、织的细胞生长速度快，病毒在植物体内繁殖的速度相对较慢 病毒的传播是靠筛管组织进行转移，或通过细胞间连丝传递给其它细胞，因此病毒的传递扩散也受到一定影响 这样便造成植物体的部分组织细胞间没有病毒，为茎尖培养脱毒提供依据 2、利用花器官等诱导愈伤组织培育无 病毒苗的原因 植物病毒在植株体内不同器官或组织分布不均匀 病毒复制能力衰退或丢失 继代培养的愈伤组织产生抗性变异 3、脱毒苗的鉴定 无病毒株系的鉴定 指示植物鉴定法 抗血清鉴定法 电子显微镜检查法 脱毒苗农艺性状鉴定 选择与亲本相同的优良经济性状的植株 淘汰非亲本性状的劣变植株 发现不同于亲本的优良性状的突变系 4、无病毒原种的保存 可利用自然
17、环境 隔虫网室种植保存 离体保存 5、无病毒原种的应用 无病毒原种的繁育 无病毒原种的推广 第十二章 离体保存种质资源 1、种子 (种植 )保存法的局限性 种子的生活力随贮存物的延长逐渐丧失 无性繁殖的植物难以用种子保存 种子贮存易遭受自然灾害而丢失 种植保存需大量土地，巨大的人力、物力 易受病虫为害而毁坏，也不便于种质交换 2、试管保存的优点 试管内保存无性系，占用空间小，可贮存大量种质资源 可以排除病虫、便于国际种质交流 生产上需要可立即进行快速大量繁殖 保存费用低廉 3、限制生长保存方法 培养基添加剂生长抑制剂 提高培养基渗透压 降低培养瓶内氧分压 培养物干燥保存 4、超低温保存技术 保
18、存材料的选取 较为理想的有茎尖，幼胚和小苗等此类有组织结构的材料。 冷冻前材料预处理 添加冷冻防护剂 对植物， DMSO 是最好的防护剂，培养细胞的适宜浓度为 5 -8。 材料冷冻的方法 慢冻法、快冻法、预冻法和干冻法。 材料保存 冷冻在 196下的材料，长期保存需要用液氮冰箱。 保存材料解冻 解冻的速度是解冻技术的关键。 保存材料复苏培养 第十三章 离体培养在品种改良上的应用 、培养细胞的人工诱发突变 诱变剂类型及其处理 物理诱变 化学诱变 可用单因子进行诱变，或单因子连续重复使用 可用两种 或多种诱变剂同时使用或连续交替使用 细胞突变体的分离筛选方法 直接选择法 间接选择法 涉及优质、高产
19、等性状的突变系 抗性突变系 抗氨基酸及其类似物、嘌呤和嘧啶类似物的突变系 有应用潜力的突变系的选择和利用 2、转化 凡外源 DNA 导入细胞的过程都可泛称转化，包括用原生质体融合的方法把整个核导入细胞 3、 Ti质粒及其改建 去除 T-DNA 区的激素基因 保留 T-DNA 的左右边界，尤其是左边界 在去除的 T-DNA 区，增加可以表达的选择基因 -DNA 区加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口 在 T-DNA 区外加一个抗菌素的基因，用以标记这个质粒 基因只能在细菌内表达，而不能在植物体内表达 第十四章 离体培养生产次生质物质 1、细胞培养次生物质优点（与栽培植物相比） 细胞培养在人工控制的环境条件下进行，不受气候等限制 减少占用大量土地以及栽培植物的管理 细胞生长可自动化控制，在代谢过程中可进行合理的调节 提高生产率，并可得到稳定的产品质量 细胞培养的生产系统较规范化，可根据市场供销情况有计划的调控 2、细胞培养生产次生物质的特点 植物细胞培养时，其生产速度慢，一般要 4 5 周才能 完成一次生产周期，落后于微生物生产几天便可完成的发酵生产全过程。 植物细胞培养生产次生代谢物总量一般比植株低。 生产技术上还存在一些问题，如细胞容易受到搅拌而破碎，易污染，产量不稳定等，造成较高的成本。 各 论 第二十三章：兰花 第二十四章：水仙花 第二十五章：杜鹃花
