1、本科毕业论文系列开题报告生物工程组胺产生菌的筛选及鉴定一、选题的背景与意义组胺（HISTAMINE）为一种生物胺,可在许多动、植物中发现。由于它是由微生物作用于其前体组胺酸而产生的,普遍认为食物中存在着组胺1。比如水产品中最具毒性的生物胺是组胺，组胺通过与细胞膜上的两类受体（H1和H2）作用而发挥毒性。在鱼体中游离组氨酸在组胺酸脱羧酶催化下，发生脱羧反应形成组胺。当机体摄入组胺超过100MG时，即可引起过敏性食物中毒2。鲭科鱼类体内含有较多游离的组氨酸，含量随鱼种类的不同而变化。如金枪鱼约为15G/KG，而鲱鱼则仅为1G/KG。组胺是海洋鲭科鱼类中含量最多和最主要的生物胺，因此组胺含量常被作为
2、检测这类水产品腐烂变质程度的指标。组胺属于单胺类神经递质,参与多种生理病理活动过程,如对睡眠、摄食、体温、精神情感性疾病的调节3。组胺本身又有强大和广泛的药理作用，主要影响血管、平滑肌和腺体的功能4。对血管的作用组胺可使小动脉、毛细血管和小静脉扩张，使循环血量相对减少，以及毛细血管通透性增加对平滑肌的作用组胺使支气管平滑肌痉挛，引起呼吸困难。对胃液分泌作用组胺对胃液分泌具有高度选择性，在尚不致使血压下降的小剂量时即能显著促进其分泌。组胺是型变态反应变态反应性疾病发病率约占全球人口的3040,其对人类的危害极大中最重要的炎性介质,深入研究组胺,对食物过敏的防治具有重要的意义5。组胺生成菌普遍存在
3、于海水环境中,也生活在活鱼的鳃和内脏中6。当鱼体存活时,该细菌不对鱼产生危害。一旦鱼死亡,鱼的防御系统就破坏,在适宜温度下,组胺菌就迅速生长并产生组胺。市售鱼类存在组胺安全隐患，在加工调理时温度控制不当，食用时就会引起组胺的中毒现象发生。然而，虽有相关的卫生标准，但近年来鱼体中组胺含量超标而引起的中毒事件屡有发生7,8。主要原因是有些人对鱼类及海产品的可食性与组胺含量有关缺乏了解，不清楚组胺含量是评价鱼类及海产品腐败程度的重要指标。随着经济的繁荣、食品安全问题越来越受社会的关注，人们不仅仅局限于吃饱，还要考虑吃的安全和营养，因此，通过对组胺进行研究和认识可以提高和改善食品的质量及安全性。并且组
4、胺原本就具有药理和毒理学作用，因此通过对组胺的研究可以更好的驾驭这种化学活性物质，使其弊端减为最小，使其益处为人所用，充分利用这种活性物质。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1组胺产生菌的筛选。配制筛选产组胺的培养基，从鱼体中进行产组胺菌的分离筛选。2组胺产生菌的鉴定。进行产组胺菌的生理生化鉴定，及PCR鉴定。三、研究的方法与技术路线研究方法1总菌数与各类菌的测定157天步骤1稀释11倒平板将VRBG琼脂培养基、PI琼脂培养基、TCBS琼脂培养基以及组氨菌选择培养基加热溶解，冷却至5560时，分别到平板。12称取25G样品放入盛有225ML稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1MIN2M
5、IN，制成110的样品匀液。131ML无菌吸管或微量移液器吸取110样品匀液1ML，沿管壁缓慢注于盛有9ML稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管检样25G样品225ML01W/VSTERILEPEPTONEWATER，匀质10倍系列稀释涂布选择23个合适的稀释度的样品匀液，取适量的样液涂布到不同的平板中，两个平行各平板计数，报告反复吹打使其混合均匀，制成1100的样品匀液。14按13操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ML无菌吸管或吸头。15根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀
6、释时，吸取适量的匀液涂布到各平板中。每个稀释度做两个样，同时，分别吸取适量的空白稀释液涂布到各平板中作为空白组。2培养各平板置于151的恒温箱中培养7天（24,24H）3菌落计数参考国标4结果报告参考国标2组胺菌的二步筛选法3524H3524H检样25G样品225ML01W/VSTERILEPEPTONEWATER，匀质10倍系列稀释涂布选择23个合适的稀释度的样品匀液，吸取适量的样液涂布到倒好的平板中，依据菌落特性随机选取一些菌落，纯化,后4下保存于TSA斜面中，待用挑取TSA斜面中的菌株接种到组胺菌选择培养基平板中培养观察菌落特性，是否出现有紫色光晕的紫色菌落，有则为阳性实验步骤1稀释11
7、倒平板将VRBG琼脂培养基、PI琼脂培养基、TCBS琼脂培养基以及组氨菌选择培养基加热溶解，冷却至5560时，分别到平板。12称取25G样品放入盛有225ML稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1MIN2MIN，制成110的样品匀液。131ML无菌吸管或微量移液器吸取110样品匀液1ML，沿管壁缓慢注于盛有9ML稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1100的样品匀液。14按13操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ML无菌吸管或吸头。15根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品
8、匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取适量的匀液涂布到各平板中。每个稀释度做两个样，同时，分别吸取适量的空白稀释液涂布到各平板中作为空白组。2培养各平板置于351的恒温箱中培养24H3纯化观察菌落特性，并记录，同时依据其特性，随机选择一些菌落，挑取接种到新的培养基平板中，置于351的恒温箱中培养24H，进行进一步的分离纯化（多次划平板）。使菌落成为带菌落。将培养后长出的带个菌落分别挑取少许细胞接种到TSA斜面，置于4条件下保存，培养24H。4二次筛选将所有阳性菌落接种到组胺酸肉汤培养基，测产组胺活性报告结果将TSA斜面上的菌种接种到组胺菌选择培养基中，在35下培养24H。观测菌落特性，是否出现带有
9、紫色光晕的紫色菌落出现，有则为阳性。5产组胺活性测定挑取一环各呈阳性的单菌落分别接种到9ML组氨酸肉汤培养基中，置于351的恒温箱中培养20H去1ML培养液转移到新的盛有9ML组氨酸肉汤培养基试管中,置于351的恒温箱中培养18H后培养液在13000RPM下离心15MIN上清液用于组胺含量分析。6菌株的鉴定技术路线组胺产生菌的筛选组胺产生菌的生理生化鉴定PCR鉴定四、研究的总体安排与进度201010201101查询与论文有关的资料、撰写试验计划、熟悉基本的实验操作。201103初201104中旬产组胺菌的分离、筛选、鉴定。201104中旬201104下旬整理数据，撰写论文。201105完成毕业
10、答辩五、主要参考文献1金安宝水产品中组胺测定方法的改进中国卫生检验杂质J,2007,1711491502谢超,王阳光,邓尚贵,等水产品中组胺控制降解技术研究概论J食品工业科技，2009,30124144163李伟荣,黄天来,王宁生,等高效液相色谱/电化学检测法测定大鼠下丘脑的组胺和5_羟色胺J分析测试学报,2004,23636394司红彬组胺与抗组胺药J兽医导刊,2009,144833355蒋红玲,向军俭食物过敏中肥大细胞释放组胺的研究进展J医学理论与实践，2007,20（3）2692716陶志华,佐藤实海水中组胺菌的分离及其理化性质分析J生物技术,2009,19142447徐金德一起秋刀鱼引
11、起组胺食物中毒事件的调查J海峡预防医学杂志,2004,105418曾艳,周朝虹58例扁舵鲣鱼所致组胺中毒的急救J中国热带医学,2009,04704705毕业论文文献综述生物工程组胺的功能及组胺的研究现状摘要本文介绍了组胺及其来源，并阐述了组胺的部分重要功能，以及组胺所带来的危害，并对组胺的研究现状进行了论述。关键词组胺；组胺来源；功能；现状1组胺11组胺及其来源111组胺介绍组胺（HISTAMINE）是一种生物胺,组胺具有H1R,H2R,H3R和H4R4种受体，组氨酸遇到富含组氨酸脱羧酶的细菌如摩根氏变形杆菌、组胺无色杆菌、埃希氏大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌等污染后可使鱼肉中的游离组氨酸发生氨基
12、酸脱羧反应产生组胺。112组胺来源组胺脱羧酶1是催化组氨酸脱羧生成组胺的关键酶,定位在第15号染色体的长臂2区1带至2区2带15Q21Q22,其DNA完整序列是由单拷贝基因编码,编码区由12个外显子构成,在组胺脱羧酶催化下，游离组氨酸发生氨基酸脱羧反应产生组胺。组胺的产生需要满足3个条件2（1）存在生成组胺的前体物质游离组胺酸；（2）存在发生组胺酸脱羧的条件；（3）存在是以微生物生长的环境。海水中存在污染鱼类的组胺菌，组胺生成菌普遍存在于海水鱼的体表，也生活在活鱼的鳃和内脏中。当鱼体存活时，该细菌不对鱼产生危害。一旦鱼死亡，鱼的防御系统被破坏，在适宜温度下，组胺菌就迅速生长并产生组胺3。新合成
13、的组胺是以无活性的结合型存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。当机体受到理化因素刺激或发生变态反应时，可引起这些细胞脱颗粒，导致组胺释放4。动物性食物中普遍存在着组胺5，尤其是一些青皮红肉的海产品，其肌肉中含血红蛋白较多，组氨酸含量也较高，当受到含高活性组氨酸脱羧酶的细菌污染后，可使鱼肉中的游离组氨酸脱羧基形成组胺。通常，海产品中的组胺含量与其种类、储藏条件、细菌污染程度等因素有关。2组胺的功能21组胺对机体发挥有益的功能的一些表现211组胺作为一种神经递质组胺属于单胺类神经递质,参与多种生理病理活动过程,如对睡眠、摄食、体温、精神情感性疾病的调节6。212组胺对血管通透性的影响组胺是一种具有
14、生理活性的小分子胺，在炎症反应中能促使血管平滑肌收缩、微血管壁通透性增加，使大量的炎性细胞和抗体等生物活性物质聚集于炎症局部，发挥作用。外源性组胺还具有抑制肿瘤细胞生长，促使肿瘤组织退行性变、增加淋巴细胞在瘤体内的渗透等作用7。213中枢组胺具有改善学习记忆的作用中枢组胺具有改善学习记忆的作用并具有通过H1、H3受体的直接作用，以及通过间接作用于胆碱能神经、NMDA受体等8。214组胺的促生长作用在饲料中添加适量的组胺提高了仔猪胃酸分泌量和十二指肠内容物胰蛋白酶和淀粉酶活性。结果表明，在早期断奶仔猪饲粮添加60UGKG1BW组胺，可刺激胃酸和胃蛋白酶分泌，降低胃内容物PH值，提高十二指肠胰蛋白
15、酶和淀粉酶活性，减轻腹泻，提高仔猪日增重9。215组胺降低缺氧性肺动脉高压通过增强肺动脉内皮细胞ENOS基表达，具有重要的病理生理学意义，使NO产生增加，进步地扩张肺血管，调节HPV，从而降低缺氧性肺动脉高压10。216组胺对N甲基D天门冬氨酸诱发的神经元损伤的改善作用组胺能减弱NMDA诱发的神经元兴奋性死亡，其保护作用在高浓度可能与组胺H1受体PKC通路有关，而在低浓度可能与组胺H2受体PKA通路有关11。217组胺在ADHD治疗中的作用ADHD是一种在儿童发育期出现的脑疾病，表现为情感、注意力和学习能力的减弱或丧失。有50以上的患病儿童，在成年后仍存在注意力不集中单胺能DA，NA神经传递功
16、能异常似乎是造成ADHD症患者学习和运动功能障碍的主要原因。组胺在改善认知功能方面具一定效应，而且H3受体是一种高度异源性受体，组胺可通过它有效地调节ACH，NA和DA的释放，这些事实促使人们去考虑组胺能系统在ADHD治疗中的作用12。218组胺调节机体能量代谢的平衡组胺作用于肾上腺素系统，调节外周能量代谢，这样形成了一条以组胺为主要调节因子的轴，共同维持着机体能量代谢的平衡13。22组胺对机体的负面作用的一些表现221组胺引起食物中毒组胺是组胺酸的分解产物，组胺的产生与鱼类所含组胺酸的多少直接有关，一般海产鱼类中的青皮红肉鱼等鱼体中含有较多的组氨酸，当鱼体不新鲜或腐败时，污染于鱼体的细菌所产
17、生的脱羧酶，就使组氨酸脱羧基形成组胺，温度在1537，PH值为6062的弱酸性，盐分含量35的条件下，最适于组氨酸分解形成组胺，中毒机制为组胺引起毛细血管扩张和支气管收缩，导致一系列的临床症状14,15。人类组胺中毒与鱼肉体内组胺含量以及鱼肉的食用量有关，有关文献介绍引起中毒鱼肉中的组胺含量为120190MGL00G，国家标准也为鲐鱼100MG100G，其他鱼类30MG100G16。222组胺对食品保藏的影响无论是在新鲜的还是经过加工的肉类产品中都可以检测出多种生物胺类物质。TEODOROVIC在牛和羊的肌肉中发现了组胺及其合成因子。YOSHIDA和NAKAMURA在研究贮藏温度对鱼体内生物胺
18、形成的影响时发现，新鲜的鱼肉不含组胺，但将鲜鲭鱼在室温下保存24小时后，组胺含量为284MG/KG，而48小时后又增至1540MG/KG。由此可见，组胺的存在与各种微生物的存在有紧密的联系。而正因为组胺的存在导致一些食品的保存难度大大增加。也因此导致大量食品的浪费17。223组胺引起变态反应变态反应性疾病发病率约占全球人口的3040，由于其对人类的危害极大，所以于2000年末被世界卫生组织定为四大非传染性疾病项目之一。食物过敏属于其中一大类疾病,世界范围内普通人群食物过敏的实际患病率，婴幼儿约为510,成人约为1218。比如慢性荨麻疹19，该病因复杂，大部分患者找不到确切的病因，经研究组胺是引
19、起本病的主要化学递质。224组胺参与多种中枢神经系统疾病近年来的研究发现，脑内组胺参与了多种中枢神经系统疾病，如阿尔茨海默病、癫痫、帕金森病以及脑缺血性疾病20。225组胺对呼吸系统的影响组胺可兴奋支气管哮喘患者的支气管平滑肌，导致平滑肌收缩、痉挛该反应为正常人的1001000倍。从而导致哮喘病人呼吸困难21,22。3组胺的研究现状31组胺生理效应的研究组胺生理效应研究主要包括组胺对神经中枢的影响，组胺对呼吸系统的影响，组胺对免疫系统的影响，以及通过对组胺生理效应的研究来开发各种抗组胺的药物。其中，汪慧菁，姚明辉23等人对组胺在中枢神经系统中对痛觉传导的影响做了研究，这将对研制新一代的镇痛药起
20、到十分重要的作用。嵇汝运24对组胺受体及抗组胺药物做了研究，通过克隆技术鉴定了组胺H3和H4亚型受体。证明了H3受体是突触前受体,其功能为调节组胺的生物合成与从末梢释放。已经发现了一些H3受体的激动剂与拮抗剂。吕艳青,栗原博25对组胺在机体免疫反应中的作用做了研究，包括组胺对抗原提呈细胞APC的影响，组胺对T细胞和抗体型别的调节，组胺对T细胞免疫耐受的作用，组胺对免疫相关的疾病的影响。沈丽芳，马淑媚26，对几种抗组胺药物的作用特点及应用做了研究，包括对第一代抗组胺药，第二代抗组胺药，第三代抗组胺药的研究。32组胺检测方法的研究321NDA柱前衍生毛细管电泳高灵敏安培检测组胺张丽瑶，黄卫华等人提
21、出了毛细管电泳2，3萘二甲醛NDA柱前衍生高灵敏安培检测组胺的新方法，对衍生反应条件和电泳分析条件，包括衍生试剂浓度、衍生溶液的PH值、衍生反应时间、分离介质的PH值、进样时间和分离电压进行了优化，组胺检出限达68108MOLL27。322在线自动化柱前衍生高效液相色谱法本法采用在线自动化衍生技术,反应后的产物直接进入液相色谱分析测定。减少了离线衍生因实验条件的偏差所带来的误差，增强了分析测定的重现性和准确性28。323荧光分光光度法检测组织中的组胺荧光是物质分子吸收光子能量被激发后,从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光。本方法建立了以NA3PO4沉淀后直接衍生测定组织中HA的方法，
22、并将其用于离体生物标本HA释放量的测定。该方法无须提取，灵敏度较高，具有简便，快捷，易于操作的特点29。324离子色谱法离子色谱法测得的数据与高效液相色谱法测得的数据进行比较确定了离子色谱法的准确性。离子色谱法不需要衍生,分离时间短。325高效液相色谱法TSAIYH30等人采用高效液相色谱法对引起一起食物中毒事件的罐装鲭鱼的组胺含量进行了检测。此方法在测组胺时经常采用，但分析时间稍长。此法优点是分离度高，能将各种成分有效分离，具有良好的峰型，因此该方法对食品中生物胺的检测具有一定的应用意义。326气质联用法OGURISY31等人认为虽然此检测方法能进行准确定量，但也存在一些缺点，首先是样品前处
23、理复杂要想达到精确测定必须充分除去混合成分中的蛋白质，氨基酸等成分，有时候需进行衍生化反应，而且产生的峰容易有拖尾现象，从而提高了实验的难度。4展望组胺作为一种活性物质对生物体具有多方面的作用，尤其体现对在神经中枢，呼吸系统，免疫方面。通过对组胺来源，作用机制的深入研究，可以充分发挥它的作用，并且可以开发抗组胺的有效药物，减小它的害处。组胺对食品安全的影响不容小觑，在鱼类食品，肉类食品，蔬菜，真空包装制品，酒类都有不同含量组胺的存在，是一种潜在的毒素。所以通过更好的研究组胺以及设计各种快速、有效、简便的测组胺含量的方法来提高食品安全性。参考文献1孙效玢,于波组胺脱羧酶基因多态性与原发性高血压的
24、关系J中国公共卫生管理,2006,22155562谢超,王阳光,邓尚贵,等水产品中组胺控制降解技术研究概论J食品工业科技,2009,30124144163陶志华,张宏梅,佐藤实,等鲭鱼鱼肉中组胺菌的分离及其理化性质分析J现代农业科技,2009,193313324司红彬组胺与抗组胺药J兽药研究与应用,2009,144833355赖小玲,何志权,陈华絮,等几种海产品储藏期间组胺含量及其品质的变化J食品科学,2007,2813333366李伟荣,黄天来,王宁生,等高效液相色谱/电化学检测法测定大鼠下丘脑的组胺和5羟色胺J分析测试学报,2004,23636397秦迎松,庞训雷,于红丽,等组胺对荷黑色素
25、瘤C57BL/6小鼠微血管壁通透性的影响J徐州医学院学报,2007,2752812848黄育文,余健,陈忠,等中枢组胺对学习记忆的作用J医学与工程,2002,4144469冷向军,王康宁,杨凤,等添加组胺对早期断奶仔猪胃酸分泌、消化酶活性和肠道微生物的影响J中国农业科学,2003,36332432810陆德琴,李会革,叶红,等组胺对肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响J生理学报,2004,56328829411戴海斌,黄育文,徐莉莎,等组胺对N甲基D天门冬氨酸诱发的神经元损伤的改善作用J中国药理通讯,2004,2121912沈滨,王建军中枢组胺能系统研究的新进展J中国神经科学杂志,2002
26、,18141742113曾慧,谭渊明,刘昭前,等组胺在肥胖发病中的作用及其机制研究进展J中南药学,2006,4321822014徐菊玲一起鱼类引起的组胺中毒J中华预防医学杂志,2007,41428915徐金德一起秋刀鱼引起组胺食物中毒事件的调查海峡预防医学杂志,2004,1054116宋京玲一起食用EL本鲭鱼引起的组胺食物中毒报告J职业与健康,2005,21222717李志军,吴永宁,薛长湖,等生物胺与食品安全J食品与发酵工业,2004,849118蒋红玲,向军俭食物过敏中肥大细胞释放组胺的研究进展J医学理论与实践,2007,20326927119卢木荣组胺人免疫球蛋白联合西替利嗪治疗慢性荨麻
27、疹疗效观察J临床皮肤科杂志,2008,37426120陈忠,胡薇薇组胺与中枢神经系统疾病J浙江大学学报,2004,33318618821张齐武,许苏丹,李虹,等组胺气道激发试验致严重呼吸困难3例J临床肺科杂志,2008,139120122杨蓓抗组胺药物防治哮喘的研究进展J国外内科学医学分册,2001,28834234423汪慧菁,姚明辉组胺在中枢神经系统中对痛觉传导的影响J中国临床康复,8358086808824嵇汝运从组胺H3受体的配体开发新药的展望J药学服务与研究,2004,4318318725吕艳青,栗原博组胺在机体免疫反应中的作用J中国药理学通报,2007,231131626沈丽芳,马
28、淑媚几种抗组胺药物的作用特点及应用J中外医疗,2009,717627张丽瑶,黄卫华,王宗礼,等NDA柱前衍生毛细管电泳高灵敏安培检测组胺J分析科学报,2004,2011428房科腾,谢东华,丁斌,等在线自动化柱前衍生高效液相色谱法测定食品中组胺的研究J分析试验室,2008,2712666829何功浩,周四元,胡静,等荧光分光光度法检测组织中的组胺J华中科技大学学报,2007,36227527830TSAIYH,KUNGHF,LEETM,ETALDETERMINATIONOFHISTAMINEINCANNEDMACKERELIMPLICATEDINAFOODBORNEPOISONINGJFOOD
29、CONTROL,2005,1657958531OGURISY,YONEYAYKASSAYANDBIOLOGICALRELEVANCEOFENDOGENOUSHISTAMINEANDITSMETABOLITESAPPLICATIONOFMICROSEPARATIONTECHNIQUESJJOURNALOFCHROMATOGRAPHYB,2002,165179本科毕业设计（20_届）组胺产生菌的筛选及鉴定目录1引言1711研究历史与现状1712研究意义1813主要研究内容182材料与方法1821实验材料18211菌种来源18212试剂18213仪器19214培养基1922实验方法20221组胺产生
30、菌的筛选方法20222组胺产生菌的鉴定方法223结果与讨论2331组胺产生菌筛选结果与分析23311五株菌的颜色变化结果与分析24312五株菌的斑点实验结果与分析24313组胺生成确认实验结果与分析2432组胺产生菌的鉴定结果与分析26321五株菌的革兰氏染色结果与分析26322五株菌的生理生化鉴定结果与分析27323五株菌的分子鉴定结果与分析27324同源性分析284结论29致谢错误未定义书签。参考文献29附录错误未定义书签。摘要组胺是一种具有生物活性的低分子含氮有机物，可引起人的过敏性反应，甚至危险生命。本实验通过二步筛选法与常规筛选法对鲭鱼体内的组胺产生菌进行筛选，并通过生理生化实验初步
31、鉴定菌株，最后通过PCR扩增对筛选出的5株菌进行16SRRNA测序及MEGA41分析软件分析5株菌株的同源性并建立系统同源树。结果显示筛选出的5株菌分别为恶臭假单胞菌PSEUDOMONASPUTIDA，弗氏柠檬酸杆菌CITROBACTERFREUNDII，芽孢杆菌BACILLUSSP，巨型球菌MACROCOCCUSCASEOLYTICUS，松鼠葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSSCIURI。关键词鲭鱼；组胺产生菌；16SRRNA；进化树ABSTRACTHISTAMINEISONEOFTHELOWMOLECULARWEIGHT,NITROGENOUSMOLECULARANDPOSSESSEDO
32、FBIOLOGICALLYACTIVEHISTAMINEWILLLEADTOALLERGICREACTION,EVENENDANGEROURLIVESTHISSTUDYUSESTWOSTEPSSCREENINGMETHODANDREGULARSCREENINGMETHODTOSCREENTHEHISTAMINEFORMINGBACTERIAFROMMACKERELBYMEANSOFPHYSIOLOGYBIOCHEMISTRYEXPERIMENTTOPRELIMINARILYIDENTIFYTHESTRAINS,ATLAST,USINGPCRIDENTIFIESBACTERIA16SRRNAAN
33、DUSINGMEGA41SOFTWARETOANALYZETHE5STRAINSHOMOLOGY,THENSETUPANEVOLUTIONARYTREETHERESULTSSHOWTHATTHE5STRAINSAREPSEUDOMONASPUTIDA,CITROBACTERFREUNDII,BACILLUSSP,MACROCOCCUSCASEOLYTICUS,ANDSTAPHYLOCOCCUSSCIURI,RESPECTIVELYKEYWORDSMACKERELHISTAMINEFORMINGBACTERIA16SRRNAEVOLUTIONARYTREE1引言11研究历史与现状组胺（HISTA
34、MINE）是一种具有生物活性的低分子含氮有机物，是由组胺酸脱羧而形成的，通常贮存于组织的肥大细胞中。它是由微生物作用于其前体组胺酸而产生的,普遍认为食物中存在着组胺1。组胺的产生需要满足3个条件1）存在生成组胺的前体物质游离组氨酸；2）存在发生组氨酸脱羧的条件；3）存在适宜微生物生长的环境。与产生组胺有关的细菌普遍存在于盐水环境中，通常存活在鱼体的鳃和内脏中，其主要为一些如杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、变形菌属、假单胞菌属、沙丁氏菌属、链球菌属等微生物2，因此鱼肉因组胺含量超标而引起的组胺中毒事件时有发生36。在体内，组胺是一种重要的化学递质，当机体受到某种刺激引发抗原抗体反应时，
35、引起肥大细胞的细胞膜通透性改变，释放出组胺，与组胺受体作用产生病理生理效应。如组胺对血管通透性的影响7，中枢组胺具有改善学习记忆的作用8，组胺的促生长作用9，组胺降低缺氧性肺动脉高压10，组胺引起变态反应11等。陶志华等人12利用组氨酸肉汤培养液，对海水中的组胺生成菌进行筛选，然后通过生物化学实验和形态学实验，进而对组胺生成菌进行分析。结果分离得到2株细菌，依据两种组胺菌的特征和生理生化特征，分离菌可能分别属于奈瑟氏菌属、黄杆菌属。CHENHC等人13利用组氨酸胰蛋白酶大豆培养液，对引起食物中毒的金枪鱼团子中的组胺生成菌进行筛选，并对13株菌株的16RDNA进行PCR扩增，鉴定结果为三株肠杆菌
36、，两株成团泛菌，四株变栖克雷伯氏菌，四株粘质沙雷氏菌。李华等人14利用PCR技术及HPLC检测方法对22株中国优良酒酒球菌的生物胺代谢安全性进行研究。结果表明，PCR检测结果与HPLC测定结果一致，从我国葡萄产区筛选的优良酒球菌均不产生组胺。何健15报导摄入840MG组胺产生轻微中毒症状，超过40MG产生中等中毒症状，超过100MG产生严重中毒症状。马玲16对干酪中的生物胺进行了研究，并指出干酪中大量组胺的形成很可能归因于有脱羧酶活性的微生物，除脱羧酶的活性外，组胺的底物游离组胺酸的浓度也很重要，达到中毒剂量的胺的形成往往仅发现于蛋白降解过度的干酪。陆永梅等人17建立了测定酿造酒黄酒中生物胺含
37、量的高效液相色谱法，首次采用该法测定了黄酒中的生物胺，测得尸胺、组胺和亚精胺为005UG/ML。谢诚等人18研究了混合菌种发酵对草鱼肉微生物和生物胺变化的影响，研究表明混合菌种发酵鲢鱼和鲭鱼中的生物胺都得到了很好的控制，尤其是组胺的含量。孔维府等人19报导TLC法现已有效地应用于临床和生化检验、毒物分析、药材及其制剂真伪的鉴定、质量控制和资源调查等方面。与其他分析方法相比，TLC法无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷。但该法测组胺含量不够精确。TSAIYH等人20采用高效液相色谱法对引起一起食物中毒事件的罐装鲭鱼的组胺含量进行了检测。此方法在测组胺时经常采用，但分析时间稍长。此法优点是分
38、离度高，能将各种成分有效分离，具有良好的峰型，因此该方法对食品中生物胺的检测具有一定的应用意义。国外对食品中组胺的来源、代谢、检测方法、监测和毒性等做了大量研究工作，而我国则起步相对较晚，并且主要是对检测方法的研究，但尚有许多亟待解决的问题，比如我国常见食物发酵食品、动物性食品等中组胺污染水平的研究，食品保藏、加工、烹饪条件对食物中组胺含量的影响研究等，以及组胺形成机理的研究都较少21。12研究意义组胺是海洋鲭科鱼类中含量最多和最主要的生物胺，因此组胺含量常被作为检测这类水产品腐烂变质程度的指标。并且组胺属于单胺类神经递质，参与多种生理病理活动过程，如对睡眠、摄食、体温、精神情感性疾病的调节。
39、组胺原本就具有药理和毒理学作用，因此通过对组胺的研究可以更好的驾驭这种化学活性物质，避其不利，发挥益处，为人所用。宁波地区水产品丰富，出口的产品中很大一部分为中上层鱼类，这些产品因为组胺含量超标而被禁止出口的现象每年都有发生，通过更好的研究组胺，组胺产生菌，组胺形成机理及测定组胺的方法，可以选择更好的方法储藏和加工鱼类，从而有效降低鱼类中组胺含量，增加出口贸易。13主要研究内容本实验通过二步筛选法与常规筛选法对鲭鱼体内的组胺产生菌进行筛选，并对筛出的菌进行鉴定，确定菌株的种属。菌种的鉴定主要通过生理生化实验，分子生物学法（16SRRNA测序）来确定，并建立系统同源树。2材料与方法21实验材料2
40、11菌种来源组胺产生菌株来源于鲭鱼鱼体中。鲭鱼购于学校附近的菜市场，购置后的鲭鱼放在无菌保鲜袋中，立即送回实验室进行样品处理。212试剂胰蛋白胨（杭州微生物试剂有限公司）酵母浸粉（中国医药上海化学试剂公司）葡萄糖（广东光华化学有限公司）琼脂（北京陆桥技术有限责任公司）蛋白胨（杭州微生物试剂有限公司）酵母（中国医药上海化学试剂公司）L组氨酸（上海晶纯试剂有限公司）大豆胨北京陆桥技术有限责任公司牛肉膏北京陆桥技术有限责任公司正丁醇无锡市传妮化工有限公司引物16SF/16SR（上海英骏生物技术有限公司合成）氯化镁，硫酸钾，氯化钠，蔗糖，磷酸钾，碳酸钠，氯化钾均为分析纯。PMD19TSIMPLE，DN
41、ALIGASIONKITVER20TAKARA公司DNTPS、RTAQDNA聚合酶、T4DNALIGASE（含10缓冲液）TAKARA公司引物的序列16SF5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3上海英骏生物技术有限公司合成引物16SR的序列5CCGTCAATTCCTTTRAGTTT3上海英骏生物技术有限公司合成213仪器高速分散仪PH计，上海精科离心机ANKETDL802B双目生物显微镜XSP2C无菌操作台ZHJH1112氮吹仪DC12H，浙江三和科教仪器有限公司稳压稳流电泳仪DYY型,上海医用分析仪器厂生化培养箱SHP250,上海精宏实验设备有限公司数显恒温水浴锅HH6，山东省鄄城新华
42、电热仪器厂立式压力蒸汽灭菌器LDZX50KBS，上海申安医疗器械厂漩涡振荡仪GL88B，海门市其林贝尔仪器制造有限公司分光光度计CARY100紫外可见分光光度计，美国瓦里安公司密封式恒温可调电加热器FD2，嘉兴市欣欣仪器设备有限公司QIAQUICKGELEXTRACTION试剂盒，北京构尔德科技发展有限公司214培养基2141VRBG琼脂培养基，购于杭州微生物试剂有限公司2142TCBS琼脂培养基，购于杭州微生物试剂有限公司2143PI琼脂培养基蛋白胨200G氯化镁14G硫酸钾100G三氯生0025G琼脂136G蒸馏水1000MLPH值69712144组胺选择性培养基胰蛋白50G酵母50GL组
43、氨酸20GNACL5G琼脂15G甲酚红0520ML蒸馏水1000MLPH652145胰蛋白胨大豆胨琼脂（TSA）胰蛋白胨15G大豆胨5G氯化钠5G琼脂13G蒸馏水1000MLPH71752146糖发酵培养基蛋白胨培养基1000ML16溴甲酚紫乙醇溶液12MLPH76另配20糖溶液（葡萄糖）10ML2147淀粉培养基蛋白胨10GNACL5G牛肉膏5G可溶性淀粉2G蒸馏水1000ML琼脂1520GPH722148葡萄糖蛋白胨水培养液蛋白胨5G葡萄糖5GK2HPO42G蒸馏水1000MLPH7222实验方法221组胺产生菌的筛选方法2211二步筛选法筛选A倒平板将VRBG琼脂培养基、PI琼脂培养基、
44、TCBS琼脂培养基以及组氨菌选择培养基加热溶解，冷却至5560时，分别到平板。B制备10倍系列稀释样品匀液称取10G样品（36下放着16小时）放入盛有90ML稀释液的内置有玻璃珠的锥形瓶中，振荡摇匀10MIN，制成110的样品匀液。用1ML无菌吸管或移液枪吸取110样品匀液1ML，沿管壁缓慢注于盛有9ML稀释液的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1100的样品匀液。用同样的方法制成103，104，105，106，107的样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ML无菌吸管或吸头。C涂布平板根据对样品组胺产生状况的估计，选择23个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀
45、释时，吸取适量的匀液涂布到各平板中。每个稀释度做两个样，同时，分别吸取适量的空白稀释液涂布到各平板中作为空白组。D培养各平板置于351的恒温箱中培养24H。E初筛观察菌落特性，并记录，同时依据其特性，随机选择一些菌落，挑取接种到新的培养基平板中，置于351的恒温箱中培养24H，进行进一步的分离纯化（多次划平板），使菌落成为单菌落。将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到TSA斜面，置于4条件下保存，培养24H。F二次筛选将TSA斜面上的菌种接种到组胺菌选择培养基中，在35下培养24H。观测菌落特性，是否出现带有紫色光晕的紫色菌落出现，有则为阳性。222212颜色变化实验筛选A取干净的试管，
46、加入5ML的组胺选择性液体培养基，灭菌冷却后接菌，每株菌做两个平行，另外取空白稀释液做空白对照。B在35下培养24H36H后，再加12滴05的甲酚红溶液，振荡后看颜色变化。2213斑点实验筛选A将各菌种接种到5ML组胺选择性液体培养基中，培养12H，待用。B将无菌滤纸片放到倒有组胺选择性培养基的平皿中央，后用无菌枪头吸取510UML的培养液，滴到滤纸片上，后在351下培养，观察实验结果，确定斑点的大小。2214组胺生成确认实验A标准曲线的制作以组胺标准品溶液进行线性实验，各系列浓度为0、5、10、20、30、50UG/ML。取1ML各系列浓度的标准品溶液加到10ML的离心管中，依次加入4ML1
47、1碳酸钠溶液以及3ML反应试剂，混匀，5MIN后在496NM下测定各管的吸光值，并用蒸馏水做空白对照，每个浓度测定三次，以平均值计算。B待测样品的制备挑取分离出的单菌落接种到组胺选择性培养液中，于30下培养72H后，取1ML培养液于50ML的离心管中，加085的生理盐水定容至25ML，漩涡振荡混匀。取稀释液1ML于干净的10ML离心管中，加入1ML的生理盐水，再加05G的混合盐，剧烈振荡几次，加入1ML的正丁醇漩涡振荡1MIN，在3100G下离心10MIN，吸取上层有机相，重复萃取两次，合并有机相，取1ML萃取液于40水浴下氮气吹干，残余物用1ML蒸馏水溶解，待用。C组胺含量的测定1ML溶解液
48、中，依次加入5ML11碳酸钠溶液以及2ML反应试剂，混匀，5MIN后在496NM下测定各管的吸光值，并用蒸馏水做空白对照，每个样重复测定3次，取平均值。222组胺产生菌的鉴定方法2221革兰氏染色实验A涂片固定。B草酸铵结晶紫染1分钟。C自来水冲洗。D加碘液覆盖涂面染约1分钟。E水洗，用吸水纸吸去水分。F加95酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。G蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。2222生理生化试验方法各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物不同，反应出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性
49、可被作为细菌鉴定和分类的重要内容23。A糖发酵试验糖发酵试验是常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为能源及碳源，但是细菌的分解糖类的能力上有相当大的差异，某些菌能使某些单糖或双糖分解，并产酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（甲烷、氢、二氧化碳），或者只产酸而不产生气体。酸和气体的产生与否，可以由培养后试管指示剂的颜色变化和小套管内气泡的有无来判定。当发酵产酸时，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色。方法1）将上述含指示剂的蛋白胨水培养基分装于试管中，在每管内放一支倒置的小玻璃管（DURHAMTUBE）。2）将已分装好的蛋白胨水培养基和20的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121灭菌20MIN，糖溶液112灭菌30MIN。3）灭菌后，每管以无菌操作加入20的无菌糖溶液05ML。B淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。方法以1824H的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板或直接移种于淀粉肉汤中，于361培养2448H，或于20培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养物表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（
