1、本科毕业论文系列开题报告生物工程吡啶类抑制剂与蛋白激酶B的作用模式与构效关系研究一、选题的背景与意义蛋白激酶B（PKB）于1991年首次被鉴定，它为一个近60KD的蛋白，是AGC激酶家族的一员，与PKC、PKA均有很高的同源性（与PKC的同源性为73，与PKA的同源性为68），故被命名为PKB（PROTEINKINASEB）或RACPK（RELATEDTOTHEAANDCKINASE），此外，该激酶被证明为逆转录病毒AKT8的癌基因VAKT编码的蛋白产物，且能使SER/THR磷酸化，故又称之为丝氨酸/苏氨酸激酶AKTSERINE/THREONINEKINASE,AKT。到目前为止，发现了三种同
2、功酶AKT1、AKT2和AKT3。肝癌细胞的扩增实验表明，AKTL在人类恶性肿瘤的发病机制中起着重要作用。PKB可以直接或间接调节糖类的转运、糖原的合成及蛋白质的合成抑制细胞凋亡等生理活动，在细胞增生、分化、凋亡和代谢等一系列生理活动中起着重要作用。LI等人合成了一系列的3,5二取代吡啶类蛋白激酶B抑制剂，并得到了该类抑制剂与蛋白激酶A复合物的X衍射晶体结构。该类抑制剂对蛋白激酶B与酪氨酸激酶（TYROSINEKINASE,TK）、钙调素蛋白激酶（CALCIUM/CALMODULINPROTEINKINASE,CAMK）有好的抑制选择性。最近，解析得到PKB的晶体结构。故选择活性最高的3,5二
3、取代吡啶类抑制剂，通过分子对接的方法构建其与PKB的复合物，得到较合理的药效构象，然后构建其余的3,5二取代吡啶类抑制剂，建立3DQSAR模型，指导PKB抑制剂的设计。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容（1）获取PKB的晶体结构和3，5二取代吡啶类抑制剂的结构和活性数据（2）分子对接构建活性最高的3，5二取代吡啶类抑制剂与PKB的复合结构（3）以活性最高的3,5二取代吡啶类抑制剂的对接构象为模板，构建其它抑制剂的三维结构（4）采用COMFA软件计算结构参数，建立3DQSAR模型拟解决的主要问题（1）通过分子对接构建3，5二取代吡啶类抑制剂与PKB结合时的药效构象（2）建立3DQSAR
4、模型，给出这类抑制剂的结构修饰改造的思路三、研究的方法与技术路线四、研究的总体安排与进度201009201012完成选题、查看文献，写文献综述、任务书、开题报告201012201102构建抑制剂化合物的二维结构，翻译两篇外文文献201102201103完成分子对接，构建抑制剂化合物的三维结构，学习COMFA软件操作201103201104建立3DQSAR模型。对实验结果进行分析，论文撰写。五、主要参考文献1唐波PKB/AKT信号通路与肿瘤J国外医学临床生物化学与检验学分册,2004,21251272JONESPF,JAKUBOWICZT,PITOSSIFJ,ETALMOLECULARCLONI
5、NGANDIDENTIFICATIONOFASERINE/THREONINEPROTEINKINASEOFTHESECONDMESSENGERSUBFAMILYPROCNATLACADSCIUSA,1991,8841714173NICHOLSONKM,ANDERSONNGTHEPROTEINKINASEB/AKTSIGNALINGPATHWAYINHUMANMALIGNANCYCELLSIGNAL,2002,143813954BELLACOSAA,TESTAJR,STAALSP,ETALARETROVIRALONCOGENE,AKT,ENCODINGASERINETHREONINEKINASE
6、CONTAININGANSH2LIKEREGIONSCIENCE,1991,72542745周颖,王建,贺福初蛋白激酶BPKB/AKT的结构、调控与功能J生命的化学,2006,72262286陈舌,黄传新蛋白激酶B与信号传导J国外医学分子生物学分册,2000,742457王望,王宪磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B信号系统国外医学分子生物学分册,2000,145498刘伦华,楼丽广丝苏氨酸蛋白激酶AKT及其靶向药物研究进展J中国药理学通报,2006,1149CHRISTOPHER,LEWISOCPHOSPHOINOSLTIDE3KINASEANDTHEREGULATIONOFCELLGROWTHBIC
7、HIMBIOPHYSACTA,1996,1288M11M1610赵学芹,黄宪章AKTPKB信号通路调控机制的研究进展J广东医学,2009,121920192211富萍蛋白激酶B与冠心病沈阳医学院学报N,2001,423423712ROMMELC,CAMPSM,JIHPI3KANDPI3KPARTNERSINCRIMEININFLAMMATIONINRHEUMATOIDARTHRITISANDBEYONDJNATREVIMMUNOL,2007,7319120113MANNNGBD,CANTLEYLCAKT/PKBSIGNALINGNAVIGATINGDOWNSTREAMJCELL,2007,12
8、971261127414GAOT,FURNARIF,NEWTONAC,ETA1PHLPPAPHOSPHATASETHATDIRECDYDEPHOSPHORYLATESAKT,PROMOTESAPOPTOSIS,ANDSUPPRESSESTUMORGROWTHJMOLCELL,2005，181132415陈鹭颖,史道华蛋白激酶B在糖代谢中的作用及药物干预福州总医院学报J,2005,4535235416ALEMZADEHR,ZHANGJ,TUSHAUSK,ETALDIAZOXIDEENHANEESADIPOSETISSUEPROTEINKINASEBACTIVATIONANDGLUCOSETRAN
9、SPORTER4EXPRESSIONINOBESEZUCKERRATSJMEDSCIMONIT,200410BR536017周巧生联苯取代的1，2，4噁二唑类小分子PKB抑制剂的设计与合成D浙江大学药学院,200815818SUNDQVISTA,BENGOECHEAALONSO,LUKIYANCHUK，V,ETALCONTROLOFLIPIDMETABOLISMBYPHOSPHORYLATIONDEPENDENTDEGRADATIONOFTHESREBPFAMILYOFTRANSCRIPTIONFACTORSBYSCFFBW7CELLMETAB2005,1,37939119JOZWIAKJ,E
10、TA1POSITIVEANDNEGATIVEREGULATIONOFTSC2ACTIVITYANDITSEFFECTSONDOWNSTREAMEFFECTORSOFTHEMTORPATHWAYNEUROMOLECULARMED,2005,7428729620TRAN,H,BRUNET,A,GRIFFITH,ECETALTHEMANYFORKSINFOXOSROADSCISTKE2003,RE521LIANGJ,ZUBOVITZJ,PETROCELLIT,ETALPKB/AKTPHOSPHORYLATESP27,IMPAIRSNUCLEARIMPORTOFP27ANDOPPOSESP27MEDI
11、ATEDG1ARRESTETA1NATKLED,2002,81153116022VIGLIETTOG,MOTTIML,ETA1REGULATIONOFP27KIP1PROTEINLEVELSCONTRIBUTESTOMITOGENICEFFECTSOFTHERET/PTCKINASEINTHYROIDCARCINOMACELLSIVATMED,2002,81136114423LUOY,SMITHRA,GUANR,ETALPSCUDOSUBSTRATEPEPTIDESINLIVERDISEASESDETECTIONANDCANSERVEASAPROGNOSTICDURINGCANCERRHERA
12、PYBIOCHEMISTRY,2004,431254126324CRAIGWL,ZHIJIANZ,WILLIAMHL,ETA1BIOMEDICALRESEARCHEDUCATION整合蛋白激酶ILK是重要的AKT活化的上游调节物，虽不直接参与，但能调节SER473磷酸化等。3PKB的生理学功能31葡萄糖代谢15胰岛素与受体结合后，通过PI3K途径主要激活PKB使细胞内特定的GLUT4储存囊泡GSVS释放囊泡相关膜蛋白2，导致GLUT4易位，促进组织摄取葡萄糖16作用于己糖激酶，促进葡萄糖的吸收；糖原合成酶激酶3GSK3是PKB的直接底物，活化的PKB可使GSK3的SER位点磷酸化，导致糖原合成
13、酶不能被磷酸化,糖原合成增加；PKB能够通过作用于低氧诱导因子HIF，促进糖酵解酶的表达，加速糖酵解，从而维持血糖的稳定17。32脂质代谢PKB也是通过磷酸化抑制GSK3，调节脂质代谢。通常GSK3磷酸化其底物后，可导致蛋白酶体的降解。已经发现GSK3能够促进甾醇调节因子结合蛋白SREBP的降解18。SREBP是一类转录因子，可以开启参与胆固醇及脂肪酸合成过程的基因的表达。因此，PKB介导GSK3的抑制作用，可增加SREBP的稳定性，促进脂质的合成。33蛋白质合成代谢PKB在蛋白质合成中的作用是抑制某些蛋白质的合成。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白MTOR能够磷酸化底物核糖体40S小亚基S6蛋白激酶P7
14、0S6K和真核起始因子4E结合蛋白I4EBPL，从而活化P70S6K，抑制4EBPL，起始翻译过程。PKB可以磷酸化其SER448残基，活化MTOR，从而减慢蛋白质合成19。34细胞存活PKBAKT通过磷酸化和失活几种促凋亡靶点促进细胞存活，其中包括BCL2相关促死蛋白BAD、胱天蛋白酶9CASPASE9和应激活化蛋白激酶SAPK通路上游激酶。另外，PKB也可以通过作用于转录因子来抑制一些促凋亡蛋白表达，促进细胞存活，其中包括FOXO和P53。例如，PKB可以在胞核内磷酸化FOX01的THR24、SER256和SER319残基；FOX03A的THR32、SER253和SER315残基；FOX0
15、4的THR32、SERL97和SER262残基。FOXO被磷酸化后与1433蛋白结合，从目标基因上替代FOXO转录因子，并诱导它们转移出细胞核20。通过这种机理，PKB阻滞那些促凋亡、细胞周期停滞以及代谢过程的目标基因的转录。35细胞周期调控PKBAKT可以通过抑制GSK3而增加周期蛋白DCYCLIND的积累，负调控周期蛋白激酶CDK的抑制剂P27KIPL（是周期蛋白激酶CDK的抑制剂，被PKB磷酸化THRL57残基后与1433蛋白结合，而聚集于胞质中2122）和野生型P53激活中断1P21CIP1WAF1，通过增加鼠双小蛋白2MDM2活性导致P53降解，调控细胞周期。36转录调控PKB在活化
16、后可以由细胞质移位到细胞核内，磷酸化一系列核因子，从而发挥转录调控的作用。这些作用主要表现在1磷酸化FOXO家族转录因子，使转录因子出核，降低转录活性；2促进转录因子K基因结合核因子NFB转录。通常IB使NFB定位于胞质中，IB被上游激酶IKKS磷酸化后降解，使NFB移位到核内，促进靶基因的转录。PKB直接磷酸化IKKA，使IKK激活，调节NFB活性。4PKB抑制剂研究进展41磷脂酰肌醇类似物抑制剂设计合成磷脂酰肌醇类似物，可以当作底物竞争性地与P13K发生作用，抑制P13K磷酸化PTDINS4，5P2的3位羟基，从而减少PTDLNS3，4，5P3的生成。PKB因此无法与PTDLNS3，4，5
17、P3结合而被转移。这种抑制方法可以阻止PKB由胞质向胞膜的转移，从而阻止了它的活化。42假底物抑制剂AKTIDE2T是一个14MET的肽，可以结合到PKB仅的底物结合位点，对PKB形成抑制，抑制常数KI常数达到12UM23。将转录因子FOXO3的1624号氨基酸序列与之糅合，得到一个KI为11UM的20MET的杂肽。用ALA代替磷酸化位点的SER,抑制活性有了10倍的提高，KI达到11UM。这类抑制剂由于分子过大，使得它们难以作为小分子抑制剂的先导化合物被研究和应用。43PKB别构抑制剂由于PKB三种亚型在结构上存在稍微的差别，特别是在39个氨基酸残基的连接部位的差别，使得PKB、PKB及PK
18、B在功能上也不尽相同，利用这些差别可以选择性的对他们进行抑制。CRAIGWLINDSLEY等人24利用高通量筛选得到对PKB、PKB及PKB都有抑制活性的先导化合物，该化合物显示了较高的异构体选择性，对PKB、PKB及PKB分别为3400NM、23000NM及大子50000NM，而对于同为AGC家族的其它蛋白则无抑制活性对PKA、PKC、SGK的IC50都在50000NM以上。研究发现它对缺少PH结构域的PKB突变体是没有抑制活性的，并且它对PKB的抑制与ATP是非竞争的，揭示它可能是结合于PKB上的别构位点，属于一类PH结构域依赖性的非ATP竞争性抑制剂。44ATP竞争性抑制剂25JONGH
19、EEKO等人，发现1H吲唑4，7二酮类化合物在胞外对PKB有抑制作用。由此他们合成了一系列1H吲唑4，7二酮的衍生物。对5位以不同的芳胺取代，发现以间氟苯胺和对三氟甲基苯胺的活性最好，得到两种化合物。它们对PKB的IC50分别为1189UM和124UM，优于阳性对照物SWU2009IC5025OUM。用KATOIII细胞株、HEPG2细胞株以及PC3细胞株对这两种化合物进行了细胞毒性试验，发现它们都具有较好的细胞毒性。因为他们竞争性的结合于ATP结合口袋，通过对不同ATP浓度下的抑制活性的研究发现，低ATP浓度时，抑制活性高，而高ATP浓度时，抑制活性低，由此判断这两种化合物是一种ATP竞争性
20、的PKB抑制剂。由此，我们发现了很多这样的ATP抑制剂，像3,5二取代吡啶类抑制剂26、3异喹啉吡啶27及其修饰产物，也是我们目前PKB抑制剂的研究方向。45P13KPKB通路抑制剂由于PKB的活化首先要通过PTDLNS3，4，5P3将其募集到胞膜上，再由同样被PTDLNS3，4，5P3募集到胞膜上的PDKL磷酸化。所以设计一类可以抑铜JPDKL活性的化合物，也是可以间接抑制PKB的活性。46机理未知的抑制剂化合物44API21871是一个杂环核苷，在变异细胞中，能够抑制PKBP的磷酸化。它对P13K和PDKL无抑制作用。在许多肿瘤细胞株中，API2诱导凋亡，抑制PKB口过表达的肿瘤的生长。尽
21、管其抑制机理尚不清楚，它已经应用于L期临床并和2期临床的研究，也发现了包括导致高血糖在内的许多副作用。PKB抑制剂的研究方向主要是向分子量小，作用稳定，高效的方向发展，除了天然发现的PKB抑制剂外，也有大量人工合成的PKB抑制剂。现在一般是通过电脑模拟计算和实验的对比，来获得我们期望得到的抑制剂。综上所述，我们从PKB的结构、活化调节、生理功能及其抑制剂的研究进展可以知道，其在介导调节细胞代谢、细胞存活、细胞周期调控、转录调控等多种生物学过程中发挥着重要作用。现在我们努力研究新的抑制剂，通过调控PKB的活性，间接调节其调节的生理通路的进行，从而可以治疗人类一些疾病，如肿瘤、糖尿病等。参考文献1
22、唐波,姜军PKB/AKT信号通路与肿瘤J国外医学临床生物化学与检验学分册,2004,2521251272JONESPF,JAKUBOWICZT,PITOSSIFJ,ETALMOLECULARCLONINGANDIDENTIFICATIONOFASERINE/THREONINEPROTEINKINASEOFTHESECONDMESSENGERSUBFAMILYJPROCNATLACADSCI1991,8810417141773NICHOLSONKM,ANDERSONNGTHEPROTEINKINASEB/AKTSIGNALINGPATHWAYINHUMANMALIGNANCYJCELLSIGNA
23、L,2002,1453813954BELLACOSAA,TESTAJR,STAALSP,ETALARETROVIRALONCOGENE,AKT,ENCODINGASERINETHREONINEKINASECONTAININGANSH2LIKEREGIONJSCIENCE,1991,25450292542745周颖,王建,贺福初蛋白激酶BPKB/AKT的结构、调控与功能J生命的化学,2006,732262286陈舌,黄传新蛋白激酶B与信号传导J国外医学分子生物学分册,2000,7142457王望,王宪磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B信号系统J国外医学分子生物学分册,2000,22145498刘伦华,楼
24、丽广丝苏氨酸蛋白激酶AKT及其靶向药物研究进展J中国药理学通报,2006,221149CHRISTOPHER,LEWISOCPHOSPHOINOSLTIDE3KINASEANDTHEREGULATIONOFCELLGROWTHJBICHIMBIOPHYSACTA1996,12881M11M1610赵学芹,黄宪章AKTPKB信号通路调控机制的研究进展J广东医学,2009,30121920192211富萍蛋白激酶B与冠心病N沈阳医学院学报,2001,3423423712ROMMELC,CAMPSM,JIHPI3KANDPI3KPARTNERSINCRIMEININFLAMMATIONINRHEUM
25、ATOIDARTHRITISANDBEYONDJNATREVIMMUNOL2007,7319120113MANNNGBD,CANTLEYLCAKT/PKBSIGNALINGNAVIGATINGDOWNSTREAMJCELL,2007,12971261127414GAOT,FURNARIF,NEWTONAC,ETA1PHLPPAPHOSPHATASETHATDIRECDYDEPHOSPHORYLATESAKT,PROMOTESAPOPTOSIS,ANDSUPPRESSESTUMORGROWTHJMOLCELL2005,181132415陈鹭颖,史道华蛋白激酶B在糖代谢中的作用及药物干预福州总医院
26、学报J,2005435235416ALEMZADEHR,ZHANGJ,TUSHAUSK,ETALDIAZOXIDEENHANEESADIPOSETISSUEPROTEINKINASEBACTIVATIONANDGLUCOSETRANSPORTER4EXPRESSIONINOBESEZUCKERRATSJMEDSCIMONIT2004,103BR536017周巧生联苯取代的1，2，4噁二唑类小分子PKB抑制剂的设计与合成D浙江大学药学院,200815818SUNDQVISTA,BENGOECHEAALONSO,LUKIYANCHUKV,ETALCONTROLOFLIPIDMETABOLISMBY
27、PHOSPHORYLATIONDEPENDENTDEGRADATIONOFTHESREBPFAMILYOFTRANSCRIPTIONFACTORSBYSCFFBW7JCELLMETAB2005,1637939119JOZWIAKJ,SERGIUSZJOZWIAK,TOMASZGRZELAETA1POSITIVEANDNEGATIVEREGULATIONOFTSC2ACTIVITYANDITSEFFECTSONDOWNSTREAMEFFECTORSOFTHEMTORPATHWAYJNEUROMOLMED2005,7428729620TRAN,H,BRUNET,A,GRIFFITH,ECETALT
28、HEMANYFORKSINFOXOSROADJSCISTKE2003172,RE521LIANGJ,ZUBOVITZJ,PETROCELLIT,ETALPKB/AKTPHOSPHORYLATESP27,IMPAIRSNUCLEARIMPORTOFP27ANDOPPOSESP27MEDIATEDG1ARRESTETA1JNATKLED2002,8101153116022VIGLIETTOG,MOTTIML,MARIALETIZIAMOTTIETA1REGULATIONOFP27KIP1PROTEINLEVELSCONTRIBUTESTOMITOGENICEFFECTSOFTHERET/PTCKI
29、NASEINTHYROIDCARCINOMACELLSJIVATMED,2004,64113823382923LUOY,SMITHRA,GUANR,ETALPSCUDOSUBSTRATEPEPTIDESINLIVERDISEASESDETECTIONANDCANSERVEASAPROGNOSTICDURINGCANCERRHERAPYJBIOCHEMISTRY,2004,4371254126324CRAIGWL,ZHIJIANZ,WILLIAMHL,ETA1BIOMEDICALRESEARCHEDUCATIONCOMPARATIVEMOLECULARFIELDANALYSIS3,5DISUBS
30、TITUTEDPYRIDINEINHIBITORSCOMFAMODELTHREEDIMENSIONALPOTENTIALDIAGRAM1引言11PKB蛋白激酶B（PKB）于1991年首次被鉴定，它为一个近60KD的蛋白，是AGC激酶家族的一员，与PKC、PKA均有很高的同源性（与PKC的同源性为73，与PKA的同源性为68）1，故被命名为PKB（PROTEINKINASEB）或RACPK（RELATEDTOTHEAANDCKINASE）。此外，该激酶被证明为逆转录病毒AKT8的癌基因VAKT编码的蛋白产物，且能使SER/THR磷酸化，故又称之为丝氨酸/苏氨酸激酶AKTSERINE/THREON
31、INEKINASE,AKT2。肝癌细胞的扩增实验表明，AKTL在人类恶性肿瘤的发病机制中起着重要作用3。PKB存在多种亚型，常见的有AKT1，AKT2，AKT3等，其各亚型在结构上的同源性较高，氨基酸均含一个血小板一白细胞C激酶同源区。PKBAKT为单链的结构，由3个结构域DOMAIN组成第1147位氨基酸构成其N一端的调节区AHDOMAIN，其中第1106位氨基酸构成PH区域PLECKSTRINHOMOLOGY，该区域参与与其他一些蛋白质如G蛋白亚基及脂类如磷脂酰肌醇之间的相互作用。第148411位氨基酸构成其丝苏氨酸激酶区域（催化区域），与其它丝苏氨酸蛋白激酶有较多的同源性，包含一个保守的
32、苏氨酸位点THR308THR309或THR305。第412480位氨基酸构成其C末端尾部区域，除PKB外，均有一个丝氨酸SER473/474位点47。通过依赖PI3K的激活89或不依赖PI3K的激活来磷酸化PKB的两个磷酸化位点，PKB被激活并在葡萄糖代谢10、脂质代谢11、蛋白质代谢12、细胞存活13、细胞周期调控1415及转录调控中发挥着重要的作用。基于PKB为靶点的抗肿瘤药物研究正在蓬勃发展，并且取得了一些具有开发前景的化合物，临床前实验已证明这些PKB特异性抗肿瘤候选化合物可以拮抗PKB的抗调亡作用，破坏癌细胞耐药性，诱导癌细胞调亡，因而可能成为更有效的抗肿瘤药物。123,5二取代吡啶
33、类抑制剂3,5二取代吡啶类抑制剂是一系列的PKB小分子抑制剂。这类抑制剂的3个基本结构如图1中的2号、35号、45号化合物，通过对取代基的替换合成得到了如图1的55个化合物1617。该类抑制剂通过与PKB受体的结合，影响其磷酸化，激活受阻，其相应的生理功能就不能发挥。13分子对接分子对接18是将已知三维结构数据库中的分子逐一放在靶标分子的活性位点处。通过不断优化受体化合物的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角和受体的氨基酸残基侧链和骨架，寻找受体小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象，并预测其结合模式、亲和力和通过打分函数挑选出接近天然构象的与受体亲和力最佳的配体的一种理论模拟分子间作用的方法
34、。根据对接时配体分子的形式分子对接可分为二种基本类型1整体分子对接法，即运用种特定搜索算法考察配体分子在受体结合部位的能谱，并找出对应于给定评分函数的最优结合方式；2基于片段对接法，即配体分子被视为若干片段结构的集合，先将其中一个或几个基本片段放结合口袋，然后在活性部位构建分子的其余部，最终得到理论上最优的结合方式。分子对接方法有三种，分别是刚体对接、半柔性对接、柔性对接，其在计算机上的模拟应用也越来越广泛，如发展的反向对接在药物研究中具有诸多的潜在应用和其在组合化学和高通量筛选中应用。本文分子对接采用GOLD软件进行对接优化。GOLD软件中的计算是建立在物象空间正则归一化坐标的初始阶段的针对
35、共轴对称光学系统的特点设计的。它的一个重要特征是在系统的人、出瞳上分别引入了以物点和几何象点为球心的参考球面，以取代传统的光瞳平面。此外，对光瞳坐标用近轴边缘光线在参考球面上的投射高度进行了归一化，对物、象面坐标用物方空间和象方空间的数值孔径进行了归一化。本软件旨在处理非对称、非常复杂光学系统而开发的，随着一些辅助工具的加入，加工公差自动分配和加工图纸的自动绘图等，分子对接也将受体和配体建立到同一个空间坐标内，通过一些优化参数的引入和函数打分等操作，得到对接较好的受体分子空间三维结构。由于这种方法的精确度较高，GOLD也渐渐普遍的应用与分子对接中。同时相应的分子对接软件也越来越多，如DOCK、
36、FRED、SURFLEX、MVD等软件，其中MVD是最新开发的一种新的对接软件，具有更好的精确度。但是，本文分子对接采用的是精确度也较高的GOLD软件。14COMFA比较分子力场分析（COMFA）方法基本原理是如果一组化合物以同样的方式作用于同一靶点，那么它们的生物活性就取决于每个化合物周围分子场的差别，这种分子场可以反映药物分子和靶点之间的非键相互作用特性。COMFA方法中的分子场主要是立体场和静电场，以SP3杂化的C作为探针离子，网格自动产生，进行偏最小二乘法分析得R2，用抽一法进行交叉验证得Q2，最后进行非交叉验证。比较分子力场分析（COMFA）方法是三维定量构效关系3DQSAR中应用最
37、为广泛的方法之一。通过分子场势能函数的选择、新场的引入、配体活性构像的确定、分子叠合、分子场变量的的选择等这几方面的研究优化，指导药物分子的设计或结构修饰。近年来,常与对接方法联用,通过分析化合物活性变化趋势与分子对接结果,能很直观地分析影响化合物活性的一些重要因素,更利于设计高活性的抑制剂。2计算方法21化合物选择通过查找文献，我们找到了55个3,5二取代吡啶类抑制剂化合物公共骨架和取代基。采用绘制化学分子式的软件CHEMDRAW绘出55化合物的二维平面结构（图1）。010203040506070809101112131415161718192021222324252627282930313
38、23334353637383940414243444546474849505152535455图155种化合物的结构式FIGURE1THESTRUCTUREOF55COMPOUNDS22分子对接由于COMFA研究涉及到化合物分子的三维结构，因此其先决条件是分子构象的选取，即确定各个化合物的药效构象对QSAR研究的影响很大。最近解析得到PKB与其它抑制剂的晶体结构19，这个晶体结构的获得是我们进一步获得3,5二取代吡啶类抑制剂化合物药效构象的基础。将PKB与其它抑制剂的复合物晶体结构（PDBID3QKM）和PKA与抑制剂35号化合物的晶体结构PDBID2F7E在SYBYL73中进行叠合，将35号
39、化合物构建成45号化合物，并固定公共骨架部分而进行局部优化。将PKB和45号化合物合并在一起构建对接的初始化合物。对接采用GOLD50软件，选取抑制剂周围6为活性口袋，用遗传算法（GA）产生配体构象，配体采用完全柔性，蛋白采用刚性，采用GOLDSCORE打分函数评价抑制剂构象结合能力。得到最佳的化合物45的药效构象。233DQSAR模型的建立通过分子对接方法，我们确定了化合物45与PKB结合的最优结构。以化合物45为基础，用SYBYL73中的BUILD模块构建其余54个化合物。并用SYBYL中的MINIMIZE模块对新建的化合物采用分子力学进行部分骨架固定结构优化（固定的骨架部分见图2A）。分
40、子力学方法进行分子优化参数设置20TRIPOS标准分子力场，GASTEIGERHCKEL电荷，POWLL能量优化方法，能量收敛标准为005KCAL/MOL和MAXITARATIONS为1000、GARADIENT为0005、COLOUR中OPTION为FORCE。然后将55种化合物进行叠合，化合物叠合图见图2（B）。采用AUTOFILL方式得到该类化合物的立体场和静电场参数，用“留一法”计算交叉验证系数Q2和主成分数N，采用非交叉验证得到人R2。（A）（B）图255种化合物的叠合图FIGURE2THECOMPOSITEMAPOF55COMPOUNDS3结果与讨论31分子对接模型抑制剂45与PK
41、B对接结果见图3。抑制剂45与PKB共形成2个盐桥作用和2个氢键作用，包括质子化的NH3与GLU234、GLU278的支链羧基之间分别形成一个盐桥键，嘧啶环上的氮原子与LYS179支链氨基形成氢键，吡唑环上的氮原子与ALA230骨架氨基形成氢键。图3抑制剂45与PKB的对接图FIGURE3THEDOCKINGFIGUREOFINHIBITOR45BINDINGWITHPKB32COMFA模型COMFA模型中所有化合物伯胺中的氮原子都采用质子化的形式。利用AUTOFILL所产生的立体场和静电场参数，采用PLS分析得到很好的COMFA模型。交叉验证相关系数Q2为0612，最佳主成分数为9，由最佳主
42、成分数进行非交叉验证建立的COMFA模型的常规相关系数（R2）为0977，标准方差（SEE）为0254，F值为212845，立体场和静电场的贡献值分别为622和378（表1）。表1COMFA结果TABLE1RESULTSOFCOMFAMODELQ2R2FSCOMFA061209772128450254COMFA共选用了55个分子，其中训练集47个分子，预测集8个分子。预测集分子具有一定的代表性，化合物活性实测值与预测值结果如表二所示。表2化合物活性理论值与计算值结果TABLE2THETHEACTUALPIC50ANDCALCULATEDONEOF55COMPOUNDSNOOFMODEL1MOD
43、EL2COMPOUNDEXPERIMENTALVALUECALCULATEDVALUERESIDUALVALUESEXPERIMENTALVALUECALCULATEDVALUE1616585030959512785800015270273668636031764244460454006047165569564004955326450459008644497501495005849848503495007650699554548006455241056755601125619114734890164483312516507009263721365969303396845145875770101
44、566415574571002651531658155502655254175165120043521618450496046249081950351000695128205866000137603821664669005067372249248200984904234484650171453624448443004644225595589005958126557555002556152754453401005354284844720120463329521535014053430584590006159773156655301285664326526230287662335155700546
45、674434672664008467013588989400468794367737610124766737870909038787963876777200497623990186903248837407537350181756141751752000967742620598021859164365767501806847446886810066690245104410220216100994692495703339698478718540170869948904895009388349861885024388509549340204935151717758040775565284877707
46、1267753584622037859154685727042170395570670600016886表3模型二的结果TABLE3RESULTSOFMODEL2MODELQ2R2FSNNCOMFA063009842561920254478注N训练化合物的个数；Q2交叉验证相关系数；N最佳组分数；R2非交叉验证相关系数；S标准差；F检验值表1和2给出了由COMFA模型得出的预测值与实测值的相关关系，从图中也可以看出分子的预测值和实测值的拟合较好。图4中横坐标代表实测值，纵坐标代表预测值，如表2所示。45678910114567891011CALCULATEDPIC50ACTUALPIC50图4
47、COMFA模型理论值与计算值的相关性FIGURE4THERELATIONSHIPBETWEENTHEACTUALPIC50ANDCALCULATEDONE45678910114567891011CALCULATED/PREDICTEDPIC50ACTUALPIC50图5训练集COMFA模型理论值与计算值的相关性FIGURE5THERELATIONSHIPBETWEENTHEACTUALPIC50ANDCALCULATEDONEINTRAININGSET33COMFA的三维等势图以下COMFA模型图分别为化合物FITATOM叠合的立体场（图6）和静电场等势图（图7），绿色区域表示增加基团的体积有
48、利于提高分子活性，黄色区域表示减小基团的体积有利于提高分子活性，红色区域表示增加负电荷基团有利于提高分子活性，蓝色区域表示增加正电荷基团有利于提高分子活性。图中加入的化合物为模板分子45号抑制剂。图6COMFA立体场等势图FIGURE6STERICMAPEQUATIONOFCOMFAGREENYELLOWYELLOW图7COMFA静电场等势图FIGURE7CONTOURMAPSOFCOMFA以45号化合物为参考分子，分子结构各原子位置如图1。从图5可知，参考分子吡啶环上覆盖这较大的黄色区域，说明该区域减少基团的体积有利于化合物的活性的提高，如化合物的45的抑制活性高于化合物46，化合物46的抑
49、制活性高于47。以化合物31为参考，苯环上2位覆盖较大的绿色区域，说明该区域增加基团的体积有利于化合物的活性的提高，化合物28的抑制活性低于化合物29，化合物29的抑制活性低于化合物30。由图6可知，参考物吡啶环第2位覆盖这大面积的蓝色区域，表示在这个区域增加正电荷有利于提高分子活性，如化合物的抑制活性35高于化合物36。参考物苯环下方覆盖这大面积的红色区域，表示在这个区域增加负电荷有利于提高分子的活性，化合物44的抑制活性低于化合物45。4结论应用COMFA方法对一系列具有一定结构多样性及相似性的3,5二取代吡啶类抑制剂进行结构和活性的研究，得到了较好的Q2和R2值，表明这个模型表现具有较高的预测及拟合能力。对接图显示该类抑制剂与PKB之间形成氢键和盐桥键作用。COMFA模型两个主要参数，交叉相关系数Q2为0612，非交叉相关系数R2为0977，由此可以得到模型具有良好的预报能力。由COMFA的立体场和静电场图，这说明了对这一系列化合物分子基团修改意见。从模型二中的数据可以表明我们这个COMFA模型的高预测能力，能有效的预测我们设定的8个最佳组分化合物，进一步验证我们模型的预测能力。参考文献1JONESPF,JAKUBOWICZT,PITOSSIFJ,E
