1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程几种添加剂对鲨鱼肉盐溶蛋白凝胶特性的影响一、选题的背景与意义鱼糜制品是利用鱼肉制成的凝胶食品，营养丰富，食用方便，深受消费者欢迎。如日本每年有250300万T的鱼类用于加工鱼糜制品。我国近几年的鱼糜及其制品加工发展也很快，其总量在2005年约为40万T。目前鱼糜制品的原料主要限于海水鱼类，但由于近几年海洋捕捞强度的加大，生产鱼糜制品的优质海水鱼的数量已下降。因此各国都在寻找鱼糜加工的新原料。鲨鱼肉是鱼翅生产中的下脚料，资源丰富。但鲨鱼肉由于本身具有腥味与尿味，其肌纤维粗硬，不能作为理想的人类食用鱼类。但鲨鱼肉富含蛋白质，将鲨鱼肉加工成鱼糜制品，一方面可实现
2、对鲨鱼的综合利用，另一方面又可为鱼糜制品加工业提供一种新的原料。凝胶强度是鱼糜制品最重要的一个质量指标，凝胶强度的高低将直接影响到鱼糜制品的商品价值。相比于其它鱼肉，鲨鱼肉的凝胶性能较差，寻找鲨鱼肉凝胶特性改良添加剂十分必要。本项目以资源丰富的鲨鱼肉为原料，以提取的盐溶蛋白所形成的凝胶保水性和质构特性为依据，研究TGASE、魔芋胶、琼脂三种添加剂对鲨鱼肉盐溶蛋白凝胶特性的影响，以改善鲨鱼肉盐溶蛋白的凝胶性能，并开发具有高品质的鲨鱼鱼糜制品提供理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究内容选择转谷氨酰胺酶（TGASE）、魔芋胶、琼脂三种添加剂，利用响应面法研究三种添加剂种类、添加量对鲨鱼
3、肉盐溶蛋白热诱导凝胶的影响。通过对凝胶的质构特性、保水性、超微结构及肌动蛋白组成等研究，筛选合适的的添加剂种类和添加量。拟解决的关键问题通过对凝胶的质构特性和保水性等研究，筛选合适的添加剂。三、研究的方法与技术路线技术路线鲨鱼肉预处理盐溶蛋白的提取盐溶蛋白凝胶制备凝胶指标测定研究方法1盐溶蛋白的提取和凝胶制备参照BERTRAM等的方法，并略作修改。2凝胶保水性测定参照赵春青等的方法，并略做改进。3凝胶强度的测定利用质构仪测定。参照林婉玲等方法，并略作改进。4超微结构测定凝胶切片，固定，电镜观察5电泳测定样品预处理浓缩胶和分离胶的制备上样染色脱色成像分析四、研究的总体安排与进度201010820
4、101215查阅资料，完成开题报告、文献综述；开题论证；201012162011420外文翻译、实验准备工作，研究三种添加剂对鲨鱼肉盐溶蛋白热诱导凝胶特性的影响；20114212011510整理数据，书写论文，完成答辩。五、主要参考文献1励建荣我国水产品加工业现状与发展战略J保鲜与加工,20053132张廷序中国水产品加工M北京农业出版社,19953段蕊,张俊杰浅谈海洋低值小杂鱼的综合利用J食品与发酵工业,2000,26653564孔保华,郑秋鹛鱼糜功能特性的研究现状J中国畜产与食品,1999,641891905汪之和水产品加工与利用J北京化学工业出版社,20032192376罗永康,沈慧星,
5、潘道东等鲢鱼鱼糜蛋白质凝胶特性的研究J食品与发酵工业,2001,28123267何阳春,洪咏平鱼糜制品弹性与鱼肉凝胶特性研究进展J水产科学,2004,23641438张俊杰,段蕊鱼糜凝胶过程及影响因索J中国水产,19991046489张俊杰,段蕊鱼糜的凝胶机理J淮海工学院学报,1999,83596210齐凤生漂洗工艺对鱼糜质量的影响J河北渔业,2002,391011陈申如,刘阳,李燕杰擂溃条件对鱼糜制品弹性的影响J大连轻下业学院学报,2004,919419712蔡长发鱼制品加工中蛋白质变性的研究J食品科技信息,1998,6171813SANCHEZI,CARECHEM,BORDERIASAME
6、THODFORPRODUCINGAFUNCTIONALPROTEINCONCENTRATEFROMGIANTSQUIDMUSCLEJFOODCHEMISTRY,2005,100485414BERTRAMC,ANDERSENHFUNCTIONALITYOFMYOFIBRILLARPROTEINSASAFFECTEDBYPH,IONICSTRENGTHANDHEATTREATMENTALOWFIELDNMRSTUDYJMEATSCIENCE,2004,6824925615赵春青,李继红,彭增起猪肉盐溶蛋白质热诱导凝胶功能特性的研究J食品工业科技,20058858716林婉玲,关熔,曾庆孝影响脆肉鲩
7、鱼背肌质构特性的因素J华南理工大学学报自然科学版,2009,37413413517郝磊勇,李汴生,阮征高压与热结合处理对鱼糜凝胶质构特性的影响J食品与发酵工业,2005,317353817陈艳,丁玉庭,邹礼根等鱼糜凝胶过程的影响因素分析J食品研究与开发,2003,6241318SEGUROK,KUMAZAWAY,OHTSUKAT,ETALMICROBIALTRANSGLUTAMINASEANDLYSINECROSSLINKEFFECTSONELASTICPROPERTIESOFKAMABOKEGELSJ,JFOODSCI,1995,6030531119TSUKAMASAY,MIYAKEY,AN
8、DOMETALEFFECTOFCONTROLOFENDOGENOUSENDOPEPTIDASEANDTGONSETTINGPROPERTYOFCARPMEATJNIPPONSUISANGAKKAISHI,2000,66471072520KOIDAY,KOBAYASHAM,HIRATAG,ETALSTUDIESONMICROCAPSULESINFLUENCEOFMOLECULARWEIGHTOFETHYLCELLULOSEINTHEMICROENCAPSULATIONOFASCORBICACIDJCHEMPHARMBULLTOKOYO,1984,32124971497821周爱梅,黄文华,刘欣等
9、转谷氨酰胺酶对鳙鱼鱼糜凝胶特性的影响J食品与发酵工业,20038273122赵梅荣,刘良忠谷氨酰胺转胺酶对草鱼鱼糜品质的影响J食品科学,2006,271217017423严菁,熊善柏,李清亮转谷氨酰胺酶对淡水鱼糜制品凝胶强度的影响J食品科学,2002,238596224杨华,娄永江,杨震峰等谷氨酰胺转胺酶在水产品中的应用J食品工业,2003,4474825周爱梅,曾庆孝,刘欣等两种蛋白类添加剂对鳙鱼鱼糜凝胶特性的改良J华南理工大学学报,2005,48791毕业论文文献综述食品科学与工程肌肉盐溶蛋白凝胶特性的影响因素研究进展摘要鱼糜的凝胶特性是鱼糜品质的一个重要指标。本文通过对鱼糜制品的凝胶机理
10、以及肌肉盐溶蛋白的漂洗、擂溃、加热方式方法等提取条件和不同添加剂对肌肉盐溶蛋白凝胶特性的影响的阐述，为鱼糜加工过程中如何提高凝胶强度这一焦点问题提供一个参考。关键词盐溶蛋白；凝胶特性；提取条件；添加剂引言我国海域蕴藏着极为丰富的渔业资源。进入80年代以来，我国渔业的发展已超过了世界人均占有量不到20KG的水平1。而随着捕捞强度的增大，海洋渔业资源逐年衰减,，海洋捕捞的中低值鱼产量呈上升趋势，而这些中低值鱼可用于产品加工的约占302。可以说海洋渔业的资源未得到充分利用，经济效益低下，如果对低值鱼进行综合加工利用，生产成鱼糜后，制成鱼肉香肠、片火腿、鱼肉火腿肠等方便食品上市,可实现大幅度增值，能获
11、得良好的经济效益。鱼糜制品是利用鱼肉制成的凝胶食品，营养丰富，食用方便，深受消费者欢迎。日本每年有250300万T的鱼类用于加工鱼糜制品3，近几年，我国的鱼糜及其制品加工发展也很快，其总量在2005年就已达到约为40万吨。鱼糜制品以及模拟海味食品的制作过程较简单，而且能制出具有和天然产品的外观、口感相类似的产品来。但到目前为止，我们仍有许多问题需要进一步研究，如不同鱼糜的凝胶特性、鱼糜的凝胶机理等。鱼糜制品其中最重要的一个质量指标就是鱼糜制品的凝胶强度，凝胶强度的高低将直接影响到鱼糜制品的商品价值，因而在不影响鱼糜制品本身品质的前提下，如何提高其凝胶强度就成为国内外研究的热点。1鱼糜制品凝胶机
12、理鱼糜中最重要的性质是它的凝胶特性，指鱼糜中肌动球蛋白质在一定浓度、温度、压力、PH值、离子强度、添加剂和酶等条件下形成三维网状交联体聚合物的能力。而在所有的动植物中，鱼糜的凝胶特性要比其他动物蛋白和植物蛋白大得多4。一般来说，鱼糜蛋白质形成凝胶过程主要经过3个阶段，即凝胶化、凝胶劣化和鱼糕化3个阶段。而凝胶化是这一个过程中最重要的阶段，通常指在50以前，肌球蛋白和肌动蛋白分子形成一个较松散的网状结构，由溶胶变成凝胶；升高温度到8090时凝胶结构固定化，变成有序和非透明状，凝胶强度明显加大，最终形成鱼糕56。而鱼肉肌肉中盐溶性蛋白质肌原纤维蛋白质，是鱼肉形成凝胶体的主要成分，也是形成鱼糜弹性的
13、重要来源。鱼肉肌肉中肌原纤维蛋白质，是盐溶性蛋白质在食盐的作用下，肌原纤维的粗丝和细丝开始溶解，其主要成分肌球蛋白和肌动蛋白吸收大量的水分并结合形成肌动球蛋白的溶胶。这种溶胶在一定温度下会失去可塑性，形成富有弹性的凝胶体，温度较低时，凝胶体形成缓慢，而温度较高时迅速形成凝胶体7。肌球蛋白经加热后肽链解开、蛋白质构型发生改变；而随着温度的进一步升高，发生变性的蛋自质在热作用下发生更加剧烈的热运动而相互连接，由于热渗透具有一定的方向性，使蛋自质按一定的顺序连接，从而形成具有弹性的凝胶体8。其实，关于鱼糜凝胶的形成机理，我国研究人员9也有两种观点盐溶性的肌球蛋白和肌动蛋白被溶出,，以共价键的形式结合
14、，经过加热形成网络结构，游离水被封闭在网络结构中，从而形成有弹性的鱼糜；鱼糜中游离的肌球蛋白和肌动蛋白呈分离状态，在温度43左右时，游离的肌球蛋白分子间发生凝集反应；在温度55，游离肌球蛋白分子尾部与肌动球蛋白分子中的肌球蛋白分子尾部间形成架桥；温度6070时，网络结构形成，完成鱼糜凝胶化。2提取条件对盐溶蛋白凝胶特性的影响21漂洗对凝胶特性的影响漂洗是鱼糜加工过程非常重要的步骤。它有利除去鱼肉中残余的血污、有色物质、无机及腥臭成分，同时能除去一些鱼肉中的水溶性蛋白质，提高肌原纤维蛋白的浓度和鱼肉蛋白凝胶的凝胶强度，改善产品的色泽等各项感官指标。不同的漂方法对鱼糜凝胶性能有影响齐凤生10在研究
15、漂洗工艺对海水鱼鱼糜质量的影响实验中，研究采用不同的漂洗用水量和漂洗次数对鱼糜质量的影响。结果表明漂洗用水量越多，时间越长，鱼糜的色泽、口感、弹性、硬度等都会得到改善。同时鱼肉由于吸水过多、难以脱水，漂洗温度越高，水溶性蛋白质的溶解和杂质的除区越多，但这会使肌动球蛋白的结构发生改变，降低鱼糜的凝胶性能。因此，对于利用低值鱼糜制品，漂洗温度在10以下，用碱盐水漂洗，水量取鱼肉质量的4倍，漂洗时间为每次34MIN，漂洗23次效果最好。22擂溃条件11对凝胶特性的影响擂溃工艺对鱼糜凝胶体的形成具有重要的影响，一般，擂溃工艺分为空擂（直接擂溃半解冻的冷冻鱼糜）、盐擂（空擂后加鱼糜量27的食盐继续擂溃）
16、和味擂（加调味料、添加剂擂溃5MIN）。擂溃温度是影响鱼糜制品凝胶特性的重要因素，低温擂溃鱼糜的弹性较好；相反，升高温度则下降。擂溃过程中，PH控制在68之间的中性范围，PH为6时会使鱼糜加热脱水凝固；PH为8时则会使肌动球蛋白产生静电，不利于凝胶的形成。当总擂溃的时间在2025MIN时，空擂510MIN最好，而一般将盐擂时间控制在1025MIN，充分的盐擂会使鱼糜中的盐溶蛋白尽可能的溶解，与水混合充分均匀，可以增强凝较强度。23加热方式对凝胶特性的影响鱼糜品质极受外界因素的影响如鱼的种类、新鲜度、冷冻及不同的加热处理等12。而其中，在加热方式上有研究表明采用微波加热能起到快速形成凝胶的作用，
17、而且对产品的风味、色泽等方面的影响较其他方式好13。另外，采用高压与热理结合的方法也能得到比典型热处理样品表现出更好的质构特性14。实验室由于实验条件和设备的限制，加热方式多采用水浴加热，此种方法也能取得良好的效果。一般，对鱼糜加热有3种方式，一段加热、二段加热和持续加热一段加热是直接将擂溃后的鱼糜加热到9095的方法；二段加热是将擂溃后的鱼肉先在3545放置一段时间使其凝胶化，然后加热到较高的温度；持续加热是指将擂溃后的鱼肉以一定的速度进行加热。有关实验研究显示，低温凝胶化的效果比高温凝胶化好，但低温凝胶化所需时间长，凝胶化温度控制要求严格，不太适合工业化生产，因此在实际生产过程中常采用二段
18、凝胶化法。为避开凝胶劣化温度，低温凝胶化温度常取在3050，高温凝胶化温度在75一95，使凝胶过程快速通过凝胶劣化温度区。陈舜胜等15在研究冰藏鳞鱼鲜度变化与鱼肉凝胶作用关系时，将冰藏9D的鳞鱼采肉制成鱼糜后，分别采用30低温一段加热、85高温一段加热和30低温/85高温二段加热，所得凝胶体的凝胶强度是不同的，而其中采用二段加热的最高。3添加剂对盐溶蛋白凝胶特性的影响31食盐、多聚磷酸盐等成分对凝胶特性的影响肌原纤维蛋白是肌肉中最主要的盐溶性蛋白质，通过添加食盐和磷酸盐可以提高其离子强度，增强鱼糜的凝胶性和保水性。研究表明16，直接利用焦磷酸盐，而不是利用鱼肌肉中含量较低的磷酸酶使多聚磷酸盐降
19、解成焦磷酸盐，对组织结构和保水性会产生惊人的效果。食盐的加入还能够去除鱼肉中水溶性蛋白及与游离脂肪共存的一些腥味物质。32TGASE对凝胶特性的影响TGASE转谷氨酰胺酶可使蛋白质蛋白质、蛋白质氨基酸之间发生交联反应，形成谷氨酰赖氨酸键，此交联键的形成强化了蛋白质凝胶结构。TGASE在不同原料中产生最佳效果的最适用量受各种因素的影响，归纳起来有两方面原因，其一是酶，其二是底物。从酶的角度来讲，酶有内源性和外源性之分。内源性TGASE又因鱼种不同有其不同的最适温度，不同来源的外源性TGASE也有其各自不同的最适温度。但通过外源性TGASE对鱼糜制品的影响的报道并不多17。从底物角度而言，底物的构
20、型和构成不同，会影响共价交联键的量，因此凡是能影响底物构型和构成的因素都将影响鱼糜制品的凝胶强度18。国外对TG在凝胶制品中的应用进行了较多的研究，相关报道较多ABDULATEFMA等19研究表明TG对肌原纤维蛋白热凝胶的影响因肉的品种不同差异较大；随TG浓度增加，鸡肉和牛肉盐溶蛋白形成热诱导凝胶断裂强度增加，但相同条件处理下，鸡肉中蛋白凝胶弹力低于牛肉的。日本学者添田孝彦等认为鱼肉蛋白质凝胶体凝胶作用有赖于鱼肉内TGASE的机能和作，TGASE促使鱼肉蛋白质间产生架桥重组作用的机理为TGASE催化谷氨酸GLN残基羧基酰胺基与赖氨酸LYS残基氨基发生交联作用，在分子内或分子间产生GLULYS的
21、架桥粘结作用，形成交叉结合的蛋白质结构，而且凝胶体的凝胶强度随着TGASE含量的增加而增加。学者CHANGJ等提出通过添加微生物BTGASE进行改良以提高其凝胶形成能。国内周爱梅等20研究认为在鳙鱼鱼糜中添加不同浓度的TGASE，均可使其凝胶的破断强度、凹陷深度、凝胶强度及持水性增加，而对其颜色、白度无影响。电镜分析则表明，TGASE的加入可使鳙鱼鱼糜形成致密、均匀的凝胶网络结构。赵梅荣等21研究得到TG对草鱼鱼糜制品弹性、粘聚性、回复性以及白度有明显的改善。我国学者严菁等22的实验结果表明，在自然PH值下在淡水鱼糜中添加10/G的TGASE于42处理2H，得到凝胶的破断强度达到383G，比未
22、添加TGASE凝胶破断强度是179G强度增加近1倍。学者杨华等23的研究还表明,添加TGASE在改善蛋白质的质构、提高凝胶强度、形成弹性和咀嚼性的同时，还提高了凝胶的持水性和鱼糜制品的营养价值，而且可以降低食盐的用量从3降低到了1，从而制成营养低盐鱼糜制品。33魔芋胶对凝胶特性的影响魔芋胶吸水后的膨胀系数为100倍，因而能与水分子结合形成具有较好持水性的胶凝体结构，扩大了原制品的体积，使产品的得率增加。而且，魔芋胶的大分子结构与蛋白和淀粉分子形成更为稳定的网络结构，增加了产品的持水性，使产品获得更好的弹性，即使经过速冻和烹饪，其结构仍十分稳定，特别是魔芋胶特有的韧性口感，使得产品有很好的咀嚼性
23、，口感细腻真实，深得消费者喜爱。另外，添加魔芋胶后能使产品的乳化性能提高，魔芋胶吸附了油脂，消除油腻感、降低脂肪含量，并能提供人体所需的膳食纤维的功能。选择黏度适当的魔芋胶，可以防止产品持水性不合理、引起产品速冻过程中冰晶产成过大、产品质地受到破坏，使魔芋胶的乳化、胶凝特性得到适当的发挥。周爱梅等24将大豆分离蛋白SPI和魔芋胶KG加入鳙鱼糜，结果表明，鳙鱼糜凝胶的硬度、弹性、凝胶强度及持水性明显增加，且浓度越大其作用越强，是良好的鲢鳙鱼糜品质改良剂。34海藻胶对凝胶特性的影响目前，世界上用途最广泛的三大海藻胶就是卡拉胶、海藻酸钠和琼脂。琼脂作为一种亲水性胶体，不溶于冷水，易溶于沸水，缓溶于热
24、水，在工业中具有独特的重要性，即使使用的浓度低至1仍能形成相当稳定的凝胶。一般在肉类罐头、肉制品中用0205的琼脂能形成有效粘合碎肉的凝胶。而研究表明25，在肉制品中添加卡拉胶并不能形成三维网络结构，而仅仅可能存在于连接水和在冷却阶段形成的凝胶碎片之间的蛋白质网络空隙中。4总结凝胶强度是鱼糜制品品质的一个非常关键的因素。在加工过程中，我们应当控制加工的不同阶段不同条件对鱼糜凝胶强度的影响，通过添加不同的增强凝胶强度的添加剂和采取有效的加工方法来提高其凝胶强度。同时，不同的鱼种，鱼肉蛋白的凝胶强度也有所不同，不同的捕获季节的鱼肉凝胶强度也不一样。因此，在鱼糜的加工过程中，我们应根据不同的鱼种选择
25、不同的加工方法和条件来提高其凝胶强度。参考文献1励建荣我国水产品加工业现状与发展战略J保鲜与加工,20053132张廷序中国水产品加工M北京农业出版社,19953段蕊,张俊杰浅谈海洋低值小杂鱼的综合利用J食品与发酵工业,2000,26653564孔保华,郑秋鹛鱼糜功能特性的研究现状J中国畜产与食品,1999,641891905汪之和水产品加工与利用J北京化学工业出版社,20032192376罗永康,沈慧星,潘道东等鲢鱼鱼糜蛋白质凝胶特性的研究J食品与发酵工业,2001,28123267何阳春,洪咏平鱼糜制品弹性与鱼肉凝胶特性研究进展J水产科学,2004,23641438张俊杰,段蕊鱼糜凝胶过程
26、及影响因索J中国水产,19991046489张俊杰,段蕊鱼糜的凝胶机理J淮海工学院学报,1999,83596210齐凤生漂洗工艺对鱼糜质量的影响J河北渔业,2002,391011陈申如,刘阳,李燕杰擂溃条件对鱼糜制品弹性的影响J大连轻下业学院学报,2004,919419712蔡长发鱼制品加工中蛋白质变性的研究J食品科技信息,1998,6171813CAOYAN,CHENGYUDONG,WANGXICHANGETALEFFECTSOFHEATINGMETHODSONGELFORMINGABILITYOFSILVERCARPHYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIXSURIMIJJOUR
27、NALOFSHANGHAIFISHERIESUNIVERSITY,2003,12788514郝磊勇,李汴生,阮征等高压与热结合处理对鱼糜凝胶质构特性的影响J食品与发酵工业,2005,3173515陈舜胜,王锡昌,周丽萍等冰藏的鲜度变化对其鱼糜凝胶作用的影响J上海水产大学学报,2000,91455016陈艳,丁玉庭,邹礼根等鱼糜凝胶过程的影响因素分析食品研究与开发,2003,6241317SEGUROK,KUMAZAWAY,OHTSUKAT,ETALMICROBIALTRANSGLUTAMINASEANDLYSINECROSSLINKEFFECTSONELASTICPROPERTIESOFKAM
28、ABOKEGELSJ,JFOODSCI,1995,6030531118TSUKAMASAY,MIYAKEY,ANDOMETALEFFECTOFCONTROLOFENDOGENOUSENDOPEPTIDASEANDTGONSETTINGPROPERTYOFCARPMEATJNIPPONSUISANGAKKAISHI,2000,664）71072519KOIDAY,KOBAYASHAM,HIRATAG,ETALSTUDIESONMICROCAPSULESINFLUENCEOFMOLECULARWEIGHTOFETHYLCELLULOSEINTHEMICROENCAPSULATIONOFASCORB
29、ICACIDJCHEMPHARMBULLTOKOYO,1984,32124971497820周爱梅,黄文华,刘欣等转谷氨酰胺酶对鳙鱼鱼糜凝胶特性的影响J食品与发酵工业,20038273121赵梅荣,刘良忠谷氨酰胺转胺酶对草鱼鱼糜品质的影响J食品科学,2006,271217017422严菁,熊善柏,李清亮转谷氨酰胺酶对淡水鱼糜制品凝胶强度的影响J食品科学,2002,238596223杨华,娄永江,杨震峰等谷氨酰胺转胺酶在水产品中的应用J食品工业,2003,4474824周爱梅,曾庆孝,刘欣等两种蛋白类添加剂对鳙鱼鱼糜凝胶特性的改良J华南理工大学学报,2005,4879125DIRKV,NICON
30、,PAULVDINFLUENCEOFKCARRAGEENANONTHETHERMALGELATIONOFSALTSOLUBLEMEATPROTEINSJMEATSCIENCE,2005,70161166本科毕业设计（20_届）几种添加剂对鲨鱼肉盐溶蛋白凝胶特性的影响目录0引言141仪器与试剂1511主要仪器1512主要试剂152方法321前处理322鲨鱼肉盐溶蛋白的提取323鲨鱼肉盐溶蛋白凝胶制备424添加剂的用量425凝胶保水性的测定426凝胶强度的测定427统计分析428凝胶样品的扫描电镜观察429凝胶样品的电泳测定43结果与讨论531三种添加剂对凝胶特性试验设计与分析5311响应面RSM
31、试验设计5312响应面模型的建立与统计检验5313响应面图形单因子效应分析7314响应面交互作用分析8315最佳凝胶保水性和凝胶强度模拟寻优932凝胶超显微结构分析933凝胶电泳分析104小结1041添加剂添加量对鲨鱼盐溶蛋白凝胶的保水性及凝胶强度的影响10致谢11参考文献11摘要鲨鱼肉产量巨大且富含蛋白质，但由于本身具有腥味与尿味，不能作为理想的食用鱼类。本文以鲨鱼盐溶蛋白凝胶保水性和凝胶强度为主要测定指标，根据BOXBEHNKEN中心设计原理和生产实践，设计三因素三水平实验，采用响应面分析法，研究添加剂（TGASE、琼脂、魔芋胶）添加量对鲨鱼凝胶特性的影响，建立鲨鱼盐溶蛋白凝胶保水性和凝胶
32、强度的数学模型，确定适宜的添加量。结果表明当魔芋胶、琼脂、TGASE的添加量分别为075，075，025，凝胶保水性和凝胶强度分别达7246005，1896005G，比对照组鲨鱼盐溶蛋白凝胶保水性和凝胶强度分别增加了1252和4557。关键词鲨鱼，盐溶蛋白，凝胶特性，响应面分析法ABSTRACTTHEPRODUCTIONOFTHESHARKSMEATISHUGEANDITSRICHINPROTEINS,BUTITCANTSERVEASANIDEALEDIBLEFISHFORTHEHUMANBECAUSEOFITSFISHYSMELLANDURINEFLAVOURUSINGTHEWATERHOL
33、DINGCAPACITYWHCANDGELSTRENGTHOFSALTSOLUBLEPROTEINFROMSHARKMEATSASPRIMARYINDEXES,THREEFACTORSANDTHREELEVELSOFEXPERIMENTALWEREDESIGNEDANDTHEINFLUENCEOFSEVERALADDITIVESTGASE,AGAR,KGMONTHEGELPROPERTIESOFSALTSOLUBLEPROTEINFROMSHARKMEATSWERERESEARCHEDACCORDINGTOTHEDESIGNPRINCIPLESOFBOXBEHNKENANDPRODUCTION
34、PRACTICE,ANDAMULTIPLEREGRESSIONMODELWASSETUPFORTHERESULTSOFTHEWATERHOLDINGCAPACITYANDGELPROPERTIES,INORDERTOOPTIMIZEADDITIONAMOUNTSTHERESULTSSHOWEDWHENTHEADDITIVEAMOUNTWERETGASE025,AGAR075,KGM075,THEWHCANDGELSTRENGTHOFGELWEREUPTO7246005AND1896005G,RESPECTIVELYCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUP,THEWHCANDGEL
35、STRENGTHOFSALTSOLUBLEPROTEINFROMSHARKMEATSADDED1252AND4557,RESPECTIVELYKEYWORDSSHARKSALTSOLUBLEPROTEINGELPROPERTIESANALYSISOFRESPONSESURFACE0引言我国海域蕴藏着极为丰富的渔业资源。进入80年代以来，我国渔业的发展举世瞩目，超过了世界人均占有量不到20KG的水平1。而随着捕捞强度的增大，海洋渔业资源逐年衰减，海洋捕捞的中低值鱼产量呈上升趋势，占海洋捕捞产量的5759，而这些中低值鱼用于产品加工的约占302。可以说资源未得到充分利用，经济效益低下，如果对低值鱼
36、进行综合加工利用，生产成鱼糜后，制成鱼肉香肠、鱼肉豆瓣、片火腿、鱼肉火腿肠等方便食品上市，可实现大幅度增值。鲨鱼在加工成鱼翅、鱼肝油、鱼皮等产品的同时，每年可产生约2万吨鲨鱼肉。由于鲨鱼肉本身具有腥味与尿味，其肌纤维粗硬，不能作为理想的人类食用鱼类。这不仅造成这一高营养海洋资源严重浪费，而且废弃的鲨鱼肉还对环境造成一定的污染。鱼糜制品是利用鱼肉制成的凝胶食品，营养丰富，食用方便，深受消费者欢迎。如日本每年有250300万吨的鱼类用于加工鱼糜制品，产量居各类水产加工的首位3。我国近几年的鱼糜及其制品加工发展也很快，其年产量约为40万T。目前鱼糜制品的原料主要限于海水鱼类，但由于近几年海洋捕捞强度
37、的加大，生产鱼糜制品的优质海水鱼的数量已下降。因此各国都在寻找鱼糜加工的新原料。鲨鱼肉富含蛋白质，如果能将鲨鱼肉加工成鱼糜制品，一方面可实现对鲨鱼的综合利用，另一方面又可为鱼糜制品加工业提供一种新的原料。鱼糜制品以及模拟海味食品的制作过程较简单，一般先对原料鱼进行采肉、漂洗、擂溃、配料处理，再经凝胶，成型等步骤，制出具有和天然产品的外观、口感相类似的产品来。而鱼糜制品最重要的一个质量指标就是鱼糜制品的凝胶强度，即鱼糜中肌动球蛋白质在一定浓度、温度、压力、PH值、离子强度、添加剂和酶等条件下形成三维网状交联体聚合物的能力4。鱼糜蛋白质形成凝胶过程是复杂的动力学过程，主要经过3个阶段，即凝胶化、凝
38、胶劣化和鱼糕化3个阶段。凝胶化通常指在50以前，肌球蛋白和肌动蛋白分子形成一个较松散的网状结构，由溶胶变成凝胶；升高温度到8090时凝胶结构固定化，变成有序和非透明状，凝胶强度明显加大，形成鱼糕56。鱼肉肌肉中盐溶性蛋白质肌原纤维蛋白质，是鱼肉形成凝胶体的主要成分，也是形成鱼糜弹性的重要来源。鱼肉肌肉中肌原纤维蛋白质，是盐溶性蛋白质在食盐的作用下，肌原纤维的粗丝和细丝开始溶解，其主要成分肌球蛋白和肌动蛋白吸收大量的水分并结合形成肌动球蛋白的溶胶。这种溶胶在一定温度下会失去可塑性，形成富有弹性的凝胶体，温度较低时，凝胶体形成缓慢，而温度较高时迅速形成凝胶体7。肌球蛋自可分为重酶解肌球蛋自HMM和
39、轻酶解肌球蛋自LMM两个区，经加热时，肌球蛋自发生热凝聚反应，即在凝胶开始阶段，尚一先发生球蛋自的变性，包括蛋自质构型改变与肽链的解开；随着温度的升高，发生变性的蛋自质在热作用下发生更加剧烈的热运动而相互连接，由于热渗透具有一定的方向性，使蛋自质按一定的顺序连接，从而形成具有弹性的凝胶体8。其实，关于鱼糜凝胶的形成机理，我国研究人员9有两种观点盐溶性的肌球蛋白和肌动蛋白被溶出，以共价键的形式结合，经过加热形成网络结构，游离水被封闭在网络结构中，从而形成有弹性的鱼糜；鱼糜中游离的肌球蛋白和肌动蛋白呈分离状态，在温度43左右时，游离的肌球蛋白分子间发生凝集反应；在温度55，游离肌球蛋白分子尾部与肌
40、动球蛋白分子中的肌球蛋白分子尾部间形成架桥；温度6070时，网络结构形成，完成鱼糜凝胶化。许多因素影响肌肉蛋白质的凝胶过程，主要有PH值、离子强度、温度、TGASE、亲水胶体、蛋白质浓度、非肉添加物等10。凝胶强度的高低将直接影响到鱼糜制品的商品价值，因而在不影响鱼糜制品本身品质的前提下，如何提高其凝胶强度就成为国内外研究的热点。但鲨鱼与鳕鱼、草鱼等相比，其凝胶特性较差，因而有必要研究出适合于鲨鱼凝胶特性改良的添加剂。本项目以资源丰富的鲨鱼肉为原料，以提取的盐溶蛋白所形成的凝胶保水性和质构特性为依据，根据BOXBEHNKEN中心设计原理和生产实践，设计三因素三水平实验，通过响应面法对数据进行分
41、析，得出TGASE、魔芋胶、琼脂三种添加剂对鲨鱼肉盐溶蛋白凝胶特性的影响，以改善鲨鱼肉盐溶蛋白的凝胶性能，并为开发具有高品质的鲨鱼鱼糜制品提供理论依据。1材料与试剂11材料新鲜鲨鱼，购于宁波水产大世界，体长802CM，体重205KG，带冰运回。12主要仪器台式高速冷冻离心机BIOFUGESTRATOSTHERMOSCIENTIFICSORVALL（德国）内切式匀浆机XHF1宁波新芝生物科技有限公司电热恒温水浴锅DKS24上海精宏实验设备有限公司电子分析天平BP221S德国SARTORIUS数字酸度计PHS3C上海精密科学仪器有限公司电子天平TD3102余姚市金诺天平仪器有限公司质构分析仪TAX
42、TPLUSSTABLEMICROSYSTEM公司电泳仪DYY11北京市六一仪器厂13主要试剂氯化钠分析纯浙江省兰溪市化工试剂厂氢氧化钠分析纯兰溪市第二化学试剂厂盐酸分析纯杭州化学试剂厂磷酸二氢钠分析纯汕头市金砂化工厂磷酸氢二钠分析纯汕头市金砂化工厂转谷氨酰氨酶（100U/G）食品级一鸣生物制品有限公司琼脂食品级一鸣生物制品有限公司魔芋胶食品级安徽山林生物工程有限公司131磷酸缓冲溶液的配置PH66的磷酸缓冲液称取磷酸二氢钠（NAH2PO412H2O）5551G和磷酸氢二钠（NA2HPO42H2O）0527G，溶解于蒸馏水中，定容至1L，并调节PH为66。保存于4下，备用。132SDSPAGE试
43、剂配置30丙烯酰胺W/V30G丙烯酰胺，08G双丙烯酰胺，溶于1000ML重蒸水中，4暗处保藏，一个月内可用。1MPH88TRISHCL缓冲液605GTRIS溶于重蒸水，浓盐酸调PH至88，以重蒸水定容至50ML。10SDSW/V称取10GSDS，溶于100ML重蒸水中。10APW/V称取1GAP，加入10ML重蒸水。临用前配置。1MPH68TRISHCL缓冲液605GTRIS溶于重蒸水，浓盐酸调PH至68，以重蒸水定容至50ML。电极缓冲液PH83称取60GTRIS，288G甘氨酸，加入10SDS溶液10ML，重蒸水定溶至1000ML。2倍样品缓冲液05MTRISHCLPH6820ML；甘油
44、丙三醇20ML；20SDS20ML；01W/V溴酚兰05ML；2疏基乙醇10ML；重蒸水25ML固定液50甲醇454ML，冰醋酸46ML，混匀。染色液称取考马斯亮蓝0125G，加入固定液250ML，溶解。脱色液冰醋酸75ML，甲醇50ML，加重蒸水定溶至1000ML。浓缩胶5DDH2O1400L30丙烯酰胺贮存液330L15MTRISHCLPH88250L10SDS20L10过硫酸铵20LTEMED2LTOTAL2022L分离胶8DDH2O4600L30丙烯酰胺贮存液2700L15MTRISHCLPH882500L10SDS100L10过硫酸铵100LTEMED6LTOTAL10006L2方法
45、21前处理新鲜鲨鱼即杀后，沿鱼腹剖开，去头、尾、内脏和皮，沿脊椎取鲨鱼肉，切成细小肉块，碎肉150G每份包装，于20冻藏备用。22鲨鱼肉盐溶蛋白的提取参照BERTRAM11等的方法，并略作修改。取鱼肉5G，加4倍体积的PH66磷酸缓冲液匀浆8000R/MIN，30S、连续3次；之后10000R/MIN离心10MIN（4）。去上清液，沉淀加入09MOL/L的NACL溶液并调整提取溶液的PH为7，匀浆，4下静置24H后离心（10000R/MIN、10MIN、4）。23添加剂的用量参照BOXBEHNKEN设计称取相应的添加剂，分别溶于NACL溶液中，内切式匀浆机搅拌均匀8000R/MIN，30S、连
46、续6次，再将缓冲液处理过的鱼肉加入上述NACL中，匀浆，静置24H来提取盐溶蛋白凝胶。24鲨鱼盐溶蛋白凝胶制备将提取的盐溶蛋白分别置于离心管和小烧杯，水浴加热，40放置35MIN，立即在85下恒温30MIN，形成的凝胶用自来水冷却30MIN并置于4下保存24H备用。25凝胶保水性的测定参照赵春青12等的方法，并略作改进。将制备好的盐溶蛋白凝胶置于离心管，4000RPM、4离心5MIN，称重并计算凝胶保水性（WHC）。10021WWWWWHC式中W1为离心管离心后的凝胶质量，G；W2为离心管离心前的凝胶质量，G；W为离心管质量，G。26凝胶强度测定参照林婉玲等13方法，并略作改进。将制备好的盐溶
47、蛋白凝胶用TAXTPLUS食品物性测试仪测定鲨鱼肉盐溶蛋白凝胶硬度和弹性。测定时，采用P/5探头，穿刺前探头运行速度200MM/S，穿刺时运行速度100MM/S，返回速度100MM/S，压缩距离3MM，最小感应力5G。凝胶强度G硬度G弹性14。27统计分析本试验每个处理设3个重复，数据采用SAS913进行统计分析。28凝胶样品的扫描电镜观察281电镜扫描凝胶样品的制备用单面刀将凝胶切成2MM薄片，放入25戊二醛固定液浸泡24H，用0LMOL/L的磷酸缓冲液PH72浸泡清洗15MIN，重复3次，洗去多余的固定液。再用L饿酸固定液固定1H，用磷酸缓冲液PH72浸泡清洗15MIN，重复3次。再用不同
48、浓度的乙醇溶液梯度液依次脱水30、50、70、80、90、100，各10MIN，最后分别用无水酒精叔丁醇比值为31、11、13各漂洗10S，最后将样品放入样品罐，并加入15ML纯叔丁醇，放入冰箱冷冻。处理好的样品用HCP2临界点干燥仪干燥，再用IB3离子溅射仪镀金后，进行电镜扫描观察。29凝胶样品的电泳测定291样品前处理称取1G盐溶蛋白凝胶，加入9ML5SDS溶液，用IKA匀浆机（10000RPM，5MIN）均质后在85水浴中保温1H，使蛋白质充分溶解出来。然后用离心机离心（10000RPM，10MIN）除去不容物，取一定量的上清液11加入2倍样品缓冲液，煮沸35MIN。样品冷至室温后，立即
49、使用或贮放于20。292上样将盐溶蛋白液进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE，试验所采用的浓缩胶和分离胶的浓度分别为5和8，每个试样的上样量为25L。将配置好的分离胶混匀后，迅速注入两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板35CM处，在液面上轻铺1CM的水，室温静置30MIN使之凝聚，吸取胶面上的水。混合浓缩胶，并注入玻璃板间，使胶液面与玻璃凹槽处平齐。然后插入梳子，室温静置30MIN，浓缩胶即可凝聚。凝聚后，加入电极缓冲液，取出梳子。再用微量进样器将处理好的蛋白质样品和标准品加入胶孔，样品每孔20L、标准品每孔10L，进行电泳时，浓缩胶的电压调为80V，样品进入分离胶后，将电压调制100V。电泳完毕，将分离胶取下放入染色液（考马斯亮蓝）中染色20MIN，倒出并换成脱色液漂洗，多次漂洗至无蛋白质区带处背景颜色退净，电泳结果用凝胶成像系统成像。3结果与讨论31三种添加剂对凝胶特性试验设计与分析311响应面RSM试验设计根据BOXBEHNKEN中心设计原理15，选择魔芋胶X1、琼脂X2、TGASEX3三种添加剂为影响因子，研究三种添加剂
