1、本科毕业论文系列开题报告生物技术香鱼热休克蛋白HSP70基因ORF的克隆及生物信息学分析一、选题的背景与意义热休克蛋白（HEATSHOCKPROTEIN,HSPS），又称应激蛋白（STRESSPROTEIN,SP），是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于自然界原核、真核细胞中，正常情况下与应激条件下都发挥重要的生理功能。按HSPS分子量大小可将其分为以下几个家族HSP100家族（100110KDA）、HSP90家族（分子量约8390KDA）、HSP70家族（分子量约6678KDA）、HSP60家族、小分子量SMHSP分子量约1530KDA及泛素家族（78KDA）等，其中其中HSP70家族是H
2、SPS中最保守和最重要的一族，在大多数生物中含量最多，细胞受到应激后生成也最显著。HSP70具有分子伴侣作用、抗氧化作用、参与免疫作用和抗细胞凋亡作用等多种生物学功能，并且在免疫调节中也发挥着重要作用。香鱼（PLECOGLOSSUSALTIVELIS）属鲑亚目、香鱼科、香鱼属，是我国重要的小型名贵经济鱼类，其肉质细嫩多油、营养丰富、清香无腥、色香味俱佳，素有“淡水鱼之王”之美称，曾被列入“雁荡五珍”，在我国大陆港台地区及日本东南亚更被称为“河鱼之王”，香鱼现已被国家列为二级保护动物。香鱼干品粗蛋白中含人体必需氨基酸6885，并有药膳价值。由于野生香鱼资源有限，故市场价格日益攀升，国内鲜活香鱼收
3、购价达150300元/公斤，日本市场售价为10003000日元/公斤，加工成“色如黄金、可携千里”的香鱼干，每千克可达L000元以上。日本香鱼养殖年产量为8600吨，每年市场需求大约为3万5万吨。我国发展香鱼养殖业自然条件比日本优越，浙江省沿海河流都适宜于香鱼的引种放流、放流增殖和沿河流水精养，因此，香鱼是一个具有重要经济价值的水产养殖品种。随着养殖面积逐年扩大，高密度的人工养殖导致病害频发，这些病害已成为制约香鱼养殖产业发展的瓶颈。近年来有研究将HSP70作为指示鱼类健康的生物指标。本研究以香鱼为材料，克隆HSP70基因的ORF并对其进行生物信息学分析，为进一步研究鱼类HSP70的结构、功能
4、和作用机制打下基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1香鱼总RNA的提取本实验使用BIOZOL总RNA提取试剂盒（BIOFLUX，日本）提取紫色土豆总RNA。2逆转录合成CDNA使用AMV反转录酶（TAKARA，日本）进行CDNA第一链的合成，将反应混和液在室温下放至10MIN后，42反转录1H。3PCR扩增HSP70基因ORF以香鱼反转录CDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物使用1琼脂糖凝胶电泳检测结果。4PCR扩增产物的鉴定将含有目的片段的琼脂糖凝胶切下，使用小量胶回收试剂盒（ELUTEFAST，中国）进行回收，之后使用PMD18TVECTOR（TAKARA，日本）进行连接反应。使用自
5、制的大肠杆菌DH5感受态细胞进行转化。最后，在无菌条件下，对重组子进行筛选与鉴定。5测序6香鱼HSP70基因的生物信息学分析翻译、序列比对、蛋白质一级结构分析、二级结构分析、三级结构分析、进化树分析三、研究的方法与技术路线香鱼RNA提取逆转录合成CDNAPCR扩增PCR扩增产物的鉴定测序生物信息学分析四、研究的总体安排与进度1第一阶段（10月12月）完成开题报告，查阅相关文献从而确定实验方法，制定实验步骤。2第二阶段（2月3月）HSP70基因ORF的克隆及测序。3第三阶段（3月4月）生物信息学分析。4第四阶段5月完成毕业论文并答辩。五、主要参考文献1李明云,丁夭喜,竺俊全,等我国香鱼的研究现状
6、及增养殖前景J宁波大学学报理工版,1999,12485902谢起浪,陈少波,单乐州,等我国香鱼的研究概况及发展方向J科学养鱼,20029343沈骅,张景飞,王晓蓉,等CU2、CUEDTA对鲫鱼脑组织应激蛋白HSP70诱导的影响J环境科学,2004,25394974万文菊,王纪亭,石存斌,等剑尾鱼热应激蛋白HSP70CDNA片段的克隆与序列分析J大连水产学院学报,2007,221155吴龙涛,宋林生,胥炜栉孔扇贝热休克蛋白70基因CDNA的克隆与分析J高技术通讯,2003,131175796张祖兴,李明云,陈炯,等大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的
7、制备J海洋与湖沼,2006,3743373417程培周,刘晓,张国范,等荧光定量PCR方法分析皱纹盘鲍HSP70在温度胁迫下的表达J海洋科学,2007,311077818黄桂菊,曲妮妮,喻达辉,等合浦珠母贝热休克蛋白HSP70基因的克隆与表达分析J中国水产科学,2007,1457267329谢挺热休克蛋白70的研究J中华国际医学杂志,2003,3544144410王淼舟,李苏宜热休克蛋白的生物功效及与肿瘤热疗的研究进展J实用医学杂志,2006,22896997111钟文英,普雄明热休克蛋白的分子生物学研究进展J医学综述,2005,11214815012董云伟,董双林,纪婷婷水生动物热休克蛋白研
8、究进展J中国海洋大学学报,2008,381394413曲凌云,孙修勤,相建海,等热休克蛋白研究进展J海洋科学进展,2004,22338739114邹伟,史榕荇,于学平针刺对急性高血压脑出血大鼠HSP70MRNA表达的调整作用J中医药学报,2003,311464915郑磊,颜晓慧热应激时热休克蛋白70及其细胞保护作用J国外医学卫生学分册,1999,42620921216焦传珍,王在照,李富花,等编码中国明对虾FENNEROPENAEUSCHINENSIS一种组成型热休克蛋白70HSC70CDNA克隆、测序及其表达分析J科学通报,2004,49212178218617WEBBD,GAQNONMMT
9、HEVALUEOFSTRESSPROTEIN70ASANENVIRONMENTALBIOMARKEROFFISHHEALTHUNDERFIELDCONDITIONSJENVIRONTOXICOL,2009,24328729518WEBERLARELATIONSHIPOFHEATSHOCKPROTEINSANDINDUCEDTHERMALRESISTANCEJCELLPROLIF,1992,2510111319MOLINAA,BIEMARF,MULLERF,ETALCLONINGANDEXPRESSIONANALYSISOFANINDUCIBLEHSP70GENEFROMTILAPIAFISHJ
10、FEBSLETT,2000,474151020BOUTEI,TANGUYA,MORAGADORGANIZATIONANDNUCLEOTIDESEQUENCEOFTHEEUROPEFLATOYSTEROSTREAEDULISHEATSHOCKCOGNATE70HSC70ANDHEATSHOCKPROTEIN70HSP70GENESJAQUATTOXICOL,2003,6522122521SHYUWC,KAOMC,CHOUWY,ETALHEATSHOCKMODULATESPRIONPROTEINEXPRESSIONINHUMANNT2CELLSJMOLECULARNEUROSCIENCE,2002
11、,277177422PIANOA,ASIRC,CASELLIF,ETA1HSP70EXPRESSIONINTHERMALLYSTRESSEDOSTREAEDULIS,ACOMMERCIALLYIMPORTANTSYSTERINEUROPEJCELLSTESSCHAP,2002,7325025723SALEHA,SRINIVASULASM,BALKIRL,ETALNEGATIVEREGULATIONOFTHEAPAF21APOPTOSOMEBYHSP70NATCELLBIOLJ2000,2847648324TOMANEKL,SOMEROGNINTERSPECIFICANDACCLIMATIONI
12、NDUCEDVARIATIONINLEVELSOFHEATSHOCKPROTEINS70HSP70AND90HSP90ANDHEATSHOCKTRANSCRIPTIONFACTOR21HSF1INCONGENERICMARINESNAILSGENUSTEGULAIMPLICATIONSFORREGULATIONOFHSPGENEEXPRESSIONJJEXPBIOL,2002,205677685毕业论文文献综述生物技术鱼类HSP70的研究进展摘要HSP70是一类最保守和最重要的热休克蛋白家族，作为分子伴侣在协助新生多肽链折叠，蛋白质复合体的装配，以及调节、修复和降解变性的蛋白质方面起着重要作用
13、。而鱼类因其独特的生理特征已成为研究热休克蛋白的理想模式生物。本文总结了鱼类HSP70方面的研究成果,并着重介绍鱼类HSP70的诱导因子,及其在调节鱼类抗逆能力作用和作为生物标记物和在水环境监测方面的潜力。关键词HSP70；鱼类；抗逆能力；应激热休克蛋白HEATSHOCKPROTEIN,HSP,又称应激蛋白STRESSPROTEIN,SP,是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于自然界原核、真核细胞中，参与细胞的损伤与修复。1974年,TISSIERES等证实高温能够激发染色体内基因转录合成一种特异性的蛋白使果蝇染色体蓬松，从此开启了对热休克蛋白的研究。后来，BOND等1发现，不仅在热刺激,在
14、其他的应激条件下，如冷、缺氧、重金属污染、营养缺乏等,生物体内也可生成此种蛋白，因此该蛋白又称其为应激蛋白。热休克蛋白有多个家族，按它们分子量大小可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPS相对分子质量为212312及泛素2,其中HSP70基因没有内含子,在大多数生物中含量最多,在应激反应中最为敏感,是热休克蛋白家族中最受关注、研究最深入的一种。HSP70具有重要的生物学功能,如具有分子伴侣的作用,细胞内HSP70主要参与细胞内蛋白质的折叠、装配、降解和修复过程等,促进细胞增殖,调控细胞凋亡，并且在免疫调节中也发挥着重要作用。鱼类为水生变温动物，温度的日变化和季节变化
15、对其生命过程有重要影响，水环境中的其他因素如重金属、缺氧、细菌感染等也会影响着它们的分布和生理状态，而这些因素与它们体内热休克蛋白的数量和表达程度息息相关。因此，许多鱼类已成为研究热休克蛋白的理想材料。目前关于HSP70的性质、功能和测定方法方面的研究较多3。但关于鱼类HSP70方面的文献研究较少,且着重于介绍其调控机制方面4。因此本文总结了鱼类HSP70方面的研究成果,并着重介绍鱼类HSP70的诱导因子,及其在调节鱼类抗逆能力中的作用。本研究可提高对鱼类HSP70表达及其作用的认识,而且可为水产养殖过程中环境因子的调控提供一定的理论依据。1鱼类HSP70基因特点目前有关鱼类热休克蛋白的研究报
16、告多集中在蛋白质水平上，但多种鱼类编码热应激蛋白的基因序列也己经被克隆和检测，包括虹鳟5、草鱼6、罗非鱼7、大黄鱼8等，有些实验是用鱼体某种组织为材料进行研究，而大部分实验是以所培养的某种鱼类的组织细胞为材料。大量的鱼类HSP70基因的克隆表明鱼类HSP70氨基酸同源性均较高,表明其在进化上高度保守,且承担着重要的生理功能。鱼类HSP70蛋白的一级结构可分为3个功能域靠近N端的ATPASE活性区，分子量大小为45KD，为在结构上高度保守的氨基酸序列,与不同生物HSP70所共有的生化特性有关紧接着为分子量18KD大小相对保守的氨基酸序列,是多肽的重要结合部位靠近C端有分子量约为10KD结构多变的
17、氨基酸序列,其结构尚不明确,可能与某种特定的蛋白底物相互作用有关。在许多陆生生物中,热休克蛋白可受一些因子的调控，从而激活或抑制热激蛋白的表达，这些因子被称为热激转录因子HSFS。鱼类中还没有明确的有关热激转录因子的报道,只有AIRAKSINEN等1998年在虹鳟的原代培养细胞中报道了热激转录因子I样蛋白具有DNA结合活性,并与HSP70的诱导表达有关9。2鱼类HSP70表达调控HSP70的诱导是由遗传控制的,还是环境控制的,目前还存在争论。部分研究认为基因调节因子和细胞内蛋白热稳定性是调控HSP70表达的主导因素10而有的研究认为HSP70诱导是由环境条件决定的,而不是由遗传因素控制的11。
18、下面例举几种能诱导HSP70表达的环境因子。21温度HSP70的表达具有可塑性，与环境因子变化和热历史有关。陆续报道证明，几乎所有生物细胞在温度升高时均可合成热休克蛋白12。苏岭等研究表明鲫鱼在受到热休克后，肝脏中HSP70MRNA的表达量与时间出现一种线性关系。热激1H后MRNA的表达量开始升高，并且随着时间的增加呈现上升趋势，在4H的时候表达量达到最高值，为起初的29倍。之后MRNA的表达量开始降低，在48H后基本降至初始值。这一趋势与已有报道的其他生物一致13。在自然环境条件下,热休克蛋白的表达有季节性的变化。在夏季,生物体内热休克蛋白的量往往要高于冬季14。和夏季驯化的虾虎鱼相比,在冬
19、季驯化的鱼脑组织中有更高的HSP70。从18上升到28时,冬季驯化的鱼HSP70开始表达而对于夏季驯化的鱼来说从18上升到28时,HSP70并不表达,而上升到32时,HSP70才开始表达。HSP70诱导阈值温度与驯化温度有关,并具有物种特异性。大多数生物如虾虎鱼HSP70诱导阈值温度随着驯化温度的提高而升高而有的生物如克海七鳃鳗其HSP70诱导阈值温度随驯化温度的提高却呈现降低的趋势15。这种现象可能与生物遗传特性有关。因此,HSP70的诱导应该是受到遗传和环境双重控制的。22环境污染有机污染物可以提高鱼类肝脏HSP70的表达。如随着水体富营养化加剧，淡水藻类会产生多种藻毒素。何珊等研究鲢鱼、
20、草鱼、尼罗罗非鱼对藻毒素耐受性与肝脏HSP70表达关系。研究表明鲢鱼、草鱼、尼罗罗非鱼这3种鱼类处于水体的不同层次,食性不一,因此,它们接触藻毒素的几率亦不同,从而也进化出不同的耐受能力。它们认为这三种鱼对富营养化水体、藻毒素的耐受能力,与HSP70基因的表达水平成正相关16。工业化学试剂也会影响HSP70的表达，。VIJAYAN等发现工业污水可以提高虹鳟鱼和大鳞大马哈鱼体内HSP70的表达17。杀虫剂复禄芬的诱导可使尼罗罗非鱼体内HSP70的表达提高18。环境中重金属可以诱导水生生物产生HSP70。有报道鱼类如黑头软口鲦、虹鳟鱼经铜、锌和汞的诱导，促使HSP70的表达19。因此,HSP70可
21、以作为生物受到环境污染胁迫的指示剂。23其他因子捕食和寄生也会诱导HSP70产生。KAGAWA等报道在捕食者蓝鳍太阳鱼存在的情况下,金鱼脑内HSP70会显著升高20。当体内有寄生虫存在时,虹鳟鱼体内HSP70表达也会提高21。3鱼类HSP70的应用价值31提高机体热耐受能力在各种细胞器中,核仁和细胞膜对高温特别敏感。HSP70能够广泛存在于细胞骨架和核骨架内,并且与核仁和细胞膜结合,从而提高细胞对热的耐受力。研究发现,提前暴露在亚致死温度一定时间,可使机体随后获得对其致死温度的耐受能力,这种现象称为诱导热耐受性。当细胞受到热刺激时，增加合成的HSP70，可与变性蛋白或异常蛋白相结合，减少不溶性
22、聚集物的产生并解离无法修复的蛋白质，另外，通过修复错误折叠蛋白，可加快正常蛋白的恢复，使热休克时因蛋白质变性而造成的蛋白量的减少得到补充，从而保持细胞的自稳定，保护细胞免受变性蛋白的损害。有研究表明22将5摄氏度下的虹鳟鱼红细胞体外25摄氏度热激能导致热休克蛋白70MRNA60倍水平的提升，证实HSP70在保护细胞免受热应激损害有潜在作用。32感染免疫与抗感染免疫热休克蛋白具有高度保守性，病原体热休克蛋白70部分序列同源，因此有可能导致宿主的免疫防御机制不能识别，使病原体增值。因此病原体热休克蛋白70可保护病原体适应宿主体内的不利环境。另一方面，宿主和病原体并不是完全同源的，它们之间也存在差异
23、，这种差异可能会引起宿主免疫系统针对此病原体HSP70的免疫应答。因为宿主的体内环境如温度、PH等与外部环境不同，许多病原体如细菌、寄生虫等感染宿主后，为适应新的生长环境常伴随HSP70的表达，最终引起宿主的抗感染免疫。FORSYTH等人23首先发现银大马哈鱼在感染了沙氏肾杆菌后，HSP70蛋白在肝脏、头和肾中的表达量增加了。不久，ACKERMAN等21发现溶藻弧菌感染虹鳟后，HSP70蛋白在虹鳟肝脏、头和肾中的表达也增加了。万文菊24研究发现在抗病原菌感染及疫苗产生的免疫应答过程可能有HSP70成员的参与，但仍需要进一步研究来阐明HSP70与免疫系统之间的关系。33生物标记物与水体环境监测鉴
24、于HSP70的高度保守性，将其作为生态生物标记物，可以避免传统的环境监测指标因物种差异和环境条件差异而带来的不一致因素，可以把实验室低等生物实验结果应用于高等动物甚至人类。同时HSP70的高度保守性，其在生物进化亲缘比较上可作为一种参照来进行衡量。HSP70蛋白也可以作为水体环境的监测指标。VIJAYAN等25提出，萘黄酮、氯化镉、牛皮纸浆漂白液BKME浓度在远低于LC50值时，便可以诱导鲑鱼肝脏组织HSP70合成。沈骅等26提出了HSP70蛋白有潜力成为重金属污染条件下生物标记物。对HSP70的初步研究己经显示了HSP70作为生物标记物和在水环境监测方面的潜力，但是HSP70的表达水平并不是
25、总与有害因素的作用强度完全线性相关，其机制较为复杂。利用HSP70作为水环境污染的检测有它的局限性，有人就提出不同的污染物会诱发不同热休克蛋白家族的表达，仅仅靠一种热休克蛋白不足以作为环境污染的指示物。所以，仍需要进一步解决HSP70检测水体质量系统的不足，以及不断完善其它热休克蛋白的这一检测系统。4展望目前鱼类HSP70的分子生物学研究仍然处在描述阶段，虽然多种鱼类编码热应激蛋白的基因序列也己经被克隆和检测，但对HSP70在应激反应中的合成机制和其蛋白表达机制仍不是很清楚。由于诱导因子的复杂性，研究HSP70与诱导因子之间关系的工作也一直进展缓慢。关于是否把HSP70作为生物处于应激状态的指
26、标还存在争论。在今后的研究中,以下几个方面值得重视1鱼类热休克蛋白基因70序列与结构特征及其进化关系上的探讨2在不同生态环境中,不同鱼类物种HSP70时间和空间上表达方式的特点,及其与环境因子相互关系3鱼类HSP,HSF,HSE,HSBP的各自功能及相互之间的调控机制。通过这些研究,不仅可以了解鱼类在生理水平上对环境的适应机制,同时可为鱼类养殖技术的发展提供理论依据。参考文献1BONDU,SCHLESINGERMJHEATSHOCKPROTEINSANDDEVELOPMENTJADVGENET,1987,2411192MULTHOGHEATSHOCKPROTEIN70HSP70MEMBRANE
27、LOCATION,EXPORTANDIMMUNOLOGICALRELEVANCEJMETHODS,2007,432292373HOCHACHKAPW,SOMEROGNBIOCHEMICALADAPTATIONMECHANISMANDPROCESSINPHYSIOLOGICALEVOLUTIONMUSOXFORDUNIVERSITYPRESS,20024BASUN,TODGHAMAE,ACKERMANPA,ETALHEATSHOCKPROTEINGENESANDTHEIRFUNCTIONALSIGNIFICANCEINFISHJGENE,2002,2951731835KOTHARYRK,BURG
28、ESSEA,CANDIDOEPMTHEHEATSHOCKPHENOMENONINCULTUREDCELLSOFRAINBOWTROUTHSP70MRNASYNTHESISANDTURNOVERJBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTAGENESTRUCTUREANDEXPRESSION,1984,78321371436林亚秋,郑玉才,吉红草鱼HSP70基因CDNA部分序列克隆及其组织表达差异J淡水渔业,2009,39467717李莉萍,陈明,唐章生,等5个品系罗非鱼热休克蛋白HSP70基因序列比对分析J西南农业学报,2009,2238288338张祖兴,李明云,陈炯,等大黄鱼PSE
29、UDOSCIAENACROCEA热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备J海洋与湖沼,2006,3743373419AIRAKSINENS,RABERGHCMI,SISTONENLETALEFFECTSOFHEATSHOCKANDHYPOXIAONPROTEINSYNTHESISINRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSCELLJEXPBIO,1998,2012543255110MORIMOTORIREGULATIONOFTHEHEATSHOCKTRANSCRIPTIONALRESPONSECROSSTALKBETWEENAFAMILYOFHEATSHOCKFACTOR
30、S,MOLECULARCHAPERONESANDNEGATIVEREGULATORSJGENESDEV,1998,123788379611DIETZTJ,SOMEROGTHETHRESHOLDINDUCTIONTEMPERATUREOFTHE90KDAHEATSHOCKPRTOTEINISSUBJECTEDTOACCLIMATIZATIONINEURYTHERMALGOBYFISHESGENUSGILLICHITHYSJPROCNATLACADSCIUSA,1992,893389339312黄惠芳,马飞热激蛋白的分子进化研究J厦门大学学报自然科学版,2004,43B0816617013苏岭,李
31、绍戊,等半定量RTPCR方法检测热应激对鲫鱼肝脏中HSP70MRNA含量的影响J华北农学报,2010,2510010414HOFMANNGE,SOMEROGNEVIDENCEFORPROTEINDAMAGEATENVIRONMENTALTEMPERATURESSEASONALCHANGESINLEVELSOFUBIQUITINCONJUGATESANDHSP70INTHEINTERTIDALMUSSELMYTILUSTROSSULUSJJEXPBIOL,1995,1981509151815WOODLA,BROWNIR,YOUSONJHTISSUEANDDEVELOPMENTALVARIATIO
32、NSINTHEHEATSHOCKRESPONSEOFSEALAMPREYSPETROMYZONMARINUSEFFECTSOFANINCREASEINACCLIMATIONTEMPERATUREJCOMPPHYSIOLBIOCHEM,1999,123A354216何珊,梁旭方,李观贵,等鲢鱼草鱼和尼罗罗非鱼热休克蛋白70基因CDNA全序列的克隆与分析J环境科学学报,2009,29112324233017VIJAYANMM,PEREIRAC,KRUZYNSKIG,ETALSUBLETHALCONCENTRATIONSOFCONTAMINANTINDUCETHEEXPRESSIONOFHEPATI
33、CHEATSHOCKPROTEIN70INTWOSALMONIDSJAQUATTOXICOL,1998,4010110818HASSANEINHM,BANHAWYMA,SOLIMANFM,ETALINDUCTIONOFHSP70BYTHEHERBICIDEOXYFLUORFENGOALINTHEEGYPTIANNILEFISHOREOCHROMISNILOTICUSJARCHENVIRONCONTAMTOXICOL,1999,37788419DUFFYLK,SCOFIELDE,RODGERST,ETALCOMPARATIVEBASELINELEVELSOFMERCURY,HSP70ANDHSP
34、60INSUBSISTENCEFISHFROMTHEYUKONKUSKOKWIMDELTAREGIONOFALASKAJCOMPBIOCHEMPHYSIOL,1999,124C18118620KAGAWAN,RYOK,MUGIYAYENHANCEDEXPRESSIONOFSTRESSPROTEIN70INTHEBRAINOFGOLDFISH,CARASSIUSAURATUS,REAREDWITHBLUEGILL,LEPOMISMACROCHIRUSJFISHPHYSIOLBIOCHEM,1999,2110311021ACKERMANPA,IWAMAGKPHYSIOLOGICALANDCELLU
35、LARSTRESSRESPONSESOFJUVENILETROUTTOVIBRIOSISJAQUATANIMHEALTH,2001,1317318022CURRIES,MOYESCDSOLANUMTUBEROSUMBIOINFORMATICALANALYSIS1引言香鱼（PLECOGLOSSUSALTIVELIS）属于香鱼科PLECOGLOSSIDAE），有些学者并入鲑科SALMONIDAE，为味香美的河鱼。其常见于日本及台湾，上溯于清澈的河水中产卵。体淡黄或橄榄色，长约30公分1尺，外貌颇似小鱒1。因为香鱼其肉醇厚，肉质细嫩味美并有殊香，犹如从香水中捞出来一般，并无其他鱼腥味，所以评价很高，
36、有“淡水鱼之王”的美誉2。近二十年来，由于受外界环境的影响，野生资源量急剧减少，作为具有高经济价值的新兴养殖品种，日益受到人们的关注。热休克蛋白70（HEATSHOCKPROTEIN70，HSP70）是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于原核和真核细胞中，正常情况与应激条件下都发挥重要的生理功能36，但胁迫因子（包括热激、物理、化学和生物等）能破坏蛋白的高级结构、扰乱正常细胞状态和损害机体78，都能诱导HSP70表达量显著增加910。HSP70作为一种分子伴侣，参与维持蛋白质空间构象，保护细胞生命活动，折叠和跨膜运输新生的蛋白1113，修复错误折叠的蛋白，帮助降解变性的蛋白，稳定细胞骨架和核
37、骨架的等基本功能一旦细胞面临胁迫状态时14，生物体就会大量表达HSP70以阻止细胞内变性蛋白质的累积，修复变性蛋白质15，运送未成熟的蛋白质至目标细胞器以完成最后的包装、代谢或修复，增加细胞的抗逆能力以保护机体度过不良状态由于热休克蛋白重要的生物学功能，现已成为生命科学热点研究领域之一1520。近年来有研究将HSP70作为指示鱼类健康的生物指标。不同鱼类中HSP70基因的序列有所不同，到目前为止，香鱼中完整的HSP70基因还没有被报道。本文以香鱼肝脏为材料，克隆其HSP70基因核心片断序列并对其进行分子生物学分析,为进一步研究鱼类HSP70的结构、功能和作用机制打下基础。2材料与方法21实验材
38、料211香鱼香鱼，购自宁波市宁海凫溪渔场，其肝脏为本实验材料。212菌株和质粒大肠杆菌DH5感受态细胞，PMD18T载体213试剂和酶BIOZOL试剂盒，PMD18TVECTOR试剂盒，AMV反转录酶，购于TAKARA公司；DNA快速纯化/回收试剂盒，购于北京鼎国生物公司；DNA连接试剂盒，购于PROMEGA公司；RNA酶抑制剂，异丙醇，QQ水等。214仪器与设备离心机、高压灭菌锅、电泳仪、恒温水浴锅、PCR仪、紫外透射仪等。22实验方法221香鱼肝脏总RNA的提取本实验使用BIOZOL总RNA提取试剂盒（BIOFLUX，日本）提取香鱼肝脏总RNA。在液氮条件下将100MG香鱼肝脏研磨成粉末，
39、然后与1MLBIOZOL混合。匀浆时组织样品体积一般不要超过BIOZOL体积的10。分离将匀浆样品在室温下孵育15MIN，使样品充分裂解至匀浆液，较透明且无颗粒。按照51（BIOZOL氯仿）的比例（V/V）加入氯仿。盖紧管盖，振荡混匀并将其在冰上孵育15MIN，于4，12,000G离心15MIN。离心后混合物分层上清层，中间层，下层；RNA存在于上清层中。RNA的沉淀将上清层转移到一干净的离心管中，加入等体积冰浴的异丙醇，颠倒振荡混匀，将混合的样品在20条件下孵育20MIN以上，4，12,000G离心10MIN。RNA沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。RNA的洗涤弃去上清，用冰浴的75的乙
40、醇洗涤RNA沉淀一次，按每1ML的BIOZOL至少加1ML的75乙醇的比例加入75乙醇。颠倒洗涤离心管管壁，并旋涡振荡样品，尽可能让沉淀悬浮，4，12,000G离心5MIN，再次去除上清，晾干沉淀。RNA的溶解在操作的最后，适度干燥RNA沉淀（避免过分干燥,那样会降低它的可溶性）。用适量的无RNA酶水或TE溶液来溶解RNA（一般可用50100L无RNA酶的水或TE溶液溶解RNA）。抽提好的RNA，保存于70。222逆转录合成CDNA使用AMV反转录酶（TAKARA，日本）进行CDNA第一链的合成，将反应混和液在室温下放至10MIN后，42反转录1H。反转录反应体系如下模板RNA溶液1L5REV
41、ERSETRANSCRIPTASEBUFFER4LDNTPS2LRNASEINHIBITOR05LOLIGOD（T）PRIMER1LAMVREVERSETRANSCRIPTASE（5U/L）05LDEPCH2O11LTOTAL20L223PCR扩增HSP70基因核心序列根据GENBANK上已登陆虹鳟、大西洋鲑等鲑科鱼类HSP70基因的保守片断，设计并合成一对引物正义引物（FHSP70）5ATGTCTAA/CGGGACCAGCAGTGG3反义引物RHSP705TTAGTCAACCT/ACCTCAATGGT3以香鱼反转录CDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物使用1琼脂糖凝胶电泳检测结果。PCR扩增
42、反应体系如下10PCRBUFFER25LDNTPS（25MMEACH）2LFDFR1LRDFR1LCDNA1LTAKARAEXTAQ（5U/L）05LDDH2O17LTOTAL25L反应程序设置如下循环次数温度时间1943MIN34941MIN551MIN721MIN1728MIN14保存224PCR扩增产物的鉴定2241目的片段回收将含有目的片段的琼脂糖凝胶切下，使用小量胶回收试剂盒（ELUTEFAST，中国）进行回收。切下目的胶块，放入15MLEPPENDORF管中。加入E1液450L，5560水浴510MIN至胶块完全溶解。加入E2液10L，混匀立即吸入内套管中，8000RPM离心2MI
43、N。弃去外套管中液体，在内套管中加入500L洗液（WASHBUFFER），8000RPM离心1MIN，重复一次。弃去外套管中的液体，直接套回，8000RPM离心1MIN。取出内套管放入新的EPPENDORF管中，在内套管膜中央加入2050L洗脱液（ELUTEBUFFER）。60水浴5MIN。12000RPM离心1MIN，得到回收产物，20贮存备用。2242连接使用PMD18TVECTOR（TAKARA，日本）进行连接反应，16连接过夜。反应体系如下SOLUTION5L回收产物5LPMD18TVECTOR05LTOTAL105L2243大肠杆菌DH5感受态细胞的制备取70甘油保存的DH5菌种20
44、L，接种于20MLLB液体培养基中，37下220250RPM振荡过夜。取上述菌液20L，接种于20MLLB液体培养基中，37下220250RPM振荡254H，至OD8000506。取上述菌液1ML于无菌EPPENDORF管中，盖上盖，4下5000RPM离心5MIN。去上清，吸干管底残留的LB培养基，用4冰浴预冷的CACL2（01M）溶液400L重悬菌体，用移液枪混匀。置于4培养箱，冰浴30MIN。4下4000RPM离心10MIN，彻底去上清，用200LCACL2（01M，预冷）重悬菌体，用移液枪轻轻混匀。置于冰浴27H可用于转化。2244转化使用自制的大肠杆菌DH5感受态细胞进行转化。无菌条件
45、下，取10L连接产物，加入200L大肠杆菌DH5感受态细胞中，用枪头轻轻混匀（冰上操作）。4冰浴30MIN。42精确热激90S。立即转入冰水中冰浴12MIN后，恢复到室温。加入800L无抗生素LB培养基，混匀。将EPPENDORF管置于三角瓶中，37恒温摇床180RPM振荡培养2H。室温下5000RPM离心4MIN，吸去上清900L，余下100L液体重悬菌体。将菌液加入37预热的LB固体培养基（100G/MLCAB），涂布至干。将培养基倒置于37恒温培养箱中，培养1224H。2245重组子的筛选与鉴定无菌条件下，随机挑取4个单菌落分别接种于4个装有1MLLB液体培养基（100G/MLCAB）的
46、EPPENDORF管中。置于37恒温摇床，250RPM振荡培养4H，至对数生长期。进行菌液PCR鉴定，扩增产物使用1琼脂糖凝胶电泳检测。建立PCR反应体系如下10PCRBUFFER25LDNTPS（25MMEACH）2LFDFR1LRDFR1L菌液1LTAKARAEXTAQ（5U/L）05LDDH2O17LTOTAL25L反应程序如下循环次数温度时间1943MIN34941MIN551MIN721MIN1728MIN14保存225测序实验中的测序工作委托上海英俊生物工程有限公司（中国）完成。226香鱼HSP70基因的生物信息学分析本文中的序列比对均使用VECTORNTISUITE70软件和BL
47、AST工具（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）进行分析，ORF的查找和核苷酸的翻译在HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV网站的ORFFINDER上完成。对香鱼HSP70基因编码的氨基酸序列与其它鱼类HSP70基因编码的氨基酸序列进行多重比对（表1）。蛋白质基本性质的分析以及蛋白质三维模型的同源建模均使用HTTP/WWWEXPASYORG网站提供的相关生物信息学分析软件和WLVIEWLITE40软件进行。使用CLUSTALX软件对序列进行多重比对以后，再使用MEGA4软件中的邻位相连法完成系统发生树的构建。系统进化树以香鱼以及其他鱼类的HSP70氨基酸序列（表2）作为分析对象。表
48、1分析PAHSP70蛋白用到的其他鱼类HSP70蛋白信息TAB1ANALYSISPAHSP70PROTEINSWITHHSP70PROTEINSINFORMATIONFROMOTHERFISHSPECIES序列名称物种登陆号SSHSP大西洋鲑（SALMOSALAR）BT0587741LSHSP红笛鲷（LUTJANUSSANGUINEUS）HM1592721OMHSP虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）AB1964601POHSP牙鲆（PARALICHTHYSOLIVACEUS）AB0068141ASHSP黑棘鲷（ACANTHOPAGRUSSCHLEGELII）AY7629691PMHS
49、P大菱鲆PSETTAMAXIMAEF1910271RSHSP平鲷RHABDOSARGUSSARBAAY4367861MAHSP团头鲂（MEGALOBRAMAAMBLYCEPHALA）EU6234712CIHSP草鱼CTENOPHARYNGODONIDELLAGU4751461HMHSP鲢HYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIXHM0682961表2PAHSP70系统进化树分析所用氨基酸序列TAB2AMINOACIDSEQUENCESUSEDINPHYLOGENETICTREEOFPAHSP70序列名称物种登陆号所属科SSHSP大西洋鲑（SALMOSALAR）BT0587741鲑科LSHSP红笛鲷（LUTJANUSSANGUINEUS）HM1592721笛鲷科OMHSP虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）AB1964601鲑科POHSP牙鲆（PARALICHTHYSOLIVACEUS）AB0068141鲆科ASHSP黑棘鲷（ACANTHOPAGRUSSCHLEGELII）AY7629691
