1、本科毕业论文系列开题报告水产养殖大弹涂鱼、弹涂鱼的线粒体COI基因差异及系统发育一、选题的背景与意义细胞色素C氧化酶（CYTOCHROMECOXIDASE）在细胞呼吸中处于细胞色素系统的末端。此酶是把呼吸底物的电子经过细胞色素系统直接传递给分子态氧。而细胞色素C氧化酶第一亚基（CO），是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3大亚基之一。由于CO广泛存在于动物的线粒体中，与生物进化有很大的关系，因此其研究影响着生物分类学的发展。近年来，人们开始认识到了线粒体中的细胞色素差异可用于推测生物之间的进化以及亲缘关系，对CO进行的分析研究渐渐增多。国外主要有ACHARDJORISM2006等对淡水和海洋双壳
2、贝类细胞色素C氧化酶亚基在分子水平上的演变与线粒体和核基因组进化的关系。国内如王中华2010等对细胞色素C向过氧化物酶结构功能的转化研究。无论国内国外岁鱼类细胞色素CO作为DNA条形码用于鱼类鉴定分类的研究还较少，国内有施大卫2009等对青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基COX基因的克隆鉴定及表达分析。张凤英2005等对采自东海的银鲳、翎鲳和中国鲳3种鲳属鱼类的线粒体COI基因序列片段进行了研究。彭居俐2009等研究了基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用。因此本课题将通过对虾虎鱼科的14种鱼类CO基因序列的分析研究，总结这14种鱼CO的基因序列的差异，证明这两种鱼能用
3、其CO基因片段的差异与其系统发育有关，进而为以后基于COI基因的DNABARCODE在鱼类物种鉴定的研究奠定基础，为鱼类分类学及生态学的发展提供参考。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）研究的基本内容1大弹涂鱼、弹涂鱼CO基因的克隆、序列分析。2分析大弹涂鱼、弹涂鱼及另外12种虾虎鱼科鱼类CO基因序列的差异。（二）拟解决的问题1大弹涂鱼、弹涂鱼CO基因的引物设计。2掌握PCR及其他分子克隆的方法。3对大弹涂鱼、弹涂鱼及另外12种虾虎鱼科鱼类CO基因序列的差异进行总结，构建出它们的进化树，为鱼类的分类鉴定提供依据。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1样本采集从市场上选购健康大弹涂鱼、弹
4、涂鱼的成鱼作为样本，进行养殖备用。2DNA的提取解剖样本，提取样本的肌肉，再从样本肌肉中提取DNA，用电泳和紫外线分光光度计测量DNA的浓度和质量，进行低温保存。3引物设计用PRIMER5OROLIGO6软件，根据相近鱼类CO及上下游序列保守序列设计引物。4COI克隆测序PCR扩增两种鱼类的CO基因，然后PCR产物进行克隆，最后送往测序公司测序。5基因序列下载从GENBANK上下载另外12种虾虎鱼科鱼类的CO基因序列。6COI基因序列分析使用程序软件分析CO基因序列的结构域，构建出进化树，评估虾虎鱼科的进化关系。（二）技术路线大弹涂鱼、弹涂鱼样本采集鱼体的测量及解剖提取样本DNA引物的设计PC
5、R扩增GENBANK下载另外12种虾虎鱼科的CO序列分析并构建出进化树PCR产物克隆测序四、研究的总体安排与进度2010220103毕业论文选题，进行文献查阅和资料收集。2010320104制定具体研究计划和试验方案，完成开题答辩与综述。20104201012样本鱼类的购买、暂养、解剖，基因提取、引物设计、基因克隆及测序。20101220112数据和材料整理、分析、总结完成，2篇外文翻译。2011220114论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1柏干荣,陆松敏线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基闪的进展J国外医学,分子生物学册,2003,2563543572陈峥宏,郎书源,吴晓娟,等用COX
6、1基因片段的PCR鉴定亚洲带绦虫和牛带绦虫J贵阳医学院学报,2009,3432392413陈虹,陈汉彬中国不同地理株白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基1基因序列比较中国流行病学杂志,2003,2461911934陈艺燕,钱开诚,任岗,等大黄鱼与小黄鱼细胞色素B记忆全序列的比较分析J生态科学,2005,2421431455戴荣四,李芬,刘伟,等湘西地区山羊多头蚴感染调查与种类鉴定J中国人兽共患病学报,2009,2543913946董云伟,牛翠娟,鲍蕾,等单只轮虫DNA提取及其细胞色素C氧化酶亚基部分序列测定动物学研究,2002181837江世贵,刘红艳,苏天凤,等4种鲷科鱼类的线粒体细胞色素B基因序列
7、及分子系统学分析中国水产科学,2003,1031841888李连之,黄仲贤细胞色素C氧化酶研究新进展J无机化学学报,2001,1767617749李铁华,郭湘荣,胡铃,等我国五省美洲钩虫COI基因序列多态性分析中国寄生虫病杂志,2003,21421021310娄绘芬,黄艳青,吴信忠大黄鱼细胞色素P450CY4F7基因的克隆及表达分析J海洋学报,2008,304131138数据整理，论文撰写分析进化树，总结鱼类CO与进化关系11彭居俐,王绪祯基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用J水生生物学报,2009,33227127612施大卫,王利,娄绘芳,等青石斑鱼细胞色素
8、C氧化酶亚基COX基因的克隆鉴定及表达分析J中国水产科学,20090446847513王敖金,徐建兴水对细胞色素C氧化酶膜的影响A第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集C,200213514王中华,应天雷,黄仲贤细胞色素C突变研究进展J化学通报,20101313615谢燕,江海洪,龚茜芬,等大鼠脑线粒体细胞色素C氧化酶亚基转录水平的影响J第三军医大学学报,2003,251198798916肖鹏,周宏灏细胞色素氧化酶CYPIA2的研究进展J中南大学学报医学版,2008,335606417杨天燕,高天翔3种鲻科鱼类线粒体CO基因片段序列的比较分析J中国海洋大学学报,2007,37SUP06106
9、618杨学明,郭亚芬罗氏沼虾3个群体线粒体CO基因的序列差异和遗传标记研究遗传,2006,28554054419张凤英,夏连军黄鲷线粒体CO基因部分序列遗传变异研究热带海洋学报,2005,245838920张新宇,高燕宁PCR引物设计及软件使用技巧生物信息学,2004,24151921ACHARDJORISM,GONZALEZP,MARIEV,ETALCYTOCHROMECOXYDASESUBUNITGENEISUPREGULATEDBYCADMIUMINFRESHWATERANDMARINEBIVALVESJBIOMETALS,2006,19323724422GENNISR,FERGUSON
10、MILLERSSTRUCTUREOFCYTOCHROMECOXLDASE,ENERGYGENERATOROFACROHICLIFEJSCIENCE,1995,26952271063106423GASSERB,ZHUX,MCMANUSDPNADHDEHYDROGENASESUBANIT1ANDCYTOCHROMECOXIDASOSUBUNITSEQUENCESCOMPAREDFORMEMBERSOFTHEGENUSTAENIACESTODAJINTJPARASITOL,1999,29121965197024MAUDACHARDJORIS,PATRICEGONZALEZ,VRONIQUEMARIE
11、,ETALCYTOCHROMECOXYDASESUBUNITIGENEISUPREGULATEDBYCADMIUMINFRESHWATERANDMARINEBIVALVESJBIOMETALS,2006,1932725WUW,SEHMIDTTR,GOODMANM,ETALMOLECULAREVOLUTIONOFCYTOCHROMECOXIDASESUBUNITINPRIMATESISTHERECOEVOLUTIONBETWEENMITOCHONDRIALANDNUCLEARGENOMESJMOLPHYLOGENETEVOL,2000,172294304毕业论文文献综述水产养殖细胞色素CO的研究
12、概述摘要本文简述了细胞色素C氧化酶（CO）的结构功能，总体介绍了CO的研究现状，并在分子生物水平的基础上，主要论述了CO基因序列差异的研究在遗传学和病害学上的影响，特别是其在鱼类分类鉴定上所发挥的重要作用。关键词鱼类；细胞色素C；CO；基因序列在生物的线粒体中广泛存在着一种具有自动氧化作用的物质，即细胞色素氧化酶CYTOEHROMEOXIDASE,COX。COX由13个亚基组成，其中最大的3个亚基（CO1、CO2、CO3）来源于线粒体，其序列具有高度的保守性，分别由2个线粒体基因编码CO1和CO2是COX的两个催化中心（钟涛等，2002）。CO作为细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3大亚基之一，
13、是MTDNA编码的最大亚基（谭小玲等，2002），且分子结构简单，检测便捷，具有严格而又典型的母性遗传，难以发生重组，可用于种群间、种、属间甚至科间的系统发育等研究（肖武汉等，2000）。1研究背景1930年，英国生物化学家凯林在心肌提取物中就已经发现细胞色素C氧化酶在电子传递链上的活性。2003年初，加拿大圭尔夫大学的生物学家保罗赫伯特PAULHEBERT和他的同事在英国皇家学会学报B辑上发表了一篇论文，提出用细胞色素C氧化酶I基因片段作为鉴别不同物种的“条码”。十年前，用一种简便易行的方法把物种一一归类似乎是一项不可能的任务，但21世纪以来，随着基因工程的突破性发展，人们开始在分子水平上了
14、解细胞色素C氧化酶的分子结构，发现细胞色素C氧化酶具有很大的保守性，而细胞色素C氧化酶基因序列进化速度适宜，把它的基因片段制成DNA条码最为适合，从而让地球上所有的物种都能拥有一份独特的“身份证”，用以辨别各自属于哪种种类，而且还能用其推测出分类阶元间的系统发育关系（OSTERMEIERCETAL，1996；WUWETAL,2000；李连之等，2001；王中华等，2010）。鱼类是脊椎动物中最原始而在种属数量上又最占优势的类群，其物种繁多，分布广泛，起源复杂，研究其遗传分化，阐明其进化途径，历来是令人饶有兴趣的课题。近年来，随着分子生物学技术向生物学各研究领域渗透，从分子水平，研究鱼类的遗传与
15、进化，已越来越引人注目。其中对鱼类CO的研究将会影响到其分类学，遗传学及疾病学的发展，能为渔业资源有序利用和保护提供参考，又因为鱼类的分类鉴定蕴含着巨大的利益，因此将会有越来越多的人对鱼类CO感兴趣（杨学明等，2006；杨天燕等，2007）。2研究现状21鱼类分类学方面多年以来，生物分类学家一直在寻找能够迅速区分不同物种的方法。传统的分类学鉴定依赖于针对物种外观或者解剖特征的识别，这种方法既费时费力，又可能出现错误。传统分类学并不能准确具体地分类鉴别出生物种类。有时传统分类划分的同一物种却属于几个物种。如传统分类学认为的哥斯达黎加一种蝴蝶，用COI基因片段检验却鉴定出其中包含了十几个属。如果每
16、一个物种都携带有表明自己身份的“条码”，那么物种分类和鉴定工作将得到很大简化。CO是生物分子系统学研究和群体遗传分化的重要标志，其进化速度适宜且有较大的保守性，COI的基因约650个碱基，很适合作为动物分类学与生态学的DNABARCODE（MURGIARETAL，2002）。虽然采用COI基因作为DNABARCODE所隐含的涉及线粒体的进化历史、遗传特性和物种成种时间的默认前提并非完全成立，但目前在动物中最常用的DNABARCODE就是细胞色素C氧化酶1号基因（COI）的部分序列（关申民等，2000）。且随着标准数据库的建立，基于COI基因的DNABARCODE在动物分类学和生态学中得到了广泛
17、应用。近年来，COI作为扫描生命的条码，已被广泛用于鱼类、昆虫、鸟类等动物的鉴别分类研究。现今，因COI条码序列获取很便捷，广泛适用硬骨鱼类物种鉴别，并可用于低级分类阶元的系统进化分析（刘楚吾等，2009），如由青石斑鱼CO与线纹刺尾鲷CO同源性很高，可判断青石斑鱼与线纹刺尾鲷亲缘性很高（施大卫等，2009）；对采自东海的银鲳、翎鲳和中国鲳3种鲳属鱼类的线粒体COI基因序列片段进行研究，能从分子水平研究中国东海海域鲳属鱼类的分类、遗传关系和系统进化，以其了解鲳属鱼类以及与鲳科之间的亲缘关系，又为鲳属鱼类保护生物学和系统进化提供分子生物学依据（张凤英等，2008）；更有人研究了基于线粒体CO1基
18、因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用（彭居俐等，2009）。因此，虽然现在对于用COI基因片段作为鱼类分类鉴定的DNABARCODE研究较少，但鱼类资源保护日益严峻，以CO基因序列为DNABARCODE的鱼类分类鉴别将被频繁用到，并可完善甚至改变鱼类传统分类。22鱼类遗传学方面由于COI无论在鱼类还是其它动物体内都参与了重要的生命活动，其基因序列高度保守，在高氧或缺氧环境中都会影响COI基因序列的表达。另外，在物种遗传过程中发生的基因重组也必定会使COI基因序列发生差异，因而可以利用COI还可以推测出个体在种群内是否发生了基因变异。如研究钉螺子一代的COI基因序列差异可得知子一代
19、钉螺内的核苷酸发生了变异（张仪等，2005）。COI还是参与细胞凋亡的细胞色素C的一大部分，因此研究细胞凋亡过程中发生的基因变异可从COI入手。主要因为CO是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3大亚基之一，而细胞凋亡是动植物最基本的一种生命活动,是一个有一系列酶参与，并且由基因控制的主动的、高度有序的死亡过程。线粒体除了为细胞提供能量外，在细胞凋亡中也起着中心调控作用。线粒体释放的细胞色素C是细胞凋亡过程的关键因素，细胞色素C从线粒体释放的机制及在凋亡中起着重要作用（许守明等，2009）。23鱼类疾病学方面细胞色素氧化酶在动物内分布十分广泛，它的突变与疾病发生有密切的关系，通过分析线粒体DNA编
20、码细胞色素氧化酶亚基基因的结构特点及其突变引起的主要疾病症状，对动物疾病诊断有很大帮助柏干荣等，2003。近年来，由于在临床药物治疗上频繁用到细胞色素C生化制品，人们对细胞色素C的研究较多，细胞色素CO与疾病的关系也越来越吸引人们的目光。如比较中国不同地理株白纹伊蚊细胞色素C亚基I基因序列，可在分子水平上研究不同地理株登革病毒易感性的差异（陈虹等，2003）。更有研究表明，CO1和CO2基因突变造成阿尔茨海默病AD患者COX缺陷的主要原因，而磁场辐照可能通过影响COI的基因转录水平，而使COX活力降低。由于COX的缺陷可以使神经元功能状态发生改变，有人设想磁场导致的神经元变性引起的AD病或脑瘤
21、发生与磁场影响CO1基因转录有关（钟涛等，2002）。现今，鱼类的大部分疾病还缺乏有效的防治方法，在有限的海域进行高密度养殖时又极为容易出现严重的鱼类传染病，导致水产养殖业受到严重损害，所以研究鱼类COI的基因序列差异对其病害的防治必定起着重要的作用。3研究方法以下介绍一种常用鱼类CO的实验研究方法（SHAKLEEJB，1982；GASSERBETAL，1999；董云伟等，2002；李铁华等，2003；张新宇等，2004；陈峥宏等，2009；戴荣四等，2009；）样本采集从市场上选购健康的几种亲缘性较近的鱼类作为样本，并对其进行养殖备用。DNA的提取解剖样本，提取样本的肌肉，再从样本肌肉中提取
22、DNA，用电泳和紫外线分光光度计测量DNA的浓度和质量，进行低温保存。引物设计用PRIMER5OROLIGO6软件，根据相近鱼类CO及上下游序列保守序列设计引物。CO克隆测序PCR扩增各自鱼类的CO基因，然后PCR产物进行克隆，最后送往测序公司测序。CO基因序列分析使用程序软件分析得出的CO基因序列的结构域，构建出进化树，评估样本鱼类的进化关系。4研究前景由于COI基因来自线粒体，它的拷贝数量更多因为一个细胞只有一个细胞核，却有许多线粒体，对其克隆和测序比较简单。测出一份样本中的COI基因的序列之后，把它们与已经测定完成的序列相比较，就可以知道该样本是否属于某个已知物种，而不需要利用传统的分类
23、学方法进行鉴定。更重要的是，DNA条码领域迅速兴起是因为存在对物种鉴别的巨大需求，同时DNA条码已被证明可以提供有效的身份识别。所以利用COI基因为鱼类等动物建立DNA条码将是未来几年的一大发展趋势，用其作为动植物自动化识别分类的前景存在着巨大的商机。参考文献1柏干荣,陆松敏线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基因突变与疾病J国外医学分子生物学分册,2003,2343933952陈虹,陈汉彬中国不同地理株白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基1基因序列比较中国流行病学杂志2003,2461911933陈峥宏,郎书源,吴晓娟,等用COX1基因片段的PCR鉴定亚洲带绦虫和牛带绦虫J贵阳医学院学报,2009,3
24、432392414戴荣四,李芬,刘伟,等湘西地区山羊多头蚴感染调查与种类鉴定J中国人兽共患病学报,2009,2543913945董云伟,牛翠娟,鲍蕾,等单只轮虫DNA提取及其细胞色素C氧化酶I亚基部分序列测定动物学研究,2002181836关申民,高邦权COI序列影响动物分类学与生态学的DNABARCODE生态学杂志,2008,278140614127李连之,黄仲贤细胞色素C氧化酶研究新进展J无机化学学报,2001,1767617748李铁华,郭湘荣,胡铃,等我国五省美洲钩虫COI基因序列多态性分析中国寄生虫病杂志,2003,2142102139刘楚吾,刘丽,王中铎,等军曹鱼的分子遗传特性研究
25、热带海洋学报,2005,241778510彭居俐,王绪祯基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用J水生生物学报,2009,33227127611施大卫,王利,娄绘芳,等青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基COX基因的克隆鉴定及表达分析J中国水产科学,2009,160446847512谭小玲,柳君泽,曹利飞,等缺氧对大鼠大脑皮质细胞色素氧化酶亚基、表达协同性的影响生理学报,2002,54651952413王中华,应天雷,黄仲贤细胞色素C突变研究进展J化学通报,20101313614肖武汉,张亚平鱼类线粒体DNA的遗传与进化J水生生物学报,2000,24438439115许守明
26、,陈双喜何艳霞细胞凋亡与细胞色素C安徽农学通报,2009,15153816杨天燕,高天翔3种鲻科鱼类线粒体CO基因片段序列的比较分析J中国海洋大学学报,2007,37SUP06106617杨学明,郭亚芬罗氏沼虾3个群体线粒体CO基因的序列差异和遗传标记研究遗传,2006,28554054418张凤英,夏连军黄鲷线粒体CO基因部分序列遗传变异研究热带海洋学报,2005,245838919张新宇,高燕宁PCR引物设计及软件使用技巧生物信息学,2004,24151920张仪,刘和香,冯婷,等子一代实验室钉螺细胞色素C氧化酶工、细胞色素B基因序列分析中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2004,2252742
27、7621钟涛,陈苘,吴瑞英,等极低频磁场对细胞色素氧化酶亚基1基因转录水平的影响中华劳动卫生职业病杂志,2002,20124925122GASSERB,ZHUX,MCMANUSDPNADHDEHYDROGENASESUBANITANDCYTOCHROMECOXIDASOSUBUNITSEQUENCESCOMPAREDFORMEMBERSOFTHEGENUSTAENIACESTODAJINTJPARASITOL,1999,29121965197023MURGIAR,TOLAG,ARCHERSN,ETALGENETICIDENTIFICATIONOFGREYMULLETSPECIESMUGILID
28、AEBYANALYSISOFMITOCHONDRIALDNASEQUENCEAPPLICATIONTOIDENTIFYTHEORIGINOFPROCESSEDOVARYPRODUCTSBOTTARGAJMARINEBIOTECHNOLOGY,2002,4411912624OSTERMEIERC,IWATATS,MICHELHCYTOCHROMECOXIDASECURROPINSTRUCTBIOL,1996,646046625SHAKLEEJBSPECIATIONANDEVOLUTIONOFMARINEFISHESSTUDIEDBYELECTROPHORESISANALYSISOFPROTEIN
29、SJPACSCI,1982,3614115726WUW,SEHMIDTTR,GOODMANM,ETALMOLECULAREVOLUTIONOFCYTOCHROMECOXIDASESUBUNITINPRIMATESISTHERECOEVOLUTIONBETWEENMITOCHONDRIALANDNUCLEARGENOMESJMOLPHYLOGENETEVOL,2000,172294304本科毕业设计（20_届）大弹涂鱼、弹涂鱼的线粒体COI基因差异及系统发育目录引言11材料与方法111样品采集112基因组DNA提取113PCR扩增及序列测定114基因序列信息的收集215基因序列的分析22结果与分
30、析221大弹涂鱼、弹涂鱼COI基因序列特征及变异222种间及种内的遗传距离523虾虎鱼科分类及其分子系统树53讨论8致谢错误未定义书签。参考文献9摘要本研究探讨将虾虎鱼科鱼类线粒体COI基因作为DNA条形码在物种鉴定上应用的可行性。采集虾虎鱼科中的大弹涂鱼BPECTINIROSTRIS和弹涂鱼PCANTONENSIS各6尾，从其肌肉抽提DNA，然后PCR扩增线粒体COI基因，纯化并测序。研究中获得了这2种虾虎鱼科鱼类长度约为650BP的COI基因序列。该序列与GENBANK下载的其它12种虾虎鱼科鱼类的COI基因序列，经CLUSTALX辅助校正，采用MEGA软件以KIMURA2PARAMETE
31、R计算出种间及种内距离，并基于NJ和MP法构建出14种虾虎鱼科鱼类分子系统树。大弹涂鱼和弹涂鱼种内遗传距离分别为0002和0008，而14种虾虎鱼科鱼类种间平均遗传距离为0224。在分子系统树上，14个种均可形成单系，其中背眼虾虎鱼亚科的大弹涂鱼和青弹涂鱼间的遗传距离较大弹涂鱼和弹涂鱼的小，所以在系统发育上大弹涂鱼属与青弹涂鱼属间的亲缘性比大弹涂鱼属与弹涂鱼属间的亲缘性高。关键词大弹涂鱼；弹涂鱼；COI基因；系统发育ABSTRACTINTHISSTUDY,WEDISCUSSEDTHEVALIDATIONOFCOIGENESEQUENCETOEFFICIENTLYIDENTIFYTHESPECI
32、ESOFGENUSGOBIIDAEBPECTINIROSTRISANDPCANTONENSISOFGOBIIDAESPECIESWERECOLLECTEDEACHSIXONEFORTHISSTUDY,THEIRGENOMICDNASWASEXTRACTEDFROMMUSCLE,ANDTHEMITOCHONDIALCOIGENEFRAGMENTSWEREAMPLIFIESWITHPCRAFTERPURIFICATION,THEAMPLIFIEDPRODUCTSWERESEQUENCEDTHEEXPERIMENTALRESULTSSHOWEDTHATAGENEFRAGMENTOFTHISTWOSP
33、ECIESWITHMOLECULARSIZEABOUT650BPWEREOBTAINEDAFTERPCRAMPLIFICATIONSTHESESEQUENSESANDOTHER12SPECIESOFGOBIIDAEWEREADJUSTEDBYCLUSTALX,THENTHEPROGRAMMEGAWASUSEDFORSEQUENCEANALYSISGENETICDISTANCESWERECOMPUTEDWITHKIMURA2PARAMETERMODELANDPHYLOGENETICTREEWASRECONSTRUCTEDWITHNJANDMPTHEDISTANCEWITHINSPECIESOFB
34、PECTINIROSTRISANDPCANTONENSISWAS0002AND0008,RESPECTIVELY,ANDTHEAVERAGEDISTANCEBETWEENTHE14SPECIESWAS0224ONTHEPHYLOGENETICTREE,14SPECIESASSEMBLEDINONECLASSBUTTHEGENETICDISTANCEBETWEENBPECTINIROSTRISANDSHISTOPHORUSOFOXUDERCINAEWASSMALLERTHANBETWEENBPECTINIROSTRISANDPCANTONENSIS,SOTHEAFFINITYBETWEENBOL
35、EOPHTHALMUSANDSCARTELAOSWASMUCHHIGHERTHANBOLEOPHTHALMUSANDPERIOPHTHALMUSKEYWORDSBOLEOPHTHALMUSPECTINIROSTRISPERIOPHTHALMUSCANTONENSISCYTOCHROMEOXIDASESUBUNITICOIPHYLOGENESIS1引言虾虎鱼科（GOBIIDAE）属鲈鱼目，虾虎鱼亚目。虾虎鱼科鱼类的特点是身体细长，有两条脊鳍，大多数虾虎鱼科鱼类前鳍化为吸盘，可于岸边爬行，如弹涂鱼，大弹涂鱼。该科鱼类分布于全世界，一共大约有800多种，它们大多栖息于热带的海水中，是一种体型较小的食
36、肉鱼类。当前，已经有很多人研究过COI基因序列作为DNABARCODE用于系统分类及物种鉴定上的的应用王中华等，2010；肖武汉等，2000；许守明等，2009。虽然因为涉及线粒体的进化历史、遗传特性和物种成种时间的默认前提使得利用COI基因作为DNABARCODE并非完全成立，但是细胞色素C氧化酶1号基因（COI）的部分序列是目前在动物中最适用的DNABARCODE（柏干荣等，2003；李铁华等，2003；李连之等，2001）。且随着标准数据库的建立，基于COI基因的DNABARCODE在生物分类学和生态学中将得到广泛应用。近年来，在鱼类、昆虫、鸟类等动物的鉴别分类研究中COI作为扫描生命的
37、条形码已被广泛用到。现今，因为COI条码序列获取很便捷，广泛适用硬骨鱼类物种鉴别，并可用于低级分类阶元的系统进化分析（刘楚吾等，2009；关申民等，2008），如由青石斑鱼COI与线纹刺尾鲷COI同源性很高，可判断青石斑鱼与线纹刺尾鲷亲缘性很高（施大卫等，2009）；采自东海的银鲳、翎鲳和中国鲳3种鲳属鱼类的线粒体COI基因序列片段进行研究，能从分子水平研究中国东海海域鲳属鱼类的分类、遗传关系和系统进化，以其了解鲳属鱼类以及与鲳科之间的亲缘关系，又为鲳属鱼类保护生物学和系统进化提供分子生物学依据（张凤英等，2008）；HEBERT等（2003B对动物界11个门13320个物种的研究结果显示，线
38、粒体COI基因细胞色素氧化酶亚基1靠近5端的一段序列能够对动物界的物种进行有效的鉴定，并且在多数动物类群中，COI基因都存在显著的序列变异。彭居俐等（2009）研究了基于线粒体COI基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用。目前，对动物界物种进行DNA条形码研究所通常选择的基因就是COI基因。因此，虽然现在对于用COI基因片段作为鱼类分类鉴定的DNABARCODE研究还比较少，但鱼类资源保护日益严峻，以COI基因序列为DNABARCODE的鱼类分类鉴别将被频繁用到。本研究将通过对大弹涂鱼、弹涂鱼及另外12种虾虎鱼科鱼类COI基因序列的分析研究，从而分析大弹涂鱼与弹涂鱼的系统进化关系
39、，并总结出14种虾虎鱼科的基因序列的差异，进而为以后基于COI基因的DNABARCODE在鱼类物种鉴定的研究奠定基础，为鱼类分类学及生态学的发展提供参考。1材料与方法11样品采集本研究使用的大弹涂鱼、弹涂鱼各6个个体，大弹涂鱼采集自浙江省宁海县，而弹涂鱼采集自浙江省慈溪市杭州湾。从其各取背部肌肉组织样品放入液氮中过夜后，于80保存备用（关飞等，2007；陈虹等，2003；GASSERBETA1,1999）。12基因组DNA提取取样品背部肌肉100MG加液氮研磨，加500L裂解液、20L蛋白酶K、1LRNA酶，在55水浴至完全溶解。加等体积饱和酚，轻轻混匀于4、12000RPM离心20MIN后，
40、小心移取上清液于新的灭菌离心管中，再加入等体积（500L）酚二氯仿二异戊醇（25241），混匀于4，12000RPM离心15MIN，再移取等体积（500L）氯仿二异戊醇（241）上下颠倒混匀后于12000RPM离心15MIN。移取上清液，取剩余液的1/10体积（50L）加入3M的NAAC和2倍体积（1000L）预冷的无水乙醇20于20冰箱过夜。24H后，4，10000RPM离心15MIN，弃上清液，然后加入70酒精1ML反复洗涤，沉淀再次离心15MIN。将沉淀于放置至无酒精味。最后用适量的溶液TE溶解，置于4冰箱中保存备用。13PCR扩增及序列测定PCR扩增的目的片段是COI基因靠近5端的长度
41、为650左右的序列。其扩增和测序引物参照文献WARDETAL,2005，由上海生工合成，引物序列为F1TCAACCAACCACAAAGACATTGGCACF2TCGACTAATCATAAAGATATCGGCACPCR反应使用的每一样品扩增体积为50L，其中无菌水175L，引物各25L，TAE缓冲液25L，DNA模板25L。PCR反应条件为预变性945MIN，变性9430S,2退火5430S，延伸7230S，最后延伸7210MIN，保温4。扩增产物经2的琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性PCR产物送至INVITROGEN公司完成测序工作。14基因序列信息的收集除本研究所检测的2种虾虎鱼科鱼类弹涂鱼和大
42、弹涂鱼外，从GENBANK下载12种虾虎鱼科鱼类及乌塘鱧科的乌塘鱧（BOSTRYCHUSSINENSIS）的COI基因序列。利用本研究的2种虾虎鱼科和这另外的12种虾虎鱼科鱼类的COI基因同源序列一起分析研究，将同为虾虎鱼亚目的乌塘鱧科乌塘鱧的COI基因同源序列用作外群（杨天燕等，2007；柳淑芳等，2010）。所分析物种的COI基因及其相关信息见表1。15基因序列的分析获得的测序结果先利用NCBI软件中的BLAST工具进行相似性的检索，以确认实验所得基因序列是目的片段（张仪等，2004）。用CLUSTALX软件对本研究所得序列和GENBANK下载的相关序列进行排序并进行手工校正剪切，然后用M
43、EGA软件计算出序列的碱基组成、种内以及种间遗传距离。分子系统树的构建采用的是邻接法NJ和最大简约法MP。邻接法分析采用KIMURA2PARAMETER遗传距离，进行1000次自展分支检验。最大简约法分析使用启发式搜索，构树方法采用二等分再连接TREEBISECTIONRECONNECTION,TBR，所有数据均未加权，获得50一致性的树，可靠性由1000次自展分支检验（杨学明等，2006；柳淑芳等，2010；MURGIARETAL,2002）。表1本研究所分析物种的COI基因信息TAB1INFORMATIONOFCOIGENESOFANALYTICALSPECIESINTHISSTUDY表示
44、外群REPRESENTTHEOUTGROUP2结果与分析21大弹涂鱼、弹涂鱼COI基因序列特征及变异本研究所使用的引物位于COI基因的5端，采用上游引物F1与下游引物R1对总DNA进行PCR。通过PCR可获得的2种虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科的鱼类，即弹涂鱼和大弹涂鱼各6个个体的线粒体COI基因部分片段，片段长度约为650BP，表明COI基因通用引物在虾虎鱼科中具有一定的普遍适用性。由图1可见，本研究两种虾虎鱼科鱼类提取的基因组DNA及PCR产物经电泳后都能较好的分离成像。编号物种名称拉丁名分类地位样品数GENBANK序列号GP_1丝条凡塘鱧VALENCIENNEASTRIGATA虾虎鱼科虾虎鱼亚科
45、凡塘鱧属1FJ584231GP_2六斑凡塘鳢VALENCIENNEASEXGUTTATA虾虎鱼科虾虎鱼亚科凡塘鱧属1FJ584224GP_3双带凡塘鳢VALENCIENNEAHELSDINGENII虾虎鱼科虾虎鱼亚科凡塘鱧属1HQ561523GP_4宽纹叶虾虎鱼GOBIODONHISTRIO虾虎鱼科虾虎鱼亚科叶虾虎鱼属1FJ583450GP_5GOBIONELLUSOCEANICUS虾虎鱼科拟虾虎鱼亚科1GU224484GP_6大弹涂鱼BOLEOPHTHALMUSPECTINIROSTRIS虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科大弹涂鱼属6本研究GP_7GNATHOLEPISTHOMPSONI虾虎鱼科拟虾虎鱼
46、亚科1GU224475GP_8青弹涂鱼SCARTELAOSHISTOPHORUS虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科青弹涂鱼属1EU595282GP_9弹涂鱼PERIOPHTHALMUSCANTONENSIS虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科弹涂鱼属6本研究GP_10黄体叶虾虎鱼GOBIODONOKINAWAE虾虎鱼科虾虎鱼亚科叶虾虎鱼属1FJ583456GP_11五线叶虾虎鱼GOBIODONQUINQUESTRIGATUS虾虎鱼科虾虎鱼亚科叶虾虎鱼属1FJ583459GP_12CTENOGOBIUSBOLEOSOMA虾虎鱼科拟虾虎鱼亚科1GU224403GP_13OLIGOLEPISACUTIPENNIS虾虎鱼科拟虾
47、虎鱼亚科1HQ654731GP_14丝虾虎鱼CRYPTOCENTRUS虾虎鱼科虾虎鱼亚科丝虾虎鱼属1HQ561513OUT1乌塘鱧BOSTRYCHUSSINENSIS乌塘鱧科乌塘鱧属1AY7221643AB图1提取的DNA电泳图及PCR扩增结果FIG1THEELECTROPHORESISFIGURESOFEXTRACTINGDNAANDPCRPRODUCT为基因组电泳图；为产物电泳图。弹涂鱼个体编号为1，2，3，4，5，6；大弹涂鱼个体编号为B1，B2，B3，B4，B5，B6。图MARKER为1KBDNAMARKER；图MARK为PCU19DNAMARKER。AISTHEGENOMICDNAE
48、LECTROPHORESISFIGUREBISTHEPCRPRODUCTSELECTROPHORESISFIGURETHEINDIVIDUALBPECTINIROSTRISNUMBERSFOR1,2,3,4,5,6THEINDIVIDUALBPECTINIROSTRISNUMBERSFORB1,B2,B3,B4,B5,B6AFIGUREMARKERFOR1KBDNAMARKERBFIGUREMARKERFORPCU19DNAMARKER采用CLUSTALX软件对本研究所得的两种COI部分序列和12个已发表虾虎鱼科鱼类COI同源序列进行聚类和排序，保留其共有序列，长度为601BP，编码200个氨
49、基酸。用MEGA4计算这24条序列的碱基组成，平均碱基组成为A238、T292、G186、C284，AT含量530高于GC470。而对所研究的14种鱼24个COI基因片段来说，第1密码子位点GC含量571显著高于第2和第3密码子位点440和307表2。所有个体序列核苷酸变异情况见表3。全部位点中不变位点有486个，转换位点有67个，颠换位点有48个。其中不变位点属第2码子位点最多，为200个；而转换位点和颠换位点均属第3密码子位点最多，分别为59个和47个。由表4可以看出，这14种虾虎鱼科鱼类24个个体的COI基因平均GC含量为396504，其中第1密码子位点的GC含量均较高457582，第2密码子的GC含量高度一致都为440，第3密码子的GC含量变化范围最大275490。而大弹涂鱼和弹涂鱼COI基因片段的GC含量相对较低，分别为4064和396。表2所选虾虎鱼科个体的COI基因部分序列中各碱基平均分布频率TAB2AVERAGENUCLEOTIDEFREQUENCIESOFCOIPARTIALSEQUENCESOFTHESELECTEDGOBIIDAESPECIES碱
