1、本科毕业论文系列开题报告生物技术小硅藻培养过程中脂类代谢物的变化研究一、选题的背景与意义微藻是海洋生态系统中最重要的自养生物，是海洋生态系统中最主要初级生产者，也是海洋生物资源的重要组成部分，具有种类多、数量大、繁殖快等特点，在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。它们的盛衰直接或间接地影响着整个海洋生态系的生产力，因此，与渔业资源、水产养殖、环保、地质等密切相关。微藻本身营养丰富，富含蛋白质、多糖等各种生物活性物质。微藻中的二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA属于多不饱和脂肪酸PUFA，EPA对人类循环系统的多种疾病具有突出的疗效，可用于治疗和预防动脉粥样硬化、类风湿关节
2、炎、哮喘、血栓的形成。DHA俗称脑黄金，是神经系统细胞生长及维持的一种主要元素，是大脑和视网膜的重要构成成分，对胎婴儿智力和视力发育至关重要。此外，EPA还能增强水产养殖动物的免疫系统功能，提高存活力和抗病能力，是水产饲料中的必需脂肪酸。因此，微藻在医药、食品、水产养殖、农业等领域具有重要开发价值。植物细胞体内含中性脂和极性脂，有研究结果表明，微藻不同生长阶段，会造成细胞内总脂含量和脂肪酸组成的变化。而海洋微藻的脂类含量和组成除了决定于藻种本身的遗传因素外，还受细胞生长时期期和环境条件，如培养基组成、温度、光强等的影响。魏东等人研究海洋微藻后棘藻ELLIPSOIDIONSP714和眼点拟微球藻
3、NANNOCHLOROPSISOCULATA两种微藻后发现，总脂的含量均在稳定期达到最高，而EPA、3多不饱和脂肪酸和PUFA占总脂肪酸的最高比例均出现在对数早期，此时的总脂含量却是最低的。EIZADORA等人研究了N，SI缺乏时TPSEUDONANA和PTRICORNUTUM生长周期中三酰甘油TGA的变化。研究发现，SI缺少样品中，TPSEUDONANA一些TAG种类在进入稳定期早期剧烈下降，如485，504，505，506，508，525，526，PTRICORNUTUM藻细胞表现出在稳定期开始时TAGS不饱和度增高（特别是528，529等的增加），即藻细胞从指数期向稳定期转变过程当中TA
4、G种类中不饱和脂肪酸增多了。由于脂类化合物在藻体内的不同存在形式能量储存物质，细胞膜脂类，新陈代谢中间产物，微藻体内脂类含量会随着自身的生长而发生相应变化。目前，国内外学者关于环境因子对微藻脂类积累影响的研究主要集中在营养盐成分、光强、温度等因素上，而生长周期内脂类积累的，特别是极性脂积累变化的研究较少。本文研究的意义在于通过UPLCQTOF分析微藻在其生长周期不同阶段脂类代谢物的变化，科学确定出脂类、能源积累的阶段，从而为微藻的能源开发提供理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）、课题研究的基本内容利用UPLCQTOFMS分析系统，以分布在微藻细胞内脂类代谢物为主要研究对象，建立
5、生物体内脂类的定性和定量分析方法；利用建立的方法对在生长周期不同阶段典型微藻的脂类组成和结构特征进行研究，分析其脂组的差异性。（二）、拟解决的主要问题1摸索总脂QTOFMS质谱最佳测定条件。2摸索出总脂的UPLC分离条件。3根据QTOFMS数据对样品中总脂各组分的结构特征、脂链连接方式判定、MSMS分析、精确分子量分析。4PCA和SIMCAP统计软件处理生长周期中不同阶段微藻脂类的不同，分析微藻培养过程中脂组的变化规律。三、研究的方法与技术路线四、研究的总体安排与进度201010201011查询与论文有关的资料、撰写试验计划、熟悉基本的实验操作。201011201012建立总脂的定性和定量分析
6、方法。20101220111利用以建立的方法分析被测微藻的脂类代谢物的组成和结构，利用SIMCAP统计软件分析脂组的变化规律。2011320115典型微藻的脂组分析测定，对实验所涉及到的内容的不足之处进行补充性实验，收集整理实验数据和撰写论文。五、主要参考文献1魏东,张学成,邹立红,徐年军细胞生长时期对两种海洋微藻总脂含量和脂肪酸组成的影响J青岛海洋大学学报,2000,3035035092EIZADORATYU,FRANKJZENDEJAS,PAMELADLANE,ETALTRIACYLGLYCEROLACCUMULATIONANDPROFILINGINTHE通过微藻总脂提取样品摸索液相分离条
7、件确定脂类化合物的分析条件、结构特征、脂链连接方式判定、MSMS分析、精确分子量分析通过微藻总脂提取样品摸索液相分离条件建立脂类代谢物UPLCQTOFMS分析方法典型微藻脂提取SIMCAP统计软件分析脂组的变化规律分析被测微藻中脂类的组成和结构MODELDIATOMSTHALASSIOSIRAPSEUDONANAANDPHAEODACTYLUMTRICORNUTUMBACCILARIOPHYCEAEDURINGSTARVATIONJJAPPLPHYCOL,2009,216696813YANGW,FENGFY,HOUHT,ETALALTERNATIONINLIPIDCOMPOSITIONOFWH
8、EATLEAVESINDUCEDBYPHOSPHATEDEFICIENCYISRELATEDTOBOTHLIPIDBIOSYNTHESISANDPHOSPHATIDYLGLYCEROLDEGRADATIONJACTABOTANICASINICA,2004,462112154VANMOOYBA,ROCAPG,FREDRICKSHF,EVANSCT,DEVOLAHSULFOLIPIDSDRAMATICALLYDECREASEPHOSPHORUSDEMANDBYPICOCYANOBACTERIAINOLIGOTROPHICMARINEENVIRONMENTSJPROCNATLACADSCIUSA,2
9、006,103860786125蒋霞敏,郑亦周14种微藻总脂含量和脂肪酸组成研究J水生生物学报,2003,032432466魏东,张学成,隋正红等氮源和N/P对眼点拟微球藻的生长、总脂含量和脂肪酸组成的影响J海洋科学,2000,72446517蒋冰飞,孙颖颖,王长海营养盐对球等鞭金藻生长和脂肪酸含量及组分的影响J海洋通报,2007,0556618蒋霞敏温度、光照、氮含量对微绿球藻生长及脂肪酸组成的影响J海洋科学,2002,089129代玉华,刘训言,孟庆伟,赵世杰低温胁迫对类囊体膜脂代谢的影响J植物学通报,2004,0450651110曹春晖,孙世春,麦康森,梁英光照强度对四株海洋绿藻总脂含量
10、和脂肪酸组成的影响J生态学报,2010,092347235311黄冠华,陈峰环境因子对异养小球藻脂肪酸组分含量和脂肪总酸产量的影响J可再生能源,2009,273656912吴瑞珊,魏东FE对眼点拟微球藻的生长和脂肪酸组成的影响J海洋科学,2008,327939513李春颖,仇雪梅海洋微藻脂肪酸组成的研究进展J生物技术通报,2008,4636514徐继林,陈德莹,严小军,等超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱对混合光合作用糖脂的分析J分析化学,2009,451151615徐继林,严小军脂类分析在海洋微藻化学分类学上的研究进展J海洋通报,2004,232657016蒋汉明,高坤山氮源及其浓度对三角褐指
11、藻生长和脂肪酸组成的影响J水生生物学报,2004,28554555117王菊芳,梁世中,吴振强碳氮比对隐甲藻CRYPTHECODINIUMCOHNII总脂及DHA含量的影响J华南理工大学学报,2000,2810283118梁英,麦康森,孙世春硝酸钠浓度对2株三角褐指藻生长及脂肪酸组成的影响J黄渤海海洋,2001,194566219梁英,麦康森,孙世春等硝酸钠浓度对三角褐指藻PHAEODACTYLUMTRICORNUTUMMACC/B226生长及脂肪酸组成的影响J海洋科学,2002,65485120陈娜,郭尚敬,孟庆伟膜脂组成与植物抗冷性的关系及其分子生物学研究进展J生物技术通报,2005,26
12、921谢玉英膜脂组成与植物抗寒性的关系J安徽农学通报,2007,1311383922MURATANMOLECULARSPECIESCOMPOSITIONOFPHOSPHATIDYLGLYCEROLSFROMCHILLINGSENSITIVEANDCHILLINGRESISTANTPLANTSJPLANTCELLPHYSIOL,1983,24818623侯旭光,姜英辉,李光友南极冰藻的总脂含量及脂肪酸组成与其低温适应性的关系J黄渤海海洋,2002,201475324石娟,潘克厚不同光照条件对小新月菱形藻和等鞭金藻8701生长及生化成分的影响J中国水产科学,2004,11212112825李荷芳,
13、周汉秋光照强度对海洋微藻脂肪含量及脂肪酸组成影响的研究J海洋科学集刊,2001,4317818326缪锦来,王波,阚光锋,丁燏,姜英辉,侯旭光,李光友环境因子对2种南极绿藻脂肪含量和脂肪酸组成的影响J海洋科学,2005,0141027蒋敏霞,柳敏海,邢晨光,等不同生长条件对绿色巴夫藻生长与脂肪酸组成的影响J水生生物学报,2007,311889328蒋汉明,翟静,张媛英,顾洪雁,高坤山等鞭金藻生长和脂肪酸组成随FE3浓度变化的研究J中国油脂,2005,3085759毕业论文文献综述生物技术环境因子对微藻脂类的影响摘要环境因子包括培养基的组成，光照、温度、盐度等，它们在决定微藻脂类的种类和数量方面
14、起着重要作用。微藻细胞中脂类的数量及质量是评价其营养价值的重要指标。大量研究表明，环境因子变化对微藻的脂肪含量和脂肪酸组成有着显著变化。这些变化既表现在细胞膜膜脂性质的变化，又体现在贮存脂类合成和利用速率的相对变化。关键词环境因子；微藻；脂类1引言微藻是海洋生态系统中最重要的自养生物，是海洋生态系统中的最主要初级生产者，也是海洋生物资源的重要组成部分，具有种类多、数量大、繁殖快等特点。微藻的营养价值与其生化组成特别是脂类和脂肪酸的组成和含量密切相关。海洋微藻是海洋多不饱和脂肪酸的初级生产者，微藻中的二十碳五烯酸EICOSAPENTAENOICACID,简称EPA,2053是长链3系列多不饱和脂
15、肪酸POLYUNSATURATEDFATTYACID,简称PUFA的一种，对人类循环系统的多种疾病具有突出的疗效，可用于治疗和预防动脉粥样硬化、类风湿关节炎、血栓形成，对治疗其它疾病如癌症、炎症、哮喘、糖尿病等也取得了令人鼓舞的结果1。作为人类的高级营养食品和药品越来越受到重视。EPA还能增强水产养殖动物的免疫系统功能，提高存活力和抗病能力，是水产饲料中的必需脂肪酸2。海洋微藻总脂含量和脂肪酸组成，除微藻本身遗传因素外，培养基组成如氮、磷浓度和氮磷比、环境条件如光强、温度、盐度等因素都会极大地影响它们的生物合成和积累。根据相关研究报告3，在高氮浓度下小球藻CHLORELLASP、紫球藻PORP
16、HYRIDIUMCRUENTUM的PUFA含量增加，低的光照强度能促进PUFA的形成和积累。而提高光照强度能使小球藻CHLORELLASP和紫球藻PORPHYRIDIUMCRUENTUM中的EPA得以积累。因此，海洋微藻总脂含量和脂肪酸组成在很大程度上受到环境因子的影响。控制好培养条件，并在特定的生长期收获，能使微藻的总脂含量和脂肪酸组成满足特定的需要。本文以各种环境因子变化对海洋微藻脂类积累产生的影响加以概述。2氮浓度对微藻脂类积累的影响氮作为微藻生长必需的基本元素之一，氮源的种类及浓度对微藻脂肪酸组成的影响较大。EIZADORA等4的研究表明，在N、P缺乏下，所检测到的TAG种类和含量均不
17、同，表现在饱和度不同。蒋汉明等5的研究表明不添加氮源时，EPA的合成受到明显的抑制，使得C182N6和C183N6大量积累，从而导致PUFAS占总脂肪酸的比例也较高；高浓度的氮，尤其是NH2CONH2，能够促进三角褐指藻合成较高的EPA和PUFAS，其占总脂肪酸的比例也随着NH2CONH2浓度的增加而上升。王菊芳等6的研究发现随着碳氮比的提高，DHA占总脂肪酸的百分比降低。梁英等7,8用含有不同硝酸钠浓度的培养基培养三角褐指藻PHAEODACTYLUMTRICORNUTUMMACC/B118，B221，B226，发现在一定浓度范围内，EPA含量随硝酸钠浓度增加而增加，在硝酸钠浓度为75MG/L
18、时EPA含量最低93101，在硝酸钠浓度为L875MG/L时EPA含量最高12213,4。硅藻DHA含量较低，硝酸钠浓度对DHA含量的影响不明显，但对B221的DHA含量的影响差异显著。但到目前为止，氮缺乏诱导脂类积累的有关机理还不清楚。3磷浓度对微藻脂类积累的影响P源是维持很多植物和微生物正常生长的重要因素，魏东等研究了氮源和N/P对眼点拟微球藻的生长、总脂含量和脂肪酸组成的影响，当将培养基中所有营养盐增加4倍，EPA含量可提高到35，说明富含氮、磷的培养基可使细胞始终保持旺盛生长、富含EPA的状态，这也是该种微藻大规模培养中高产EPA的关键措施9。蒋冰飞等10在营养盐（NAH2PO4）对球
19、等金藻脂肪酸含量及组分的影响实验中发现，随着培养液中营养盐浓度的增加藻细胞中脂肪酸含量占细胞干重的比例呈现下降趋势，且营养盐浓度上升越高，其下降幅度也越大。球等鞭金藻细胞中C140，C160和C18系列脂肪酸居多，以C182为最多，并含有丰富的C226DHA。随着营养盐浓度的上升，PUFA占细胞干重的百分含量下降，且下降程度大，DHA占细胞干重的百分比也下降，但下降程度不大。YANGWEN等11研究了不同磷酸盐梯度下小麦叶片脂类组成的变化，发现当磷酸盐缺乏时，光合膜中脂类水平将发生重大改变，其中PG和MGDG含量降低，伴随着DGDG和SQDG的含量升高。且脂类的变化和叶龄有关。这些结果表明，磷
20、酸盐的缺乏将会影响脂类的生物合成，同时，PG含量的降低也与此相关。有学者发现，在磷胁迫下，磷脂和糖脂会发生互相取代作用。在磷胁迫下，检测芽部和根部细胞中DGDG的含量，结果发现DGDG在两者细胞中的含量均上升。此外，在液泡膜和线粒体膜中也检测到DGDG，猜测糖脂从质体转移到线粒体中是基于两者的直接接触。在海洋生态系统中磷脂和糖脂相互取代的这种能力显得尤为重要。在北太平洋亚热带环流区，浮游生物吸收的磷酸盐大约有1828用来合成生物体内的膜脂。但是原绿球藻（一种藻青菌，在整个亚热带环流区的浮游生物中居于主导地位）却用不到1的磷酸盐合成膜磷脂，反而主要合成的是SQDG，其与MGDG、DGDG共同组成
21、了总脂的9499。生物这种“硫取代磷”的适应性策略为生活在磷酸盐缺乏的海洋中的生物成功繁衍提供了保障12。4温度对微藻脂类积累的影响温度是影响微藻细胞合成脂肪和脂肪酸的重要因子之一，其影响因藻种而异。温度对微藻总脂含量的影响只对少数种作了研究，变化的趋势并不一致。蒋霞敏13在温度对微绿球藻脂肪酸组成的影响实验中指出，当温度在520范围内，EPA随着温度的上升而增高，20时EPA达到最高水平，但超过20，EPA随着温度的上升而降低，在30时EPA最低；而161N7随着温度的上升而下降，20时降至最低水平，但超过20161N7随着温度的上升而增高。生物膜主要由脂类、蛋白质和一些碳水化合物组成。膜的
22、流动性是维持正常膜功能的基础，它主要取决于膜的脂类分子的饱和程度14。生物膜结构是一个动态平衡体系，随外界温度变化内部成分进行适应性调整16。正常情况下，植物的生理活动需要在液晶态的膜相，这时的膜流动性好，当温度降低到一定程度时，膜脂由液晶态变为凝胶态，这种膜脂相变会导致原生质流动停止，膜结合酶活力降低和膜透性增大，引起胞内离子渗漏，胞内离子失去平衡，继而使细胞代谢失调，有毒的中间代谢物积累，使植物细胞受害15。如果含不同饱和程度的膜脂，由于不饱和脂肪酸，相变温度较低，能在较低温度下保持流动性，从而维持植物的正常生理功能。近年来的研究表明，PG因具有较多的饱和脂肪酸，而成为决定膜脂相变的主要因
23、素16。MURATA17对12种抗冷植物9种冷敏感植物中的PG脂肪酸饱和度进行了分析，发现在8种冷敏感植物中（除番茄外PG的饱和脂肪酸含量比较高，占总脂肪酸的6075，而11种抗冷植物中的则为5057，说明PG的饱和度与植物的抗冷性明显的相关。膜脂对低温胁迫作用的适应可能与膜脂脂肪酸不饱和程度增高有关。侯旭光、姜英辉等人18发现4种南极冰藻的脂肪酸组成中主要是不饱和脂肪酸的形式，在低温的条件下（210）不饱和脂肪酸的含量会增加，饱和脂肪酸的含量会下降。5光照对微藻脂类积累的影响光是藻培养中影响其生长的最重要的因子之一，光线的明与暗，光度的强与弱，不仅对微藻的生长速率、产量有影响，而且对其总脂含
24、量和脂肪酸的组成也有影响。曹春晖等19在光照强度对四株海洋绿藻（小球藻CHLORELASPPMACC/C95,/C97,/C102和杆状裂丝藻STICHOCOCCUSBACILLARISMACC/C19）总脂含量和脂肪酸组成的实验中发现，C19的脂肪含量在低中光强30005000LX间变化不大，而在高光照强度时总脂含量显著低于其它各组；C95的总脂含量随光照强度变化不大；C97和C102的总脂含量随光照强度升高而明显升高。小球藻EPA含量随光照强度的增加而明显降低，SFA和MUFA总量随光照强度的增加总体呈增加趋势；杆状裂丝藻C19的EPA含量随光照强度的增加呈现低高低趋势，SFA随光照强度的
25、增加呈降低趋势，MUFA随光照强度的增加呈增加趋势。4株绿藻的PUFA总量均随光照强度的增加而降低。石娟等20研究发现低光下小新月菱形藻和等鞭金藻的脂肪含量多而高光下则相反，这种变化也许跟细胞内参与光合作用的细胞器的变化有关。李荷芳等21人通过研究发现，海洋微藻中脂肪酸组成随光照强度增加而导致饱和脂肪酸和一烯酸的总含量增加，高度不饱和脂肪酸含量则下降；同时还发现光照强度增加，脂肪酸组成中EPA含量下降，但对DHA含量影响不大。这表明，不同种藻光强对脂类影响可能不同。6植物盐对微藻脂类积累的影响有关盐度对微藻脂类组成的影响只在少数藻类中作过研究。不同的微藻对盐度有不同的反应。缪锦来等22在用不同
26、盐度对2种绿藻（PYRAMIDOMONASSP和CHLOROPHYCEAEL4）总脂含量和脂肪酸组成影响的实验中发现，盐度对2种绿藻脂肪的积累有一定的影响。随着盐度的提高，PYRAMIDOMONASSP总脂含量上升；盐度为33150时,CHLOROPHYCEAEL4总脂含量也增加，盐度的提高有利于2种绿藻积累脂肪。随着盐度的增加，2种绿藻的饱和脂肪酸增加，多不饱和脂肪酸的含量则降低。对于PYRAMIDOMONASSP而言,C183和C204的含量随着盐度的增加而降低，盐度的增加不利于多不饱和脂肪酸的积累。黄冠华等23在盐度对小球藻脂肪酸组成和含量的影响实验中发现，低浓度的NACL能明显地降低小
27、球藻中脂肪酸的饱和度，生成更多的不饱和脂肪酸，当NACL浓度升高时，小球藻脂肪酸的饱和度逐渐增加。蒋霞敏等24的研究表明绿色巴夫藻PAVLAVAVIRIDID在低盐度条件下有利于PUFAN3及EPA的合成。7微量元素对微藻脂类积累的影响微量元素对微藻脂类的积累也起着重要的作用。铁是海水中重要的微量元素，海水中铁的含量和存在形式不仅会影响到藻类的生长而且可能会影响藻类的生化组成。蒋汉明等25利用微量元素铁对等鞭金藻的脂肪酸的影响作了研究，发现等边金藻DHA占总脂肪酸的比例随FE3浓度增加而升高，PUFA占总脂肪酸的比例随着FE3浓度增加先上升后下降。吴瑞珊等26在FE2对眼点拟微球藻的脂肪酸组成
28、的影响实验中发现，随着FE2浓度的升高，细胞中主要的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例有所降低,而多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例则有较大的提高。另外，在一定范围内003MMOL/L，FE2浓度的升高则会促使细胞内积累EPA。在培养基中，FE2在空气中极易被氧化成FE3形成胶体态和颗粒态铁。真核微藻细胞膜上具有铁还原酶，可以将环境中的FE3还原成FE2加以吸收利用。像等边金藻在天然海水（铁浓度为05MOL/L）条件下，DHA和PUFA含量很低，可能是由于缺乏足够的FE3，使等边金藻可利用的FE2减少，从而影响了DHA和其他不饱和脂肪酸的合成25。8总结环境因子的变化对海洋微藻脂类的积累会
29、产生很大的影响。不同种藻在某种环境因子的改变下对其脂类影响可能不同。通过微藻在不同环境因子的作用下脂类积累的研究，可以科学确定出脂类、能源积累的最适条件，从而为微藻的生物活性物质提取以及能源开发提供理论依据。参考文献1蒋霞敏,郑亦周14种微藻总脂含量和脂肪酸组成研究J水生生物学报,2003,032432462魏东,张学成微藻脂肪酸去饱和酶及其基因表达的生态调控研究新进展J海洋科学,2000,240842463魏东,张学成,邹立红,徐年军细胞生长时期对两种海洋微藻总脂含量和脂肪酸组成的影响J青岛海洋大学学报,2000,3035035094EIZADORATYU,FRANKJZENDEJAS,PA
30、MELADLANE,ETALTRIACYLGLYCEROLACCUMULATIONANDPROFILINGINTHEMODELDIATOMSTHALASSIOSIRAPSEUDONANAANDPHAEODACTYLUMTRICORNUTUMBACCILARIOPHYCEAEDURINGSTARVATIONJJAPPLPHYCOL,2009,216696815蒋汉明,高坤山氮源及其浓度对三角褐指藻生长和脂肪酸组成的影响J水生生物学报,2004,2855455516王菊芳,梁世中,吴振强碳氮比对隐甲藻CRYPTHECODINIUMCOHNII总脂及DHA含量的影响J华南理工大学学报,2000,28
31、1028317梁英,麦康森,孙世春硝酸钠浓度对2株三角褐指藻生长及脂肪酸组成的影响J黄渤海海洋,2001,19456628梁英,麦康森,孙世春等硝酸钠浓度对三角褐指藻PHAEODACTYLUMTRICORNUTUMMACC/B226生长及脂肪酸组成的影响J海洋科学,2002,6548519魏东,张学成,隋正红等氮源和N/P对眼点拟微球藻的生长、总脂含量和脂肪酸组成的影响J海洋科学,2000,724465110蒋冰飞,孙颖颖,王长海营养盐对球等鞭金藻生长和脂肪酸含量及组分的影响J海洋通报,2007,05566111YANGW,FENGFY,HOUHT,ETALALTERNATIONINLIPID
32、COMPOSITIONOFWHEATLEAVESINDUCEDBYPHOSPHATEDEFICIENCYISRELATEDTOBOTHLIPIDBIOSYNTHESISANDPHOSPHATIDYLGLYCEROLDEGRADATIONJACTABOTANICASINICA,2004,4621121512VANMOOYBA,ROCAPG,FREDRICKSHF,EVANSCT,DEVOLAHSULFOLIPIDSDRAMATICALLYDECREASEPHOSPHORUSDEMANDBYPICOCYANOBACTERIAINOLIGOTROPHICMARINEENVIRONMENTSJPROC
33、NATLACADSCIUSA,2006,1038607861213蒋霞敏温度、光照、氮含量对微绿球藻生长及脂肪酸组成的影响J海洋科学,2002,0891214代玉华,刘训言,孟庆伟,赵世杰低温胁迫对类囊体膜脂代谢的影响J植物学通报,2004,0450651115陈娜,郭尚敬,孟庆伟膜脂组成与植物抗冷性的关系及其分子生物学研究进展J生物技术通报,2005,26916谢玉英膜脂组成与植物抗寒性的关系J安徽农学通报,2007,1311383917MURATANMOLECULARSPECIESCOMPOSITIONOFPHOSPHATIDYLGLYCEROLSFROMCHILLINGSENSITIVE
34、ANDCHILLINGRESISTANTPLANTSJPLANTCELLPHYSIOL,1983,24818618侯旭光,姜英辉,李光友南极冰藻的总脂含量及脂肪酸组成与其低温适应性的关系J黄渤海海洋,2002,201475319曹春晖,孙世春,麦康森,梁英光照强度对四株海洋绿藻总脂含量和脂肪酸组成的影响J生态学报,2010,092347235320石娟,潘克厚不同光照条件对小新月菱形藻和等鞭金藻8701生长及生化成分的影响J中国水产科学,2004,11212112821李荷芳,周汉秋光照强度对海洋微藻脂肪含量及脂肪酸组成影响的研究J海洋科学集刊,2001,4317818322缪锦来,王波,阚光
35、锋,丁燏,姜英辉,侯旭光,李光友环境因子对2种南极绿藻脂肪含量和脂肪酸组成的影响J海洋科学,2005,0141023黄冠华,陈峰环境因子对异养小球藻脂肪酸组分含量和脂肪总酸产量的影响J可再生能源,2009,273656924蒋敏霞,柳敏海,邢晨光,等不同生长条件对绿色巴夫藻生长与脂肪酸组成的影响J水生生物学报,2007,311889325蒋汉明,翟静,张媛英,顾洪雁,高坤山等鞭金藻生长和脂肪酸组成随FE3浓度变化的研究J中国油脂,2005,308575926吴瑞珊,魏东FE对眼点拟微球藻的生长和脂肪酸组成的影响J海洋科学,2008,3279395本科毕业设计（20_届）小硅藻培养过程中脂类代谢
36、物的变化研究目录1引言12实验材料和方法221实验材料2211实验藻种2212培养基2213仪器和试剂222实验方法2221小硅藻的培养3222小硅藻细胞密度的测定3223脂类代谢物的提取3224色谱和质谱条件3225数据处理43实验结果531小硅藻生长周期试验的指纹识别532小硅藻生长周期代谢指标物的定性分析833小硅藻周期试验过程中脂类代谢指标物的变化114讨论115总结11致谢错误未定义书签。参考文献12摘要为了研究小硅藻（NITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMA）在培养过程中脂类代谢物的变化，利用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLCQTOFMS），电喷雾电离
37、源分别在正负离子模式下，对小硅藻对数期和稳定期的脂类代谢物进行测定，并通过SIMCAP软件进行主成分分析和正交偏最小二乘法辨别分析。结果表明，从对数生长期到稳定期，三酰甘油及溶血LYSODGDG、LYSOSQDG均呈现增加的趋势；而PC、MGDG、DGDG、SQDG、PG均呈现降低的趋势。这些脂类代谢物的变化，不仅可以用来判别微藻的脂类合成途径，而且可以科学确定出脂类、能源积累的阶段，从而为微藻的能源开发提供理论依据。关键词小硅藻；生长周期；脂类代谢物；四极杆飞行时间质谱；超高效液相色谱ABSTRACTTHEAIMOFTHISSTUDYWASTOINVESTIGATEHOWTHELIPIDME
38、TABOLITESCHANGEINNITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMADURINGTHEGROWTHPHASEITWASSTUDIEDBYTHEULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYQUADRUPOLETIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRYUPLCQTOFMSUSINGELECTRONSPRAYINGIONIZATIONWITHPOSITIVEANDNEGATIVEMODE,INANEFFORTTOFINDPOTENTIALMETABOLITEBIOMARKERSDURINGTHEGROWTHAFTERTHEUPLC
39、QTOFANALYSIS,PRINCIPALCOMPONENTSANALYSISPCAANDORTHOGONALPROJECTIONTOLATENTSTRUCTURESDISCRIMINANTANALYSISOPLSDAWEREPERFORMEDUSINGTHESIMCAPSOFTWAREFORMARKERSELECTIONANDIDENTIFICATIONACCORDINGTOTHEDATA,FROMTHEEXPONENTIALPHASETOSTATIONARYPHASE,TAG,LYSODGDGANDLYSOSQDGWERESHOWEDATRENDOFINCREASINGHOWEVER,P
40、C,MGDG,DGDG,SQDGANDPGWEREDECREASEDTHESECHANGESOFMETABOLITEBIOMARKERSWEREATTRIBUTEDTODETERMINETHELIPIDSYNTHESISPATHWAYOFMICROALGAEMOREOVER,ITCANBEUSEDTODETERMINETHEENERGYACCUMULATIONPHASESCIENTIFICALLYANDPROVIDETHETHEORETICALBASISOFENERGYDEVELOPMENTKEYWORDSNITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMAGROWTHPHASELI
41、PIDOMICSQUADRUPOLETIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRYULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY11引言海洋微藻是海洋生态系统中最重要的自养生物，也是最主要初级生产者，在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。海洋微藻作为优良的天然饵料被广泛应用于水产养殖，是海水仔鱼、虾蟹贝等水产经济动物幼体的主要食源，其产生的一些多不饱和脂肪酸（PUFA），特别是EPA，205（N3）和DHA，226（N3），其含量直接关系到仔鱼及幼体的存活和生长发育1。海洋微藻中的小硅藻（NITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTI
42、SSIMA），也称小新月菱形藻，在分类上属于硅藻门，细胞呈纺锤形。个体小、繁殖快、脂肪含量高，环境适应能力强。小硅藻还含有高度不饱和脂肪酸EPA，可作为理想的保健食品，也可以作为甲壳类、双壳类和仔鱼的饵料从而在海水养殖业中占有重要地位2。微藻的饵料价值与许多因素有关，包括细胞大小、细胞壁的可消化程度和细胞内的生化组成特别是脂类的组成和含量，尤以后者最为重要3,4。先前的研究认为不饱和脂肪酸的含量是影响微藻饵料价值的最主要因子，但脂类代谢物作为营养物质和供能物质，对养殖生物的生长发育同样起决定作用5。植物细胞体内含中性脂和极性脂，极性脂一般为海洋微藻的主要脂类，大部分为磷脂和糖脂；中性脂主要为三
43、酰基甘油，它作为脂肪酸的一种储存形式，在细胞分裂、能量代谢、维持膜的稳定性、生物合成及其他许多生理过程中起作用，为主要的储存脂类6,7。目前有研究结果表明，微藻不同生长阶段（对数期和稳定期），会造成细胞内总脂含量和脂肪酸组成的变化8,9。而海洋微藻的脂类含量和组成除了决定于藻种本身的遗传因素外10，还受其他环境条件，如温度11,12、光照13，盐度14等的影响。培养基的种类也会对微藻的脂肪酸组成产生影响15，特别是培养液中氮源的影响更为显著16。由于国内外学者关于环境因子对微藻脂类积累影响的研究主要集中在营养盐成分、光强、温度等因素上，而生长周期内脂类的积累，特别是极性脂积累变化的研究较少。因
44、此本文以小硅藻为研究对象，研究其生长周期不同阶段脂类代谢物的变化，从而科学确定出脂类、能源积累的阶段，为小硅藻的大规模培养和能源开发提供理论依据。2实验材料和方法21实验材料211实验藻种小硅藻（NITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMA），由宁波大学海洋生物工程重点实验室微藻室提供。212培养基小硅藻的培养使用F/2培养液。其基本配方见表1。213仪器和试剂ACQUITY超高效液相色谱系统，色谱柱ACQUITYUPLCBEHC8（17M，100MM21MM），QTOFPREMIER高分辨四极杆和飞行时间质谱仪，MASSLYNX41数据处理系统均为美国WATERS公司产品；
45、超纯水系统（法国MILLIPORE公司）；GXZ智能型光照培养箱（宁波江南仪器厂）；LDZX50FB高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；TDLSO2B飞鸽低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TP300超声波清洗机（北京泰拓公司）；漩涡混合器（上海精科实业公司）；WO系列恒温水浴锅、旋转蒸发器均为上海中顺生物科技公司产品；SHZD（）循环水式真空泵（义乌平华仪器公司）等。抗氧化剂2,6二特丁基对甲酚（BHT，999）；色谱纯氯仿、甲醇、乙腈、甲酸均为美国SIGMAALDRICH公司产品；纯水来源由超纯水系统制备。22实验方法221小硅藻的培养用于微藻培养的海水均经脱脂棉过滤、煮沸消毒，所有容
46、器均高温灭菌。培养器皿为3000ML三角烧瓶，培养3个平行样。往瓶中加入2000ML培养液（11000），200ML藻液，用纸盖好瓶口，用棉绳扎紧。培养条件是在光照培养箱中，明暗周期为12H12H；光照方式日光灯；光照强度约2500LX；温度为202。表1F/2培养液配方营养盐成分工作液（MG/L）母液（G/L）NANO37575NAH2PO4H2O55NA2SIO39H2O2020NA2EDTA436436FECL36H2O316316CUSO45H2O001001ZNSO47H2O00230023COCL26H2O00120012MNCL24H2O018018NA2MOO42H2O0070
47、07维生素B10110301103维生素B120510305103生物素0510305103222小硅藻细胞密度的测定每天振摇2次，每天定时取样一次，取500ML充分摇匀的藻液，加入12滴5（V/V）的福尔马林溶液固定，然后取一滴藻液置于血球计数板上，在光学显微镜下对藻细胞进行计数。每一批次做3个平行样，取其平均值，然后换算成相应的藻细胞密度（藻细胞密度藻数104个/CM3）。作培养时间（天）与藻细胞密度的关系图，得到小硅藻的生长曲线（图1）。223脂类代谢物的提取取不同生长阶段（对数期和稳定期）一定体积的藻液，40004800R/MIN离心10MIN，再用消毒淡水清洗23次，经冷冻干燥，放入
48、玻璃离心管中低温（4）保存。将干燥的藻泥采用氯仿甲醇（V/V，11）提取法得到藻中的脂类代谢物。通过旋转蒸发，干燥后充入氮气，于20贮存待用。所有溶液均加入BHT（50MG/L）。224色谱和质谱条件色谱条件流动相为85乙腈/甲醇（V/V，21）15异丙醇（V/V）溶液（A）和水（B），进样1L，流速025ML/MIN，柱后14分流进入质谱。流动相中加入01甲酸和005MOL/L的甲酸钠。采用梯度洗脱时洗脱梯度为B从在8MIN内从初始5升至70，在12MIN内从70升至90，在8MIN内从90升至95，保持14MIN，在1MIN升至100保持3MIN，最后在1MIN内降到5然后平衡11MIN。
49、质谱条件使用电喷雾电离源（ESI）进行分析，脱溶剂的氮气流速为400L/H，脱溶剂的温度为250，离子源的温度为120，锥孔反吹氮气为0。TOF离子飞行的方式为V模式，四极杆的扫描范围为501200。目标离子的精确质量数由外标物亮脑啡肽进行锁定。正离子模式下，毛细管电离电压30KV，负离子模式下，毛细管电离电压26KV；取样锥孔电压为3580V，碰撞室能量看分析目的不同采用560V不等。225数据处理原始数据由美国WATERS公司研发的MASSLYNX41数据处理系统采集，再通过MARKERLYNX管理系统进行处理，从而建立每一样品对应保留时间和质荷比的峰数量以及归一化的峰强度数据库，然后将这个数据库导入SIMCAP分析软件，对数据进行正交偏最小二乘法分析（OPLSDA）和主成分分析（PCA）。采用MASSFRAGMENT分析软件、HUMANMETABOLOMEDATABASE数据库检索等多种技术手段，对候选生物标记物进行结构解析。I020040060080010001200140013579111315171921232527天个/ML系列1II0200400600800100012001400160013579111315171921232527天个/ML系列1III02004
