1、本科毕业设计（20_届）地衣芽孢杆菌变异株发酵工艺研究所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I目录中英文摘要1引言111研究目的112研究意义113研究历史与现状1131蛋白酶特性研究1132地衣芽孢杆菌的应用1133地衣芽孢杆菌应用前景214拟解决的问题22材料和方法221菌种222主要试剂和仪器2221主要试剂2222主要仪器223培养基2231种子斜面培养基2232初始发酵培养基324培养方法和发酵条件3241种子培养方法3242发酵培养方法325菌体生长测定326蛋白酶活力测定327蛋白质浓度的测定33结果与讨论331酪氨酸和蛋白质标准曲线332发酵过程中参数测定
2、3321菌体生长情况4322PH值变化4323蛋白酶比活力433单因素实验4331碳源种类4332碳源量5333氮源种类5334氮源量6336初始PH值7337接种量734响应面分析法对发酵条件进行优化8341PLACKETTBURMAN设计法8342响应面法93421响应面实验设计93422多元二次回归拟合及方差分析93423验证实验104结论12致谢错误未定义书签。参考文献13摘要本实验对具有蛋白酶合成能力的地衣芽胞杆菌的发酵条件进行了优化。首先采用PLACKETTBURMAN实验设计对影响蛋白酶合成能力的发酵条件进行筛选。运用单因素实验和3因素2水平响应面分析方法对其培养基进行改进，对地
3、衣芽孢杆菌发酵条件进行优化以得到最优的碳源种类、碳源量、氮源种类、氮源量、金属离子、初始PH、接种量。然后将筛选得到的3个关键影响因素进行响应面分析，通过对二次多项回归方程求解得到该菌的最佳培养条件。3种因素对地衣芽孢杆菌发酵影响的显著性顺序为初始PH浒苔NAH2PO4，培养基的最佳条件为初始PH666，浒苔465，NAH2PO400274。蛋白酶比活力的最大预测值为663547U/G蛋白，实验验证值为6696637U/G蛋白。试验得出了地衣芽胞杆菌发酵培养基的最佳配比及最佳培养条件，在此条件下培养，收获菌体量大大提高，降低了生产成本，更有利于其大规模工业化生产。关键词地衣芽孢杆菌；蛋白酶；发
4、酵条件；响应面法ABSTRACTTHISEXPERIMENTSTUDIEDTHEOPTIMIZATIONOFFERMENTATIONCONDITIONSOFBACILLUSLICHENIFORMISFORTHEBIOSYNTHESISOFPROTEASESTHEEFFECTSONTHEACTIVITYWERENOTEDWITHPLACKETTBURMANDESIGN,ANDTHEEXPERIMENTINTHEMEDIUMIMPROVEMENTFORBACILLUSLICHENIFORMISWASDONEWITHTHESINGLEFACTORORTHOGONALTESTWITH3FACTORSA
5、ND2LEVELSFORCARBONSOURCE,NITROGENSOURCE,CARBONCONCENTRATION,NITROGENCONCENTRATION,METALIONS,INITIALPHANDINOCULATIONAMOUNTITTHENREVEALEDWITHTHEMETHODOFRESPONSESURFACEMETHODOLOGYRSMTHEORDEROFTHREEKINDSOFFACTORSSIGNIFICANTLYIMPACTINGTHEFERMENTATIONOFBACILLUSLICHENIFORMISWASASFOLLOWSINITIALPHENTEROMORPH
6、APROLIFERNAH2PO4,ANDINITIALPH666,ENTEROMORPHAPROLIFER465,NAH2PO400274AREOPTIMUMFORTHEACTIVITYOFPROTEASES,WITHAPREDICTEDACTIVITY663547U/GPR,ANDTHEEXPERIMENTALPROTEASESACTIVITY6696637U/GPRTHEBESTBACILLUSLICHENIFORMISFERMENTATIONMEDIUMANDCULTURECONDITIONWEREOBTAINED,UNDERTHECONDITION,THEHARVESTEDBIOMAS
7、SWASGREATLYIMPROVEDANDTHEPRODUCTIONCOSTWASREDUCED,WHICHWASMORECONDUCIVETOITSLARGESCALEINDUSTRIALPRODUCTIONKEYWORDSBACILLUSLICHENIFORMISPROTEASESFERMENTATIONCONDITIONSRESPONSESURFACEMETHODOLOGY11引言11研究目的对一株从海地瓜中分离得到的地衣芽胞杆菌变异株发酵工艺进行研究。研究其产碱性蛋白酶、纤维素酶的最佳培养基配方和最优培养条件。并对其进行诱变处理，筛选出高产菌株。12研究意义在工业用酶当中，蛋白酶是用
8、量最大、应用最广的一种，约占整个酶制剂产量的60以上，广泛应用于食品、饲料、制革、医药、银回收、纺织、化学工艺、废物处理和洗涤等领域1，如添加到动物饲料中以提高饲料利用率；用于制作海鲜调味品；用于CGM玉米渣的水解，以制取玉米肽饮料；水解大豆蛋白生产大豆多肽等。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点。食品生产用蛋白酶分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶，其中微生物具有资源广泛、生长繁殖快和培养方法简单等优点，所以，采用发酵工程技术生产蛋白酶，原料便宜，不受土地和季节的限制，是生产蛋白酶的优良方法2。纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质资源。据报
9、道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达155109吨,其中89尚未被人类利用。纤维素可通过纤维素酶的作用降解为葡萄糖，后者可作为重要的工业原料生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重要意义。13研究历史与现状131蛋白酶特性研究按最适PH分，蛋白酶可分为碱性、中性和酸性蛋白酶。碱性蛋白酶的最适PH一般大于90。碱性蛋白酶主要存在于细菌、放线菌和真菌中。目前，商业中应用的碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌。碱性蛋白酶的分子量范围大多数集中在1835KDA，少数碱性蛋白酶的分子量例外，达到45或82KDA，也有少数碱性蛋白酶分子量很小，甚至达到8
10、KDA。大部分碱性蛋白酶的最适PH值为911，如BACILLUSSP产碱性蛋白酶最适合PH为1011。金属离子对酶活性也有很多影响。二价金属离子如CA2、MG2、MN2等能提高碱性蛋白酶的活力，此外CA2能增强绝大多数蛋白酶的稳定性3。研究认为，特定的CA2结合位点还影响到蛋白酶的活性及稳定性，可以保护这些酶热变性并且K在高温情况下保护其防止构象改变。二价金属离子对酶活有促进作用，MN2，FE2，ZN2，MG2，CO2能显著促进BACILLUSSUBTILIS分泌的蛋白酶的活力4。蛋白酶的特异性受到切开点两侧氨基酸残基，尤其是羧基端第一位氨基酸的影响。也有研究发现，羧基端第二位到第四位以及酶切
11、位点氨基端第一位氨基酸对碱性蛋白酶切位点也有影响。如NESTERENKONIASPAL20分泌的碱性蛋白酶羧基端第二位位点偏好VAL，PRO等中性氨基酸5。碱性蛋白酶的最适温度分布范围较广，例如分离自嗜碱芽孢杆菌BACILLUSSPB18的蛋白酶最适温度达到85，而来自深海的嗜低温菌PSEUDOMONASTRAINDYA分泌的冷活性蛋白酶最适温度为40。芽孢杆菌BACILLUSSP是一类需氧或兼性厌氧G目前也发现有G，在一定条件下能产生抗逆性内生孢子的化能异养菌。在自然界分布非常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。能够产生多种抗生素，包括肽类、脂肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸
12、类、核酸类物质，对多种病原菌起到很好的抑制作用。132地衣芽孢杆菌的应用芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，因此，芽孢杆菌被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。地衣芽孢杆菌BACILLUSLICHENIFORMIS是芽孢杆菌中较具应用潜力的2菌种之一。近年来，国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。在发酵产酶、医药、饲料加工6、分子生物技术等行业，取得了较好的研究成果。根据文献显示，关于地衣芽孢杆菌的专利有用地衣芽孢杆菌生产生物农药的方法7；地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂；地衣芽孢杆菌T1菌株的构建及其粗酶提取物的发酵生产；污水和有机物无害化处理；
13、地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶对玉米的改性作用；地衣芽孢杆菌对鱼类消化功能的影响；地衣芽孢杆菌对养殖水体残余饵料的降解特性；地衣芽孢杆菌产生的杆菌肽，是一种强杀菌剂8，可以用于食品保鲜；用于食品加工的蛋白酶可以由多种菌种生产，其中，地衣芽孢杆菌在蛋白酶生产中的应用较为广泛。133地衣芽孢杆菌应用前景地衣芽孢杆菌在医药上的研究已经形成较完整的生产工艺，例如其医药商品整肠生的应用比较成熟。在农作物病害防治、饲料加工、环境污染治理等方面的研究，处于刚起步阶段，发展空间较为广阔；把分子生物技术应用于地衣芽孢杆菌的研究，也是一大热点。据文献报道，目前对基因的认识比较有限，其基因克隆也很少。所克隆的基因主要是一
14、切酶基因，其他基因的克隆就很少了，克隆抗菌物质基因，应用于抗病育种，将成为防治植物的一条更加有效的途径；开发地衣芽孢杆菌应用于新型领域的研究，地衣芽孢杆菌可抑制部分与皮革制品发霉有关的真菌9，作为皮革防霉剂，这一领域也为我们应用地衣芽孢杆菌的研究扩展了空间10。14拟解决的问题通过对地衣芽胞杆菌发酵工艺的研究得出地衣芽胞杆菌产碱性蛋白酶和纤维素酶的最佳培养基配方和优发酵条件。POTUMARTHI,R等用地衣芽孢杆菌进行深层发酵产碱性蛋白酶，通过对通气量和搅拌速度研究，在通气量为3VVM，搅拌速度为200RPM时，发酵72H，碱性蛋白酶的含量最高，为102U/MG11。马永强等对地衣芽孢杆菌27
15、09发酵生产高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵条件进行研究，以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标，对产酶条件进行优化12，从而得到了最佳碳源、碳源量、氮源、氮源量、PH值、接种量和金属离子。本研究从经过60CO照射的东海香参水解液中分离得到一株具有高效降解蛋白的地衣芽孢杆菌，运用响应面方法对其蛋白酶发酵培养基和发酵条件进行优化。2材料和方法21菌种地衣芽孢杆菌，本实验室从经过60CO照射的东海香参水解液中分离、纯化。22主要试剂和仪器221主要试剂FOLIN酚试剂，SIGMA公司；牛白蛋白，国药集团化学试剂有限公司；干酪素，北京市海淀区微生物培养基制品厂；其他试剂均为AR级。222主要仪器T
16、6新锐可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PH计，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；LDZX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DXY恒温调速回转式摇床，上海杜科自动化设备有限公司；高速冷冻离心机，HERAEUS有限公司。23培养基231种子斜面培养基3蛋白胨10G/L、牛肉膏3G/L、NACL5G/L、琼脂粉20G/L、自然PH。种子液体培养基中不加琼脂。232初始发酵培养基13（）蔗糖75、酪蛋白30、NACL05、K2HPO43H2O053、NA2CO32H2O003、NA2CO30056、MNSO40002、自然PH。24培养方法和发酵条件241种子培养
17、方法将地衣芽孢杆菌从保存的斜面转接于新鲜试管斜面，37培养12H。取培养好的斜面，用接种环挑一环接种于盛有50ML无菌种子培养基的250ML三角瓶中，然后置于恒温调速回转式摇床中37培养12H，转速为160R/MIN。242发酵培养方法分别取种子液，超净工作台上接入盛有50ML无菌种子培养基的250ML三角瓶中，接种量为6，置恒温调速回转式摇床中37、120R/MIN，发酵培养36H。25菌体生长测定取1ML发酵液稀释80倍，560NM处测光密度值。26蛋白酶活力测定采用福林FOLIN试剂显色法，参考SB/T10317199914。缓冲液是01MOL/L，PH1057的NA2CO3NAHCO3
18、缓冲液。反应温度为40。蛋白酶活力单位的定义每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。蛋白酶比活力（U/G蛋白）蛋白酶活力（U/ML）/水溶性蛋白量（G/ML）27蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝法，参见文献15。考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465NM；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595NM，而且消光系数更大，在一定蛋白质浓度范围内（11000G/ML，蛋白质染料复合物在595NM处的光吸收与蛋白质含量成正比。蛋白质含量（G/G鲜重）A（G）提取液总体积（ML）/测
19、定所取提取液体积（ML）样品鲜重（G）A标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为G3结果与讨论31酪氨酸和蛋白质标准曲线Y00073X00155R20997200102030405060708020406080100酪氨酸含量吸光值AY00139X00046R209978001020304050607080102030405060蛋白含量（）吸光值（A）32发酵过程中参数测定4在发酵过程中，每隔6H取样，测定OD560NM、PH值和蛋白酶比活力，结果如图1。020004000600080001000012000140001600018000200000612182430364248546066时间H
20、蛋白酶比活力（U/G蛋白）0123456789吸光值30、PH值蛋白酶比活力细菌吸光值PH值图1蛋白酶发酵动力学曲线FIG1KINETICCURVESDURINGFERMENTAIONPRODUCTIONOFPROTEASE321菌体生长情况种子接种于发酵瓶中6H后进入对数期，30H后进入稳定期，36H后进入衰亡期，细胞衰亡自溶。322PH值变化起始12H，PH值急剧下降到62，之后慢慢回升到67左右，到36H后PH值又开始下降。323蛋白酶比活力起始6H，不产蛋白酶，到24H后，大量产酶，36H达到最大值，之后随着细胞自溶，PH值下降，酶活力急剧下降。33单因素实验331碳源种类在基础培养基
21、中分别添加浓度为75的不同碳源，碳源有麦芽糖、蔗糖、环糊精、葡萄糖、可溶性淀粉、浒苔，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力，结果如图2。5076411815270115009168908113292994026944050001000015000200002500030000350004000045000麦芽糖蔗糖环糊精葡萄糖可溶性淀粉浒苔蛋白酶比活力（U/G蛋白）图2不同的碳源对酶活力的影响FIG2THEEFFECTSOFCARBONSOURCESONPROTEASEACTIVITYPRODUCEDBYBACILLUSLICHENIFORMIS5结果显示，地衣芽胞杆菌对碳源的利用广泛，其中浒苔较其
22、它碳源更有利于地衣芽胞杆菌产蛋白酶，蛋白酶比活力达到4026944U/G，其次蛋白酶比活力由大到小依次是蔗糖、可溶性淀粉、环糊精、葡萄糖、麦芽糖。可能是浒苔作为一种混合型碳源对蛋白酶的合成有诱导作用。332碳源量在基础培养基中分别添加不同浓度（25、35、45、55、65、75、85、95）的浒苔作为碳源，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力，结果如图3。01000020000300004000050000600002535455565758595碳源含量（）蛋白酶比活力（U/G蛋白）图3不同浓度的碳源对酶活力的影响FIG3EFFECTSOFCARBONADDITIONAMOUNTONPROTEAS
23、EACTIVITYPRODUCEDBYBACILLUSLICHENIFORMIS结果显示，随着碳源量增加，酶活力先增大，随后减小，当浒苔添加量为45时，蛋白酶比活力最高，可达54000U/G。333氮源种类在基础培养基中分别添加浓度为3的不同氮源干酪素、牛肉膏、酵母浸膏、大豆蛋白、明胶、尿素、硝酸铵、蛋白胨，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力，结果如图4。360441819648362460343968839535000100002000030000400005000060000干酪素牛肉膏酵母浸膏大豆蛋白明胶尿素硝酸铵蛋白胨蛋白酶比活力（U/G蛋白）图4不同的氮源对酶活力的影响FIG4THEEF
24、FECTSOFNITROGENSOURCESONPROTEASEACTIVITYPRODUCEDBYBACILLUSLICHENIFORMIS结果显示，添加酵母浸膏的培养基中蛋白酶比活力最高，可达48362U/G,其次是大豆分离蛋白、明胶和6尿素，分别达到46034U/G、39688U/G、39535U/G，添加硝酸铵和蛋白胨的培养基蛋白酶比活力为0。这表明，酵母浸膏等有机氮有利于地衣芽胞杆菌产蛋白酶。334氮源量在基础培养基中分别添加不同浓度（1、2、3、4、5、6、7、8）的酵母浸膏作为氮源，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力，结果如图5。010000200003000040000500006
25、0000700000123456789酵母膏含量蛋白酶比活力U/G蛋白图5不同浓度的氮源对酶活力的影响FIG5EFFECTSOFNITROGENADDITIONAMOUNTONPROTEASEACTIVITYPRODUCEDBYBACILLUSLICHENIFORMIS结果显示，随着酵母浸膏含量的增加，蛋白酶比活力先增大后减少，当酵母浸膏添加量为4时，产酶效果最好，蛋白酶比活力达最大值60000U/G。335金属离子在基础培养基中分别添加浓度为0002的不同微量金属元素，培养后紫外分光光度计在660NM条件下测定发酵液的蛋白酶比活力，结果如图6。856122693202144119846734
26、37941481744983355661453000100002000030000400005000060000MG2FE2CA2MN2SN2CU2BA2LIFE3ZN2蛋白酶比活力（U/G蛋白）图6不同的金属离子对酶活力的影响FIG6THEEFFECTSOFMETALIONSONPROTEASEACTIVITYPRODUCEDBYBACILLUSLICHENIFORMIS结果显示，添加FE3的培养基中蛋白酶活力最强，蛋白酶比活力达到55661U/G，其次是LI和BA2，添7加MG2的培养基蛋白酶活力最低。这表明，FE3对地衣芽胞杆菌产蛋白酶有促进作用。336初始PH值调节培养基初始PH分别为
27、50、60、70、80、90、100、110和120，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力，结果如图7。01000020000300004000050000600007000045678910111213PH值蛋白酶比活力U/G蛋白图7初始PH对酶活力的影响FIG7THEEFFECTSOFORIGINALPHOFCULTUREONPROTEASEACTIVITYPRODUCEDBYBACILLUSLICHENIFORMIS结果显示，当培养基的PH在7附近时蛋白酶活力最高，蛋白酶比活力达到60000U/G，PH增大酶活力逐渐减低,说明在中性培养基条件下地衣芽孢杆菌产蛋白酶活力较高。337接种量分别按照
28、2、4、6、8、10、12、14和16的添加水平，接种培养12H的种子培养基于发酵培养基中，测定发酵液蛋白酶比活力，结果如图8。010000200003000040000500006000070000024681012141618接种量（）蛋白酶比活力（U/G蛋白）图8接种量对酶活力的影响FIG8THEEFFECTSOFINOCULATIONSIZEONPROTEASEACTIVITYPRODUCEDBYBACILLUSLICHENIFORMIS结果显示，接种量在12时蛋白酶比活力最大，之前随着接种量的增大，酶比活力呈现上升趋势。之后呈现下降趋势，可能是因为接种量增大，菌体进入对数期的时间比较
29、早培养基中的菌体过多，导致营养8成分不能满足菌体正常生长代谢，从而影响菌体产蛋白酶能力。34响应面分析法对发酵条件进行优化341PLACKETTBURMAN设计法该实验设计是一种两水平实验设计方法，它可以利用最少的实验次数，从众多的考察因素中快速有效地筛选出主要的影响因素，因此广泛地用于因素主效应的估计16。根据前期实验，本阶段选用实验次数为12的实验设计，分别对浒苔（A）、酵母膏（B）、K2HPO4（C）、NA2CO3（D）、FECL3（E）、NAH2PO4（F）、起始PH（G）、接种量（H）8个因素进行考察，每个因素分别取高低两个水平，评价指标响应值为蛋白酶比活力，PLACKETTBURM
30、AN实验设计见表1。表1PLACKETTBURMAN实验设计因素水平及编码TAB1FACTORSLEVELSANDCODINGOFPLACKETTBURMANDESIGN因素代号编码11浒苔A3570酵母膏B3060K2HPO4C0510NA2CO3D00501FECL3E001002NAH2PO4F003006起始PHG7090接种量H612表2PLACKETTBURMAN试验设计与响应值表（N8）TAB2DESIGNINPLACKETTBURMANASSAYWITHPROTEASEACTIVITYASRESPONSEN8序号ABCDEFGH酶活（U/G蛋白）1111111117108318
31、2111111118719103111111113468962411111111164782051111111153328576111111112023791711111111453793581111111163656559111111114422731011111111100409011111111114020080121111111121581459表3回归方程显著性检验TAB3SIGNIFICANCETESTOFREGRESSION实验因素自由度参数估计F值PROBF显著性浒苔1107538428435614000272酵母膏1341808638522273006157K2HPO4172
32、5124193835431000854NA2CO31363093680096167077688FECL31671333693287504001055NAH2PO41946762416538399000403初始PH110830388556119000271接种量1477733481664795002666采用DESIGNEXPERT软件对PLACKETTBURMAN实验进行设计并对其结果表2进行方差分析。分析结果见表3，从表3可以看出，影响蛋白酶比活力的发酵条件的重要性排序为初始PH浒NAH2PO4K2HPO4FECL3接种量酵母膏NA2CO3。其中，初始PH、浒苔和NAH2PO4对蛋白酶比活
33、力的影响最为显著。因此，选取初始PH、浒苔和NAH2PO4这三个关键因素进一步作响应面分析，以确定它们所对应的最优水平。K2HPO4、FECL3、接种量、酵母膏和NA2CO3的确定根据单因素实验和节约成本的原则，将其水平控制在较好水平上进行实验。342响应面法3421响应面实验设计该方法可以通过建立连续变量曲面模型，对影响实验过程中的因素水平及其交互作用进行优化与评价，该法已广泛应用于各种过程的优化分析中17。本实验在PLACKETTBURMAN研究基础上采用BOXBEHNKEN响应面设计法，对发酵过程中影响蛋白酶比活力的关键因素初始PH、浒苔和NAH2PO4作进一步研究和探讨，以获得其最佳水
34、平范围。BOXBEHNKEN实验设计见表4。表4BOXBEHNKEN响应面设计实验因素水平和编码TAB4FACTORSLEVELSANDCODINGOFBOXBEHNKENRSM关键影响因素编码代号编码水平101初始PHA579浒苔B354555NAH2PO4C0010030053422多元二次回归拟合及方差分析采用DESIGNEXPERT软件对BOXBEHNKEN响应面实验结果表5进行方差分析，分析所得到的拟合全变量二次回归方程各变量的方差分析结果见表6，由表6可知，决定系数R209916，PR00001005，说明回归10方程的拟合程度较好，其全变量二次同归方程为Y653986255864
35、2A429921B263990C246242AB88903AC79916BC1476039A21371532B2892427C2该方程表达了蛋白酶比活力与所选的3个自变量之间的线性关系是显著的，即这种实验验方法是可靠的。回归方程的一次项和平方项系数都较大，说明响应值与实验因子之间的关系并不是简单的线性关系；而交互项系数较小，说明响应面分析所选3个因素之间的交互效应较小。变量的正系数表明该变量的正向变化可引起响应值的增加；负的二次项的系数表明方程的抛物面开口向下，具有极大值点，能够进行最优分析。采用DESIGNEXPERT软件对数据进行分析得到响应面三维图见图911。对二次回归方程求解，当响应值
36、Y最大时各因子的水平为A017、B014、C013，转换后得最佳培养条件为PH666，浒苔465，NAH2PO400274，理论预测蛋白酶比活力为663547U/G蛋白。3423验证实验为检验RSA法的可靠性，按照最佳提取条件进行实验验证，重复6次，实际测得的蛋白酶比活力为6696637U/G蛋白，与模型理论预测值相比相对误差在09左右。因此，采用RSA法优化得到的浸提条件参数准确可靠，具有实用价值。表5响应面实验设计与结果TAB5DESIGNANDRESULTSOFBOXBEHNKENTEST编号PH（A）浒苔BNAH2PO4C蛋白酶比活力（U/G蛋白）1110488672521101761
37、2363110507521541103806156510156433866101403465771015176086810132323539011415872410011482454411011356743012011455291413000651622214000718098115000589488911表6各因素方差分析表TAB6VARIANCEANALYSISOFFACTORS来源自由度平方和均方F值P值模型9205109228108657252900001A1250108250108719400004B1148108148108426100013C1558107558107160700
38、102AB124310724310769900458AC131610731610609103837BC125510725510607404301A218041088041082318100001B216951086951082001500001C21294108294108847400003残差5174107347106失拟项324410681410501109472纯误差2149107745106总和14207109R209916图9YFA,B的响应面和等高线图FIG9RESPONSESURFACEPLOTANDCONTOURPLOTFORYFA,B12图10YFA,C的响应面和等高线图FI
39、G10RESPONSESURFACEPLOTANDCONTOURPLOTFORYFA,C图11YFB,C的响应面和等高线图FIG10RESPONSESURFACEPLOTANDCONTOURPLOTFORYFB,C4结论本实验在单因素实验的基础上，采用PLACKETTBURMAN设计方法，对浒苔（A）、酵母膏（B）、K2HPO4（C）、NA2CO3（D）、FECL3（E）、NAH2PO4（F）、起始PH（G）、接种量（H）8个因素进行考察，分析得起始PH、浒苔、NAH2PO4为三个主要影响因素。并在PLACKETTBURMAN基础上采用BOXBEHNKEN响应面设计方法对地衣芽胞杆菌产蛋白酶发
40、酵条件进行优化，拟合出三元二次多项式方程，筛选到培养基中起始PH、浒苔、NAH2PO4的最佳配方，即PH666，浒苔465，NAH2PO400274，在此条件下，发酵得到的蛋白酶比活力为6696637U/G蛋白，比原基础培养基培养的提高了268，取得了显著的效果。13参考文献1荆谷，冯静，孔健，等微生物金属蛋白酶研究进展J生物工程进展，2002，22161632王吉庄，钟芳，王璋高水解度大豆肽的制备J食品工业科技，2003，24940423HADJALINE,AGREBIR,GHORBELFRIKHAB,ETA1BIOCHEMICALANDMOLECULARCHARACTERIZATIONOF
41、ADETERGENTSTABLEALKALINESERINEPROTEASEFROMANEWLYISOLATEDBACILLUSLIEHENIFONNISNHLJENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,2007,405155234PANT,LINSJFERMENTATIVEPRODUCTIONOFALKALINEPROTEASEASDETERGENTADDITIVEJCHINESEBIOCHEMSOC,1991,2049605BAKHTIARS,ESTIVEIRARJ,HATTIKAULRSUBSTRATESPECIFICITYOFALKALINEPROTEASEFROMAL
42、KALIPHILICFEATHERDEGRADINGNESTERENKONIASPAL20JENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,200537555345406蔡雁，郝勃，喻子牛抗动物病原菌芽孢杆菌的筛选、初步鉴定和抗菌活性J微生物学杂志，200525519227唐丽娟，纪兆林，徐敬友，等地衣芽孢杆菌W10对灰葡萄孢的抑制作用及其抗菌物质J中国生物防治，2005，2132032058JOHNSONBA,ANKERH,MELENEYFLANEWANTIBIOTICREDUCEDBYAMEMBEROFTHEBSUBTILISGROUPMSCI,1945,1023763779赵婷
43、，梁秀芝，刘成君皮革霉变真菌的分离鉴定及拮抗菌的筛选J中国皮革，2005，3423101310唐娟，张毅，李雷雷等；地衣芽孢杆菌应用研究进展；湖北农业科学；2008，3，35135411POTUMARTHIR,SUBHAKARCHALKALINEPROTEASEPRODUCTIONBYSUBMERGEDFERMENTATIONINSTIRREDTANKREACTORUSINGBACILLUSLICHENIFORMISNCIM2042EFFECTOFAERATIONANDAGITATIONREGIMESJBIOCHEMICALENGINEERINGJOURNAL,2007,3418519212马
44、永强，那治国，张娜，等地衣芽孢杆菌2709高去酰胺活性碱性蛋白酶发酵条件及酶学性质的研究J食品工业科技，2008，2910818513章海锋，阮晖，刘婧，等地衣芽孢杆菌ZJUEL31410产胞外弹性蛋白酶的分批发酵研究J中国食品学报，2009，9113013614SB/T103171999蛋白酶活力测定法15史锋生物化学实验杭州；浙江大学出版社，2002929316KAILSJ,FMAUGERI,RODRIGUESMIRESPONSESURFACEANALYSISANDSIMULATIONASATOOLFORBIOPROCESSDESIGNANDOPTIMIZATIONJPROCBIOCHEM
45、,2000,3553955017LIY,CUIFJ,LIUZQETA1IMPROVEMENTOFXYLANASEPRODUCTIONBYPENICILLIUMOXALICUMZH30USINGRESPONSESURFACEMETHODOLOGYJENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,2007,401381138815附录附录1文献综述地衣芽孢杆菌变异株产蛋白酶的研究张文杰（宁波大学生命科学与生物工程学院宁波315211）摘要地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌安全性高、生长快速、抗逆性强、有高效的产酶能力、在较高温度下仍可存活等特点而被人们所广泛应用。本文对国内外研究现状及展望进行了概
46、述。关键词地衣芽孢杆菌；蛋白酶；现状引言地衣芽孢杆菌BACILLUSLICHENIFORMIS属硬壁菌门（FIRMICUTES）、杆菌纲（BACILLI）、芽孢杆菌科（BACILLACEAE）、芽孢杆菌属（BACILLUS）。由于地衣芽孢杆菌安全性高、生长快速、抗逆性强、有高效的产酶能力、在较高温度下仍可存活等特点而被人们所广泛应用。在工业用酶当中，蛋白酶是用量最大、应用最广的一种，约占整个酶制剂产量的60以上，广泛应用于食品、饲料、纺织和洗涤等领域1。食品生产用蛋白酶分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶，其中微生物具有资源广泛、生长繁殖快和培养方法简单等优点，所以，采用发酵工程技术生产蛋
47、白酶，原料便宜，不受土地和季节的限制，是生产蛋白酶的优良方法2。用于食品加工的蛋白酶可以由多种菌种生产，其中，地衣芽孢杆菌在蛋白酶生产中的应用较为广泛。POTUMARTHI,R等用地衣芽孢杆菌进行深层发酵产碱性蛋白酶，通过对通气量和搅拌速度研究，在通气量为3VVM，搅拌速度为200RPM时，发酵72H，碱性蛋白酶的含量最高，为102U/MG3。马永强等对地衣芽孢杆菌2709发酵生产高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵条件进行研究，以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标，对产酶条件进行优化4。1研究现状近年来,国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。在发酵产酶、医药、饲料加工、农药等行业,
48、取得了较好的研究成果。根据文献显示,关于地衣芽孢杆菌的专利有用地衣芽孢杆菌生产生物农药的方法；地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂；地衣芽孢杆菌T1菌株的构建及其粗酶提取物的发酵生产；利用基因突变技术,改变地衣芽孢杆菌NCIB8061A淀粉酶的耐温性和耐酸性酶的性质等，因此对其在医药和产酶等功能方面的研究具有重大的意义。11地衣芽胞杆菌应用于发酵产酶研究111产碱性蛋白酶方海红等报道，分离到一株产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌011，并命名为地衣芽孢杆菌砀山亚种。该酶的最适作用条件为PH90，60。对该菌株进行连续4次不同的物理、化学方法的诱变处理。诱变剂为紫外线、亚硝酸、和低能N离子，处理方式为单独或
49、复合处理两种。最后获得一株高产碱性蛋白酶的变异株C3203菌株产酶活力从725U/ML提高到12425U/ML。该突变株的最适产酶条件为起始PH8090，培养温度3237，振荡培养时间4448H。16胡承等从成都佳丰食品厂等处采集的样品中平板分离初筛到124株碱性蛋白酶产生菌，进一步复筛出一株高产碱性蛋白酶产生菌株，初步鉴定为地衣芽抱杆菌。在最适产酶条件下，酶活力单位高达7180U/ML。赵良启等对地衣芽孢杆菌产生碱性蛋白酶的动力学进行了研究。证明了用MONOD方程描述地衣芽孢杆菌2709生长速率与基质浓度关系的合理性和合成碱性蛋白酶的发酵属于生长部分关联型。碱性蛋白酶活性受PH、金属离子、底物等的影响。碱性蛋白酶的最适PH一般大于90。二价金属离子如CA2、MG2、MN2等能提高碱性蛋白酶的活力，此外CA2能增强绝大多数蛋白酶的稳定性5蛋白酶的特异性受到切开点两侧氨基酸残基，尤其是羧基端第一位氨基酸的影响。112产纤维素酶燕红等研究一株地衣芽孢杆菌对稻草降解作用。研究发现，在发酵过程中地衣芽孢杆菌菌体产酶过程也就是木质纤维素的降解糖化过程。上清液中的纤维素酶活和半纤维素酶活分别在发酵进行到第12H和48H时达到最高峰。总糖含量于第4H达到最高值，然后下降到一定程度后保持
