1、本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素浓度的变化所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录1引言12材料和方法121材料122主要仪器设备与试剂123实验方法2231标准溶液的配制2232色谱和质谱条件UPLC条件3233标准曲线和检出限3234血淋巴蜕皮激素浓度的变化的测量33实验结果331检测获得的蜕皮激素浓度332数据分析结果44结论5致谢错误未定义书签。参考文献5附录错误未定义书签。2摘要甲壳动物Y器YORGAN分泌的蜕皮类固醇激素对其蜕皮过程起重要调控作用。利用高效液相色谱电喷雾串联质谱（LCMS/MS）法完成三疣梭子蟹蜕皮过程中血淋巴蜕皮激素浓
2、度变化的测定。随着蜕皮周期的运行基本处于逐渐升高的趋势，蜕皮后期A/B蜕皮激素的浓度较低，低于仪器检测限003NG/ML。进入蜕皮间期后，蜕皮激素的浓度开始逐渐恢复正常13930245NG/ML。进入蜕皮前期蜕皮激素浓度逐渐上升，D0，D1，D2其浓度分别为45470372NG/ML，64060438NG/ML和81350423NG/ML；而在蜕皮前期D3期达到最高峰200711327NG/ML，D4有所回落变为103130511NG/ML。该研究结果证实蜕皮类固醇激素对三疣梭子蟹蜕皮过程起重要调控作用。关键词三疣梭子蟹；蜕皮周期；蜕皮激素；LCMS/MSABSTRACTCRUSTACEANY
3、CONTROLYORGANSTEROIDHORMONESECRETEDBYTHEIRMOLTINGMOLTINGPROCESSPLAYSANIMPORTANTREGULATORYROLEHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYLCMS/MSMETHODTOCOMPLETETHEPROCESSOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSMOLTINGECDYSTEROIDHEMOLYMPHCONCENTRATIONDETERMINATIONWITHTHEMOLTCYCLE,RUNNINGBASICALLYATTHEI
4、NCREASINGTENDENCY,MOLTLATERA/BLOWCONCENTRATIONSOFECDYSONE,BELOWTHEINSTRUMENTDETECTIONLIMITOF003NG/MLINTOTHEINTERMOLTPERIOD,THECONCENTRATIONOFECDYSONEGRADUALLYRETURNEDTONORMAL13930245NG/MLINTOTHEPREMOLTECDYSTEROIDLEVELSINCREASEDGRADUALLY,D0,D1,D2CONCENTRATIONWERE45470372NG/ML,64060438NG/MLAND81350423
5、NG/MLEARLYINTHEMOLTINGD3ACHIEVETHEHIGHEST200711327NG/ML,D4FELLBACKINTO103130511NG/MLITPROVEDSTEROIDHORMONEPLAYSANIMPORTANTREGULATORYROLETOPORTUNUSTRITUBERCULATUSKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUS；MOULTINGCYCLE；ECDYSONE；LCMS/MS11引言三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）属节肢动物门（ARTHROPODS）、甲壳纲（CRUSTACEA）、十足目（DECAP
6、ODA）、梭子蟹科（PORTUNIDAE），分布于我国辽东半岛、山东半岛到广东、广西的各海区以及日本、朝鲜、马来西亚群岛等海域，是一种大型海产经济蟹类。作为重要的大型经济蟹类，三疣梭子蟹肉质鲜美，营养丰富，食用价值高，不仅是我国传统的名贵海鲜，也是一种重要的出口海产品。20世纪90年代中期开始，三疣梭子蟹的大规模育苗和养殖在我国逐渐推广，现今三疣梭子蟹已是世界上养殖规模最大的海洋经济蟹类之一。蜕皮激素是一种类固醇激素，它既存在于无脊椎动物（主要是节肢动物）中，也存在于植物中。甲壳动物蜕皮激素由Y器（又称为蜕皮腺，与昆虫的前胸腺为同功器官）合成、分泌1,2。目前国内已有人对甲壳动物蜕皮腺及蜕皮激
7、素做了一些研究，如叶海辉等1采用组织切片和电镜技术，对锯缘青蟹大颚器、Y器的形态结构进行了观察，以及陆剑峰、赵维信3对中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）Y器官在蜕皮周期中的超微结构，进而指出其对蜕皮过程的影响。目前尚无人研究三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）的蜕皮周期，作为中国沿海重要的经济蟹类，刚蜕完壳的软壳蟹的体积比蜕壳前增加了3040,其壳通过环境中的钙盐等不断硬化而恢复正常硬度，三疣梭子蟹的个体增长在外表上并不连续，而是呈阶梯形，每蜕一次皮，上一个台阶。由此可见，三疣梭子蟹的生长发育与蜕皮息息相关，促进蜕皮的发生，可促进其发育成熟，提高产量。了解
8、蜕皮发生的时间，周期的长短对促进沿海三疣梭子蟹养殖业的发展非常重要。节肢动物的蜕皮激素主要是指20羟基蜕皮酮（20E），有关研究多集中于它对人类和各种动物种类的促进生长作用方面。临床研究表明，20E可以很好地促进生物生理代谢,而且不产生副作用。但甲壳类蜕皮激素浓度达到200400MG/L时，会出现外皮加厚等中毒现象。因此，应关注蜕皮激素在甲壳动物中的含量变化，水产养殖过程中应保证生物体内蜕皮激素含量处于合适的范围内4。1953年GABE首次描述了58种软甲亚纲（MALACOSTRACA）种类的Y器，而切甲亚纲（ENTOMOSTRACA）种类没有Y器5。Y器分泌的蜕皮类固醇不具生物活性，只有进入
9、血淋巴，在外周组织20羟化酶的催化作用下才转化成具有生物活性的20羟蜕皮酮6。即是说Y器官产生A蜕皮酮，进入血液后转化为活性物质、实际的蜕皮激素是20羟蜕皮酮（蜕皮酮）。Y器官能从血液中吸收由食物中获得的胆固醇合成类固醇激素。脊椎动物类固醇激素在血液中通常是与携带蛋白结合在一起运输的，而在甲壳动物血液中还未发现与类固醇激素结合的蛋白，至少95的此类激素是自由运行的。研究表明，20羟蜕皮酮不仅参与甲壳动物的蜕皮活动和胚胎发育，而且参与了卵巢发育过程7。如日本沼虾（MACROBRACHIUMNIPPONENSE）、中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）、中国对虾（PENAEUSCHINE
10、NSIS）血淋巴中20羟蜕皮酮的周期性变化均与卵巢发育相关联810。蜕皮激素含量的多少，直接关系到虾蟹的存活和生长。含量太低，起不到促蜕皮、促生长作用；含量太高，会使虾蟹因蜕皮过频而缺乏正常生长所必需的营养，含量过高甚至还会引起虾蟹类中毒从而出现虾蟹大面积死亡11。因此，对虾蟹蜕皮促长素以及同类药物中蜕皮激素的含量进行测定显得尤为必要。本文利用高效液相色谱电喷雾串联质谱（LCMS/MS）法完成三疣梭子蟹蜕皮过程中血淋巴蜕皮激素浓度变化的测定，对所得数据进行统计分析，为海洋甲壳动物蜕皮等生长发育过程的生理学研究提供参考。2材料和方法21材料三疣梭子蟹自海中捕捞后在宁波宁海长街得水育苗场养殖池中暂
11、养，雌雄各半。体宽在911CM之间，体重在4565G之间，放养在相同条件的育苗池内，海水盐度、水温以及水体溶解氧浓度、喂食量等相同，并且保证池内的梭子蟹都能正常生长发育，从而减小因为不同环境条件而造成的误差。本实验用水为宁海县得水水产苗种场蟹苗池海水，该海水取自自然海区，经过几天的沉淀池暗沉淀和两次砂滤池过滤。海水进入育苗池后用增氧泵进行水体增氧，保证水体的溶解氧充足。实验样本均为未经过生殖蜕皮的三疣梭子蟹。22主要仪器设备与试剂OLYMPUSCX21FS1显微镜；2PPENDORFAG22331HAMBURY24500离心机；OPLENIC5818观测目镜；TSQQUANTUMACCESS液
12、相色谱一三重四极杆质谱联用仪（THERMOFINNIGAN公司），配有ESI源；超纯水系统（法国MILLIPORE公司）；20羟基蜕皮酮和高油菜素内酯标准品（纯度98，美国SIGMAALDRICH公司）；乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；纯水由超纯水系统制备；其他试剂均为国产分析纯，生物冰袋冰盒。23实验方法蜕皮的整个过程包括蜕去旧甲壳，个体由于吸水迅速增大，然后新甲壳形成并硬化。因此甲壳动物的个体增长在外形上并不连续，呈阶梯形，每蜕一次皮，上一个台阶。参照传统甲壳动物蜕皮阶段的划分，结合三疣梭子蟹类本身所独有的特点，以游泳足末节新旧表皮间距/旧表皮厚度的比值为主要依据，将三疣梭子蟹蜕皮周期
13、划分为蜕皮后期（A和B），蜕皮间期C，蜕皮前期（D0，D1，D2，D3和D4）以及蜕皮期（E）等四个阶段12。目前检测生物体内蜕皮激素的方法有薄层扫描法、放射免疫测定法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法等13,14。液相色谱法和薄层扫描法灵敏度较低，而放射化学法无法进行精确定性分析，并且三疣梭子蟹抗原抗体的的制备比较繁琐。虽然国际上有更好的高效液相色谱三重四级杆质谱分析方法等，但针对于三疣梭子蟹本方法液相色谱质谱分析方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，已经应用于哺乳动物及昆虫体内蜕皮激素的痕量检测14。LC/MS的联用始于70年代，90年代以来，由于大气压电离的成功应用以及质谱本身的发展，液相
14、色谱与质谱的联用，特别是与串联质谱（MSPMS）的联用得到了极大的重视和发展。LCMS/MS联用的优点非常显著，因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而液相色谱则把分离范围大大拓宽了，生物大分子也能分离，LC与高选择性、高灵敏度的MS/MS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在LC难分离的情况下，只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混和物中的目标化合物,显著提高信噪比15。本实验采用电喷雾电离ESI接口，图1为ESI示意图。溶液中样品流出毛细管喷口后，在雾化气N2和强电场36KV作用下，溶液迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发，电场增强,离子向液滴表面移动
15、并从表面挥发，产生单电荷或多电荷离子。通常小分子得MH或MH单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测量的是质P荷比M/Z，可测定的生物大分子的质量数高达几十万。ESI是很软的电离，可直接测定热不稳定的极性化合物，多电荷形成可分析蛋白质和DNA等生物大分子，调节离子源源内ID电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。图1电喷雾电离示意图FIG1SCHEMATICDIAGRAMOFELECTROSPRAYIONIZATION231标准溶液的配制3准确称取50MG20E标准品，以甲醇溶解并定容至10ML，配制成5G/L标准储备液，置4冰箱中保存。制作工作曲线时，用甲醇将此储备液稀释成不同浓度的
16、标准溶液,每份标准溶液中加入高油菜素内酯，使其含量达到100MG/L。图220羟基蜕皮酮A和高油菜素内酯B的结构式FIG2STRUCTURESOF20HYDROXYECDYSONEAAND22S,23SHOMOBRASSINOLIDEB232色谱和质谱条件UPLC条件HYPERSILGOLDC18色谱柱100MM21MM17MM，美国THERMOFISHERSCIENTIFIC公司，进样量10M，柱温40，流动相为05乙酸A和乙腈B，流速02ML/MIN。梯度洗脱08MIN，10100B；810MIN，100B；1012MIN，10010B；1216MIN，10B。QTOFMS条件采用电喷雾电
17、离源负离子电离模式，毛细管电离电压23KV，取样锥孔电压25V，离子源温度100，脱溶剂温度250，脱溶剂氮气流速400L/H，锥孔反吹氮气。四极杆扫描范围M/Z2001000，碰撞室能量4V，TOF离子飞行方式采用V模式。分别提取M/Z4072和4372作为皮质醇和地塞米松定量目标离子，使用亮脑啡肽（M/Z5542615）作为外标物对目标离子进行精确质量锁定。QQQMS条件采用电喷雾电离源负离子电离模式，离子化条件与QTOFMS条件同。采用MRM多反应监测方式，皮质醇定量离子对M/Z4072/3314，碰撞能量L8V，定性辅助离子对M/Z4072/3615，碰撞能量L2V；地塞米松定量离子对
18、M/Z4372/3615，碰撞能量L8V。各离子对驻留时间均为200MS14。233标准曲线和检出限分别配制含1，5，10，20和50MG/L20E及100MG/L高油菜素内酯的混合标准溶液,采用上述质朴条件进行LCMS分析。在050MG/L范围内线性方程式为Y08013X01768，相关系数R209978。由于甲壳动物蜕皮激素含量通常很低,均在相应的线性范围内，故采用此标准曲线对三疣梭子蟹血淋巴中的蜕皮激素进行定量分析。对10ML02MG/L20E标准样品进行分析，测得20EM/Z4812定量特征碎片离子M/Z4452的信噪比S/N18。将对应S/N3的标准样品量作为检出限,可算出本方法20
19、E的检出限为003MG/L3。234血淋巴蜕皮激素浓度的变化的测量分别从蟹的游泳足基部抽取300L血淋巴，加入含有1200L乙腈和20L100NG/ML内标物高油菜素内酯的15ML离心管内，轻微涡旋震荡，8500R/MIN高速离心15MIN。而后吸取上清液1ML（勿将底部蛋白吸入）于灭菌15ML离心管中，做好标记冰箱下层20保存，在一个星期之内送回宁波大学，而后将上清液旋转蒸发，用02ML纯甲醇复溶，进行液质分析。根据样品中20羟基蜕皮酮（20E）特征离子响应强度与内标物高油菜素内酯的特征离子响应强度比值，用加入内标的工作曲线法求得样品中20羟基蜕皮酮的含量。3实验结果31检测获得的蜕皮激素浓
20、度4根据仪器测得的蜕皮激素峰面积和内标峰面积的比值，以及建立方法时获得的标准曲线的方程，计算获得各个样品中蜕皮激素的浓度（单位NG/ML）结果见下表表1蜕皮各阶段血淋巴中蜕皮激素浓度（单位NG/ML）TAB1ECDYSTEROIDSINTHEHEMOLYMPHOFINDIVIDUALCRABSUNITNG/ML整个蜕皮阶段蜕皮激素的变化趋势是比较明显的，随着蜕皮周期的运行基本处于逐渐升高的趋势，蜕皮后期A/B蜕皮激素的浓度较低，低于仪器检测限033PG。进入蜕皮间期后，蜕皮激素的浓度开始逐渐恢复正常13930245NG/ML。进入蜕皮前期蜕皮激素浓度逐渐上升，D0，D1，D2其浓度分别为454
21、70372NG/ML，64060438NG/ML和81350423NG/ML；而在蜕皮前期D3期达到最高峰200711327NG/ML，D4有所回落变为103130511NG/ML。32数据分析结果单因素方差分析组观测数求和平均方差标准差蜕皮后期A40000蜕皮后期B40000蜕皮间期C45572139300567590753386蜕皮前期D041818945472500676760260146蜕皮前期D142562564062501963030443061蜕皮前期D243253981347501620520402554蜕皮前期D34802842007113649511168311蜕皮前期D4
22、4412510312503386460581932方差分析差异源SSDFMSFPVALUEFCRIT组间1262488718035546599215755E262422629组内6559159240273298总计126904731蜕皮后期A（POSTMOLTA）蜕皮后期B（POSTMOLTB）蜕皮间期C（INTERMOLTC）蜕皮前D0（PREMOLTD0）蜕皮前D1（PREMOLTD1）蜕皮前D2（PREMOLTD2）蜕皮前D3（PREMOLTD3）蜕皮前D4（PREMOLTD4）样本1（SAMPLE1）0015564354688484362150911120样本2（SAMPLE2）001
23、638491958167872187449802样本3（SAMPLE3）0012044382651785192037610336样本4（SAMPLE4）001174453464087712196559992平均值（AVERAGE）0013934547640681352007110313标准差（STANDARDDEVIATION）000753402601044310402611683058195同一样本三疣梭子蟹不同蜕皮周期蜕皮激素浓度进行单因素方差分析，认为P005时存在显著性差异，P001时存在极显著差异。图3各样本蜕皮周期浓度变化FIG3CONCENTRATIONOFTHEMOLTCYCL
24、EOFTHESAMPLES如图3所示，蟹血淋巴中20E在蜕皮前期D3呈现一个峰值，这与该时期水温逐渐回升，促进蜕壳和加速生长有关，生长基本上呈直线上升，显示了这阶段的蟹快速生长无不与20E浓度水平升高有关。因此，为了提高蟹养殖产量，在提供蟹的饲料中添加一定量的20E2，使蜕壳频数增加，既能促进蟹生长，加大个体重量，增大上市规格，又能达到同步蜕皮的目的，减少非同步蜕壳而造成的相互残杀，减少死亡率，这为进一步开发餐养殖业提供了理论依据和新的资料。4结论三疣梭子蟹和其他甲壳动物一样，其生长主要是通过蜕皮来实现的，且其大部分生理过程与蜕皮激素所控制的蜕皮周期有关。甲壳动物在一个蜕皮周期中，体内蜕皮激素
25、含量随之发生周期性变化，这在许多甲壳动物中已得以证明1618。蜕皮类固醇激素对三疣梭子蟹蜕皮过程起重要调控作用，分泌的蜕皮激素决定了蜕皮的程度。蜕皮激素在血液中的浓度变化有一个普遍规律，即在蜕皮前期，蜕皮激素在血液中的浓度逐渐升高，在临近蜕皮时，形成一个峰值，然后浓度迅速下降。在实际蜕皮时，处于低浓度状态。至于蜕皮激素含量在整个生长发育阶段是否存在周期性变化，尚缺乏研究19,20。参考文献1叶海辉,李少菁,黄辉洋,等锯缘青蟹器结构与卵巢发育的研究J厦门大学学报,2002,4167917952薛俊增,堵南山,赖伟,等中国三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS的研究东海海洋,19
26、97,15460653赵维信,王义强,欧阳奋春中国对虾体内20羟基蜕皮酮含量与生长和性腺发育关系J台湾海峡,1992,1143053094赵鹏,徐继林,亓一舟,等高效液相色谱三重四级杆质谱分析海洋甲壳动物淋巴和肌肉中的20羟基蜕皮酮J分析化学,2011,39157615LACHAISEF,LEROUXA,HUBERTM,ETA1THEMOLTINGGLANDOFCRUSTACEANSLOCALIZATION,ACTIVITYANDENDOCRINECONTROLAREVIEWJJCRUSTBIO1,1993,131982346CORNELIAB,DIETERATHEULTRASTRUCTURA
27、LBASISOFSTERIODPRODUCTIONINTHEYORGENANDTHEMANDDIBULARORGANOFTHECRABSHEMIGRAPSUSNUDUSDANAANDCARCINUSMAENASLJCELLTISSUERES,1980,206839467SUBRAMONIAMTCRUSTACEANECDYSTERIODSINREPRODUCTIONANDEMBRYOGENESISJCOMPBIOEHEMPHYSIO1,2000,125C1351568OKUMURAT,HANCH,SUZUKIY,ETA1CHANGESINHEMOLYMPHVITELLOGENINANDECDYS
28、TEROIDLEVELSDURINGTHEREPRODUCTIVEANDNONREPRODUCTIVEMOLTCYCLESINTHEFRESHWATERPRAWN,MACROBRACHIUMNIPPONENSEJZOO1SEI,1992,937459罗荣生,王幽兰,曹梅讯,等中华绒螯蟹血淋巴20羟蜕皮酮诱发蜕皮和卵巢发育的作用J动物学报,1990,36215716410姜仁良,谭玉钧,吴嘉敏,等中华绒螫蟹血淋巴20羟蜕皮酮17雌二醇和皋酮含量的变化J水产学报,1992,16210L10611HEINERBANDMANFREDEIMMUNOELECTRONMICROSCOPICEVIDENCEO
29、FECDYSTEROIDSINYORGANOFORCONECTESLIMOSUSCRUSTACEA,DECAPODAJCELLTISSUERES,198323323323612蔡生力甲壳动物内分泌学研究与展望J水产学报,1998,22215416113房凯蜕皮激素及其对蟹虾养殖业的影响J生物学杂志,1993181014徐继林,杨家锋,严小军,等海洋鱼类血清游离皮质醇液质分析研究J分析化学研究报告,2008,36790590915方晓明,张社液相色谱质谱P质谱联用技术的进展及应用J检验检疫科学,2002,121535516曹梅讯20羟基蜕皮酮的放射免疫分析法及其在蓖麻荽蛹上的应用J昆虫学研究集刊198011617上官步敏,李少菁锯缘青蟹窦腺显微和超微结构研究J动物学报,1995,41434134618亓一舟,朱冬发,杨济芬,等甲壳动物蜕皮抑制激素调控机制的研究进展J动物学杂志,2010,45216517019上官步敏,李少菁锯缘青蟹X器官神经分泌细胞的细胞学研究J海洋学报,1994,16611612120刘智俊,吴旭干,成永旭,等三疣梭子蟹卵巢发育期间Y器官组织学变化J上海海洋大学学报,2010,3314320
