1、毕业论文文献综述生物技术鱼类HSP70的研究进展摘要HSP70是一类最保守和最重要的热休克蛋白家族，作为分子伴侣在协助新生多肽链折叠，蛋白质复合体的装配，以及调节、修复和降解变性的蛋白质方面起着重要作用。而鱼类因其独特的生理特征已成为研究热休克蛋白的理想模式生物。本文总结了鱼类HSP70方面的研究成果,并着重介绍鱼类HSP70的诱导因子,及其在调节鱼类抗逆能力作用和作为生物标记物和在水环境监测方面的潜力。关键词HSP70；鱼类；抗逆能力；应激热休克蛋白HEATSHOCKPROTEIN,HSP,又称应激蛋白STRESSPROTEIN,SP,是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于自然界原核、真核
2、细胞中，参与细胞的损伤与修复。1974年,TISSIERES等证实高温能够激发染色体内基因转录合成一种特异性的蛋白使果蝇染色体蓬松，从此开启了对热休克蛋白的研究。后来，BOND等1发现，不仅在热刺激,在其他的应激条件下，如冷、缺氧、重金属污染、营养缺乏等,生物体内也可生成此种蛋白，因此该蛋白又称其为应激蛋白。热休克蛋白有多个家族，按它们分子量大小可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPS相对分子质量为212312及泛素2,其中HSP70基因没有内含子,在大多数生物中含量最多,在应激反应中最为敏感,是热休克蛋白家族中最受关注、研究最深入的一种。HSP70具有重要的生物
3、学功能,如具有分子伴侣的作用,细胞内HSP70主要参与细胞内蛋白质的折叠、装配、降解和修复过程等,促进细胞增殖,调控细胞凋亡，并且在免疫调节中也发挥着重要作用。鱼类为水生变温动物，温度的日变化和季节变化对其生命过程有重要影响，水环境中的其他因素如重金属、缺氧、细菌感染等也会影响着它们的分布和生理状态，而这些因素与它们体内热休克蛋白的数量和表达程度息息相关。因此，许多鱼类已成为研究热休克蛋白的理想材料。目前关于HSP70的性质、功能和测定方法方面的研究较多3。但关于鱼类HSP70方面的文献研究较少,且着重于介绍其调控机制方面4。因此本文总结了鱼类HSP70方面的研究成果,并着重介绍鱼类HSP70
4、的诱导因子,及其在调节鱼类抗逆能力中的作用。本研究可提高对鱼类HSP70表达及其作用的认识,而且可为水产养殖过程中环境因子的调控提供一定的理论依据。1鱼类HSP70基因特点目前有关鱼类热休克蛋白的研究报告多集中在蛋白质水平上，但多种鱼类编码热应激蛋白的基因序列也己经被克隆和检测，包括虹鳟5、草鱼6、罗非鱼7、大黄鱼8等，有些实验是用鱼体某种组织为材料进行研究，而大部分实验是以所培养的某种鱼类的组织细胞为材料。大量的鱼类HSP70基因的克隆表明鱼类HSP70氨基酸同源性均较高,表明其在进化上高度保守,且承担着重要的生理功能。鱼类HSP70蛋白的一级结构可分为3个功能域靠近N端的ATPASE活性区
5、，分子量大小为45KD，为在结构上高度保守的氨基酸序列,与不同生物HSP70所共有的生化特性有关紧接着为分子量18KD大小相对保守的氨基酸序列,是多肽的重要结合部位靠近C端有分子量约为10KD结构多变的氨基酸序列,其结构尚不明确,可能与某种特定的蛋白底物相互作用有关。在许多陆生生物中,热休克蛋白可受一些因子的调控，从而激活或抑制热激蛋白的表达，这些因子被称为热激转录因子HSFS。鱼类中还没有明确的有关热激转录因子的报道,只有AIRAKSINEN等1998年在虹鳟的原代培养细胞中报道了热激转录因子I样蛋白具有DNA结合活性,并与HSP70的诱导表达有关9。2鱼类HSP70表达调控HSP70的诱导
6、是由遗传控制的,还是环境控制的,目前还存在争论。部分研究认为基因调节因子和细胞内蛋白热稳定性是调控HSP70表达的主导因素10而有的研究认为HSP70诱导是由环境条件决定的,而不是由遗传因素控制的11。下面例举几种能诱导HSP70表达的环境因子。21温度HSP70的表达具有可塑性，与环境因子变化和热历史有关。陆续报道证明，几乎所有生物细胞在温度升高时均可合成热休克蛋白12。苏岭等研究表明鲫鱼在受到热休克后，肝脏中HSP70MRNA的表达量与时间出现一种线性关系。热激1H后MRNA的表达量开始升高，并且随着时间的增加呈现上升趋势，在4H的时候表达量达到最高值，为起初的29倍。之后MRNA的表达量
7、开始降低，在48H后基本降至初始值。这一趋势与已有报道的其他生物一致13。在自然环境条件下,热休克蛋白的表达有季节性的变化。在夏季,生物体内热休克蛋白的量往往要高于冬季14。和夏季驯化的虾虎鱼相比,在冬季驯化的鱼脑组织中有更高的HSP70。从18上升到28时,冬季驯化的鱼HSP70开始表达而对于夏季驯化的鱼来说从18上升到28时,HSP70并不表达,而上升到32时,HSP70才开始表达。HSP70诱导阈值温度与驯化温度有关,并具有物种特异性。大多数生物如虾虎鱼HSP70诱导阈值温度随着驯化温度的提高而升高而有的生物如克海七鳃鳗其HSP70诱导阈值温度随驯化温度的提高却呈现降低的趋势15。这种现
8、象可能与生物遗传特性有关。因此,HSP70的诱导应该是受到遗传和环境双重控制的。22环境污染有机污染物可以提高鱼类肝脏HSP70的表达。如随着水体富营养化加剧，淡水藻类会产生多种藻毒素。何珊等研究鲢鱼、草鱼、尼罗罗非鱼对藻毒素耐受性与肝脏HSP70表达关系。研究表明鲢鱼、草鱼、尼罗罗非鱼这3种鱼类处于水体的不同层次,食性不一,因此,它们接触藻毒素的几率亦不同,从而也进化出不同的耐受能力。它们认为这三种鱼对富营养化水体、藻毒素的耐受能力,与HSP70基因的表达水平成正相关16。工业化学试剂也会影响HSP70的表达，。VIJAYAN等发现工业污水可以提高虹鳟鱼和大鳞大马哈鱼体内HSP70的表达17
9、。杀虫剂复禄芬的诱导可使尼罗罗非鱼体内HSP70的表达提高18。环境中重金属可以诱导水生生物产生HSP70。有报道鱼类如黑头软口鲦、虹鳟鱼经铜、锌和汞的诱导，促使HSP70的表达19。因此,HSP70可以作为生物受到环境污染胁迫的指示剂。23其他因子捕食和寄生也会诱导HSP70产生。KAGAWA等报道在捕食者蓝鳍太阳鱼存在的情况下,金鱼脑内HSP70会显著升高20。当体内有寄生虫存在时,虹鳟鱼体内HSP70表达也会提高21。3鱼类HSP70的应用价值31提高机体热耐受能力在各种细胞器中,核仁和细胞膜对高温特别敏感。HSP70能够广泛存在于细胞骨架和核骨架内,并且与核仁和细胞膜结合,从而提高细胞
10、对热的耐受力。研究发现,提前暴露在亚致死温度一定时间,可使机体随后获得对其致死温度的耐受能力,这种现象称为诱导热耐受性。当细胞受到热刺激时，增加合成的HSP70，可与变性蛋白或异常蛋白相结合，减少不溶性聚集物的产生并解离无法修复的蛋白质，另外，通过修复错误折叠蛋白，可加快正常蛋白的恢复，使热休克时因蛋白质变性而造成的蛋白量的减少得到补充，从而保持细胞的自稳定，保护细胞免受变性蛋白的损害。有研究表明22将5摄氏度下的虹鳟鱼红细胞体外25摄氏度热激能导致热休克蛋白70MRNA60倍水平的提升，证实HSP70在保护细胞免受热应激损害有潜在作用。32感染免疫与抗感染免疫热休克蛋白具有高度保守性，病原体
11、热休克蛋白70部分序列同源，因此有可能导致宿主的免疫防御机制不能识别，使病原体增值。因此病原体热休克蛋白70可保护病原体适应宿主体内的不利环境。另一方面，宿主和病原体并不是完全同源的，它们之间也存在差异，这种差异可能会引起宿主免疫系统针对此病原体HSP70的免疫应答。因为宿主的体内环境如温度、PH等与外部环境不同，许多病原体如细菌、寄生虫等感染宿主后，为适应新的生长环境常伴随HSP70的表达，最终引起宿主的抗感染免疫。FORSYTH等人23首先发现银大马哈鱼在感染了沙氏肾杆菌后，HSP70蛋白在肝脏、头和肾中的表达量增加了。不久，ACKERMAN等21发现溶藻弧菌感染虹鳟后，HSP70蛋白在虹
12、鳟肝脏、头和肾中的表达也增加了。万文菊24研究发现在抗病原菌感染及疫苗产生的免疫应答过程可能有HSP70成员的参与，但仍需要进一步研究来阐明HSP70与免疫系统之间的关系。33生物标记物与水体环境监测鉴于HSP70的高度保守性，将其作为生态生物标记物，可以避免传统的环境监测指标因物种差异和环境条件差异而带来的不一致因素，可以把实验室低等生物实验结果应用于高等动物甚至人类。同时HSP70的高度保守性，其在生物进化亲缘比较上可作为一种参照来进行衡量。HSP70蛋白也可以作为水体环境的监测指标。VIJAYAN等25提出，萘黄酮、氯化镉、牛皮纸浆漂白液BKME浓度在远低于LC50值时，便可以诱导鲑鱼肝
13、脏组织HSP70合成。沈骅等26提出了HSP70蛋白有潜力成为重金属污染条件下生物标记物。对HSP70的初步研究己经显示了HSP70作为生物标记物和在水环境监测方面的潜力，但是HSP70的表达水平并不是总与有害因素的作用强度完全线性相关，其机制较为复杂。利用HSP70作为水环境污染的检测有它的局限性，有人就提出不同的污染物会诱发不同热休克蛋白家族的表达，仅仅靠一种热休克蛋白不足以作为环境污染的指示物。所以，仍需要进一步解决HSP70检测水体质量系统的不足，以及不断完善其它热休克蛋白的这一检测系统。4展望目前鱼类HSP70的分子生物学研究仍然处在描述阶段，虽然多种鱼类编码热应激蛋白的基因序列也己
14、经被克隆和检测，但对HSP70在应激反应中的合成机制和其蛋白表达机制仍不是很清楚。由于诱导因子的复杂性，研究HSP70与诱导因子之间关系的工作也一直进展缓慢。关于是否把HSP70作为生物处于应激状态的指标还存在争论。在今后的研究中,以下几个方面值得重视1鱼类热休克蛋白基因70序列与结构特征及其进化关系上的探讨2在不同生态环境中,不同鱼类物种HSP70时间和空间上表达方式的特点,及其与环境因子相互关系3鱼类HSP,HSF,HSE,HSBP的各自功能及相互之间的调控机制。通过这些研究,不仅可以了解鱼类在生理水平上对环境的适应机制,同时可为鱼类养殖技术的发展提供理论依据。参考文献1BONDU,SCH
15、LESINGERMJHEATSHOCKPROTEINSANDDEVELOPMENTJADVGENET,1987,2411192MULTHOGHEATSHOCKPROTEIN70HSP70MEMBRANELOCATION,EXPORTANDIMMUNOLOGICALRELEVANCEJMETHODS,2007,432292373HOCHACHKAPW,SOMEROGNBIOCHEMICALADAPTATIONMECHANISMANDPROCESSINPHYSIOLOGICALEVOLUTIONMUSOXFORDUNIVERSITYPRESS,20024BASUN,TODGHAMAE,ACKERM
16、ANPA,ETALHEATSHOCKPROTEINGENESANDTHEIRFUNCTIONALSIGNIFICANCEINFISHJGENE,2002,2951731835KOTHARYRK,BURGESSEA,CANDIDOEPMTHEHEATSHOCKPHENOMENONINCULTUREDCELLSOFRAINBOWTROUTHSP70MRNASYNTHESISANDTURNOVERJBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTAGENESTRUCTUREANDEXPRESSION,1984,78321371436林亚秋,郑玉才,吉红草鱼HSP70基因CDNA部分序列克隆及其组织
17、表达差异J淡水渔业,2009,39467717李莉萍,陈明,唐章生,等5个品系罗非鱼热休克蛋白HSP70基因序列比对分析J西南农业学报,2009,2238288338张祖兴,李明云,陈炯,等大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备J海洋与湖沼,2006,3743373419AIRAKSINENS,RABERGHCMI,SISTONENLETALEFFECTSOFHEATSHOCKANDHYPOXIAONPROTEINSYNTHESISINRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSCELLJEXPBIO,1998,201254325
18、5110MORIMOTORIREGULATIONOFTHEHEATSHOCKTRANSCRIPTIONALRESPONSECROSSTALKBETWEENAFAMILYOFHEATSHOCKFACTORS,MOLECULARCHAPERONESANDNEGATIVEREGULATORSJGENESDEV,1998,123788379611DIETZTJ,SOMEROGTHETHRESHOLDINDUCTIONTEMPERATUREOFTHE90KDAHEATSHOCKPRTOTEINISSUBJECTEDTOACCLIMATIZATIONINEURYTHERMALGOBYFISHESGENUS
19、GILLICHITHYSJPROCNATLACADSCIUSA,1992,893389339312黄惠芳,马飞热激蛋白的分子进化研究J厦门大学学报自然科学版,2004,43B0816617013苏岭,李绍戊,等半定量RTPCR方法检测热应激对鲫鱼肝脏中HSP70MRNA含量的影响J华北农学报,2010,2510010414HOFMANNGE,SOMEROGNEVIDENCEFORPROTEINDAMAGEATENVIRONMENTALTEMPERATURESSEASONALCHANGESINLEVELSOFUBIQUITINCONJUGATESANDHSP70INTHEINTERTIDALMU
20、SSELMYTILUSTROSSULUSJJEXPBIOL,1995,1981509151815WOODLA,BROWNIR,YOUSONJHTISSUEANDDEVELOPMENTALVARIATIONSINTHEHEATSHOCKRESPONSEOFSEALAMPREYSPETROMYZONMARINUSEFFECTSOFANINCREASEINACCLIMATIONTEMPERATUREJCOMPPHYSIOLBIOCHEM,1999,123A354216何珊,梁旭方,李观贵,等鲢鱼草鱼和尼罗罗非鱼热休克蛋白70基因CDNA全序列的克隆与分析J环境科学学报,2009,2911232423
21、3017VIJAYANMM,PEREIRAC,KRUZYNSKIG,ETALSUBLETHALCONCENTRATIONSOFCONTAMINANTINDUCETHEEXPRESSIONOFHEPATICHEATSHOCKPROTEIN70INTWOSALMONIDSJAQUATTOXICOL,1998,4010110818HASSANEINHM,BANHAWYMA,SOLIMANFM,ETALINDUCTIONOFHSP70BYTHEHERBICIDEOXYFLUORFENGOALINTHEEGYPTIANNILEFISHOREOCHROMISNILOTICUSJARCHENVIRONCON
22、TAMTOXICOL,1999,37788419DUFFYLK,SCOFIELDE,RODGERST,ETALCOMPARATIVEBASELINELEVELSOFMERCURY,HSP70ANDHSP60INSUBSISTENCEFISHFROMTHEYUKONKUSKOKWIMDELTAREGIONOFALASKAJCOMPBIOCHEMPHYSIOL,1999,124C18118620KAGAWAN,RYOK,MUGIYAYENHANCEDEXPRESSIONOFSTRESSPROTEIN70INTHEBRAINOFGOLDFISH,CARASSIUSAURATUS,REAREDWITH
23、BLUEGILL,LEPOMISMACROCHIRUSJFISHPHYSIOLBIOCHEM,1999,2110311021ACKERMANPA,IWAMAGKPHYSIOLOGICALANDCELLULARSTRESSRESPONSESOFJUVENILETROUTTOVIBRIOSISJAQUATANIMHEALTH,2001,1317318022CURRIES,MOYESCDTUFTSBL2000THEEFFECTSOFHEATSHOCKANDACCLIMATIONTEMPERATUREONHSP70ANDHSP30MRNAEXPRESSIONINRAINBOWTROUTINVIVOAN
24、DINVITROCOMPARISONSJJOURNALOFFISHBIOLOGY2000,5639840823FORSYTHRB,CANDIDOEPM,BABICHSL,ETALSTRESSPROTEINEXPRESSIONINCOHOSALMONWITHBACTERIALKIDNEYDISEASEJJOURNALOFAQUATICANIMALHEALTH,1997,9182524万文菊剑尾鱼HSP70家族两成员的分子克隆及溶藻弧菌感染与免疫对其基因的诱导表达D济南山东农业大学动物科技学院,200625VIJAVANM,PEREIRAC,GRAUEGHANDLINGSTRESSDOESNOTAFFECTEXPRESSIONOFHEPATICHEATSHOCKPROTEIN70ANDCONJUGATIONENZYMESINRAINBOWTROUTTREATEDWITHNAPHTHOFLAVONEJLIFESCIENCE,1997,61211712726沈骅,王晓蓉,张景飞,等低浓度ZN对幼龄卿鱼肝脏组织应激蛋自HSP70诱导的影响J农业环境科学学报,2004,233441443
