1、本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1前言12材料与方法121样品的采集1211样品总DNA的提取1213DNA提取222PCR扩增16SRDNA全序列22316SRDNA克隆文库的构建及测序3231PCR产物的纯化、回收与连接3232ECOIL感受态细胞的制备3233连接产物的转化324基于16SRDNA的系统发育学分析33结果与分析431七月份克隆文库分析4311PCRDGGE分析4312系统发育学分析732八月份克隆文库分析9321PCRDGGE分析9321系统发育学分析124讨论145结论16致谢错
2、误未定义书签。参考文献172摘要本文采用免培养微生物学技术分析三疣梭子蟹养殖塘水体细菌多样性。通过构建16SRDNA克隆文库的方法，调查三疣梭子蟹养殖塘水体7、8月份微生物群落结构。构建2个16SRDNA克隆文库，总共得到131条有效序列。结果显示，比较于培养法，2个文库中细菌更加多样化，不但蓝细菌纲和变形杆菌纲变更成优势种群，获得了CYANOBACTERIA等培养法没有获得的类群，共分为5个门（变形菌门（PROTEOBACTERIA）、蓝藻门（CYANOBACTERIA）、放线菌门（ACTINOBACTERIA）、CFB类群（CYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDE
3、S）以及厚壁菌门（FIRMICUTES），所以免培养法可以更加完整的反映养殖塘水体菌落组成。关键词三疣梭子蟹；养殖塘水体；16SRDNA；微生物群ABSTRACTINTHISPAPER,USECULTIVATIONINDEPENDENTOFBACTERIALDIVERSAITYINPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDHEMETHODDEPENDINGONMOLECULARBIOLOGYTECHNIQUES16SRDNACLONELIBRARYCONSTRUCTION,WASALSOUSEDTOINVESTIGATEBACTERIALCOMMUNITYSTRUCT
4、UREINTHESAMEWATEROFPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINJULYANDAUGUSTBYTHECONSTRUCTIONOFTWO16SRDNACLONELIBRARY,131EFFECTIVESEQUENCESHASBEENOBTAINEDTHERESULTSSHOWEDTHAT,RELATIVETOTHEMETHODOFMICROBIOLOGICALCULTURE,THEDIVERSITYOFBACTERIAINTWOCLONELIBRARYWASRICHER,NOTONLYASTHEDOMINANTGROUPSOFBACTERIATURN
5、EDINTOCYANOBACTERIAANDPROTEOBACTERIABUTALSOOBTAINEDSOMEGROUPOFBACTERIASUCHASCYANOBACTERIAWHICHDIDNTOBTAINEDWITHTHEMETHODOFMICROBIOLOGICALCULTUREALLOFTHEBACTERIACOULDBEATTRIBUTEDTOFIVEPHYLUMSPROTEOBACTERIA,CYANOBACTERIA,ACTINOBACTERIA,CFBGROUPCYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDESANDFIRMICUTESTHEDOMINANT
6、GROUPSOFBACTERIAWERECYANOBACTERIAANDPROTEOBACTERIASOITISOBVIOUSLYTHATBYUSINGTHEMETHODDEPENDINGONMOLECULARBIOLOGYTECHNIQUES,WITHOUTMICROBIOLOGICALCULTURECOULDREFLECTTHECOMMUNITYSTRUCTUREOFBACTERIAINWATEROFREARINGPONDSMORECOMPREHENSIVEKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSAQUACULTUREPOND16SRDNAMICROBIALCOMMU
7、NITY11前言近年来，三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUSMIERS病害频发，患病率和死亡率均较高，严重制约了梭子蟹养殖业的持续健康发展。水产养殖塘作为一种人工的生态系统，微生物中的细菌对这种系统的稳定起着关键作用，对养殖水体中的海产动物的生长、健康有着非常重要的作用。在这种有益菌和有害菌共同存在的生态系统中，构成群落的细菌相对比较稳定的状态，给养殖在水体中的动物提供了一个相对稳定的环境，如果构成稳定系统的某几种微生物发生变化，从而会导致细菌多样性失衡，结果引发一系列严重后果，进而使水质严重恶化并伴随一系列病害的爆发，最终对水产动物的生长和健康构成严重影响而导致经济损失1
8、。三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），俗称梭子蟹、白蟹，属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。伴随梭子蟹养殖业的高速发展，养殖规模进一步扩大，以及不断提高的养殖密度，梭子蟹养殖中的病害危机日趋严峻，严重制约梭子蟹养殖产业的健康发展。只有坚决控制疾病的发生，才能使梭子蟹产业化养殖健康、持续发展。所以，对于养殖水体的菌落构成及变化的分析研究变得非常必要。大量的研究显示，在现有条件和技术情况下，当前我们只能完全培养自然界中很小一部分微生物，绝大部分都无法培养。我国的学者在1982年首先提出了“不
9、可培养微生物”的理念25。因为免培养微生物在种群类别以及新陈代谢途径、理化反应、生长过程产物等各方面都表现出多样性，相当于传统的可培养方法会有更加丰富的生物资源供学者研究和利用68。本研究以三疣梭子蟹养殖塘为研究对象，运用克隆文库和PCRDGGE的方法确定梭子蟹养殖塘水体中细菌的多样性911，并初步研究并确定三疣梭子蟹养殖塘水体中细菌的多样性，并分析其在不同养殖阶段的群落差异。2材料与方法21样品的采集分别在2010年7月13日、8月5日，宁海县港东坝的三疣梭子蟹养殖塘做跟踪调查。在此期间，分不同批次进行水样采集，以2030天为间隔。采样时间选在上午11001200，水样的采集方法遵照海洋调查
10、规范第6部分海洋生物调查GB/T1276362007）的要求进行，应用深水采样器采集水样，采样前，开动水车30分钟，以使水体充分混匀，从深度约05M处取水，采样量为5L，采样3次。采集的样品置于黑暗、4的环境保存,采集4H内进行后续实验。211样品总DNA的提取溶菌酶缓冲液40MMEDTA，PH8050MMTRISCL，PH8010M/V）蔗糖用022M的过滤器过滤除菌，4保存。TE缓冲液2100MMTRISCL，PH8010MMEDTA，PH8010贮存液，PH80分装后121灭菌20MIN，室温保存。STE缓冲液10MMEDTA，PH8025MMTRISCL，PH8050MM葡萄糖121灭
11、菌20MIN，4保存。1工作液，PH801MMEDTA，PH8010MMTRISCL，PH80212菌体收集采用MILLIPORE过滤浓缩系统收集采集水样中的菌体，使用1M的微孔滤膜预过滤，除去一些较大的真核单细胞浮游生物和水中漂浮的杂质。过滤水样的体积为2L，收集滤液，将滤液经过022M的微孔滤膜再次过滤，菌体被截留在滤膜上。在无菌操作条件下，剪碎滤膜后，将其置于50ML无菌聚乙烯离心管中待用。213DNA提取SDS煮沸法向M1管中加入5MLSTE缓冲液，在漩涡混合器上进行充分振荡；加1/10体积的20的SDS溶液约500L），混匀后，用沸水浴25MIN，将裂解液转移至新的无菌离心管中，20
12、，10MIN；室温离心，10000RPM，10MIN，弃去上清液；用600L的1TE缓冲液溶解沉淀，然后将溶液转移至15MLEPPENDORF管中；加等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液25241，V/V），用手轻轻混匀。离心，10000RPM，4MIN；收集上清液，然后再加入等体积的氯仿/异戊醇溶液241，V/V）混匀，离心，10000RPM，4MIN；收集上清液，然后加入1/10体积的3M的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀，室温沉淀10MIN，离心，10000RPM，10MIN；用70乙醇洗涤，然后再次离心，弃去上清液，自然风干，加1TE溶液或无菌双蒸水溶解DNA，置于20保存；22PCR扩增16
13、SRDNA全序列选用细菌通用性引物对27F/1541R，扩增细菌16SRDNA的全序列，其中引物序列、PCR反应体系和PCR反应程序。反应结束后，PCR产物用08W/V的琼脂糖凝胶电泳进行检验1215。32316SRDNA克隆文库的构建及测序231PCR产物的纯化、回收与连接完成琼脂糖凝胶电泳后，将PCR产物对应的条带切下，用UNIQ10柱式通用DNA纯化试剂盒上海生工）进行纯化回收DNA，将产物连接到PMD18TVECTORTAKARA）上。10L反应体系的组成16SRDNA45LLIGATIONMIX内含连接酶）5LT载体50NG/L）05L将上述各成分混匀后，进行低速离心，使管壁无残留液
14、滴，然后在4条件下连接1624H。232ECOIL感受态细胞的制备采用传统的CACL2法制备大肠杆菌感受态细胞，具体步骤将ECOILDH5接种在LB平板上，37，12H，然后挑取大肠杆菌单菌落接种在100ML无菌的LB液体培养基中，37，200R/MIN，振荡培养68H，至OD60005左右为止；取两个50ML无菌离心管置冰上预冷，将上述培养液转入离心管中，每管50ML，冰上放置10MIN，4，离心，4000RPM，10MIN；弃上清夜，取用冰预冷过的01MOL/LCACL2溶液10ML，轻轻悬浮细胞，然后放置冰上2MIN，4离心，4000RPM，10MIN；重复步骤一次，弃上清夜，取13ML
15、用冰预冷过的01MOL/L的甘油CACL2溶液轻轻悬浮细胞，放置冰上3MIN，即成为感受态细胞；将感受态细胞悬液进行分装，并贮存于70冰箱中；233连接产物的转化向上述10L连接产物中加入100L感受态细胞，轻轻混合后，置冰上20MIN，然后用42的水浴热激15MIN，之后进行冰浴25MIN，再加入800L的液体LB培养基，37振荡培养45MIN；然后取200L菌液，涂布在含有AMP的LB平板上，37连续培养12H。之后挑取白色转化子构建菌株16SRDNA全序列克隆文库，并送上海生工测序1618。24基于16SRDNA的系统发育学分析运用CHECKCHIMERA程序在RDP数据库中对得到的序列
16、进行嵌合体检验，排除质量较差的序列。用FASTGROUPIIHTTP/BIOMESDSUEDU/FASTGROUP/FG_TOOLSHTM）程序对每个克隆文库的序列进行分组，并将相似性大于98的菌株作为一个OUT，即可操作分类单元，其中每个OUT中选择一株菌作为代表菌株，并用BLAST程序HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/）进行同源性搜索，然后选取与其同源性较高的菌株的16SRDNA序列作为参比对象。将得到的序列进行进一步的系统发育分析，利用MEGA4软件进行多重序列比对，并采用邻接法构建系统发育树，根据公式1计算每个克隆文库的4覆盖率COVERAGE，C）GOOD，19
17、53）；使用FASTGROUPII程序分析文库的多样性指数SHANNONWEINER、物种的丰富度指数及SIMPSON指数D。覆盖率C）的计算公式C1NL/N公式1）其中N代表16SRDNA文库总克隆数，NL代表在文库中仅出现一次的OTU的数量。SHANNONWIENER指数H1LNSIIIHPP公式2）EVENNESS指数JSHJLN公式3）SIMPSON指数D211ISIDP公式4）定义不同种的序列作为不同分类单元，以上各式中S为样品中的OUT数目，PI为属于OTU第I个种在全部种中的比例（PINI/N），为第I种的个体数，N为个体总数。J取值范围在01之间，反映了种间个体分布的均匀度；D
18、值是种类的优势度。3结果与分析31七月份克隆文库分析311PCRDGGE分析从三疣梭子蟹养殖塘水体样品中共选取125个克隆编号为A1A125），有2个克隆在分离过程中死亡（A15和A79）。我们将123个克隆分为47种不同带型表31，图31）。这些不同带型中又以A7为代表带型数量最（20个，占到总数的163），其余的以A7和A84的数量较多（分别为10个和5个，占总数的122和81）。表317月份克隆文库的DGGE带型统计TAB31DGGETYPESTATISTICALRESULTSOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESREARINGPONDINJULY5
19、相同克隆数量A50A3，6，24330A36A52160A43A172160A28A31，34，38，40，496490A1无1080A4无1080A23无1080A25无1080A42无1080A52无1080A51无1080A57无1080A59无1080A66无1080A67无1080A68无1080A69无1080A74无1080A45，70，73，44，113，115,117,121,123A81A65，85，106，102，1076490A62无1080A72无1080A8，12，11，13，16，19，20，21，22，23，24，27，30，29，32，33，37，39，41A
20、10无1080A14，18，26，46，47，48，54，55，56，61，64，71，72，75A60A632160A35A53，583240A86，88，91，92，104，105A80，87，114，116，119，122,125A76无1080A118无1080A83无1080A89无1080A90无1080A93无1080A94无1080A97无1080A98无1080A99无1080A103无1080A95无1080A96无1080A112A101，1203240A110,A1002160A108无1080A109无1080A111无1080123100总数A827570A7886
21、50A7201630A9151220克隆代表菌株具有相同条带类型的克隆编号相同克隆占总数的比例A84108106ABCDEF图317月份水样克隆文库细菌的DGGE16SRDNA的DGGE分析FIG31DGGEPROFILEOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESREARINGPONDINJULY注NO51A51；NO53A53；依此类推7从图31A可以看出8个克隆的带型均不相同，因此，A中共有8个带型。在图31B中，可以清晰地看出，共有20个克隆，分别属于10种带型是以A2为代表的4个克隆，以A28为代表的8个克隆，以A5为代表的2个克隆，以A17为代表的的
22、2个克隆，其余各代表一种带型，共计10种带型（详见表31）。从图31C可以清晰的看出，共有28个克隆，分别属于15种不同带型主要由以A78为代表的带型（8个克隆）以及A82为代表的带型（7个克隆）的15个克隆组成，其余克隆各代表一种带型（详见表31）。从图31D可以清晰的看出，共有20个克隆，分别属于2种不同带型是以A7为代表由19个克隆的一个带型，剩余的A10单独为一个带型（详见表31）。在图31E中，可以清晰地看出，共有19个克隆，分别属于4种不同带型是以A65为代表的6个克隆构成的一个带型，以及以A44为代表的10个克隆组成的一个带型，剩余两个克隆各代表一个带型（详见表31）。从图21F
23、中，可以清晰的看出，共有20个克隆，分别属于3种不同带型主要以A9为代表带型的15个克隆组成，剩余的以A60、63这2个克隆为一个带型，以及以A35、53、58这3个克隆为一个带型（详见表31）。312系统发育学分析我们将47个不同带型的克隆进行PMD检验，共有31株克隆与质粒完成连接。用细菌通用性引物对27F/1541R，扩增细菌16SRDNA的全序列，完成后，送至（上海生工）测序，运用CHECKCHIMERA程序在RDP数据库中对得到的序列进行嵌合体检验，排除质量较差的序列。用FASTGROUPII程序对克隆文库的序列进行分组，并将相似性大于98的菌株作为一个OUT，并选择一株菌作为代表菌
24、株，采用BLAST程序进行同源性搜索见表32），然后选取与其同源性较高的菌株的16SRDNA序列作为参比对象。将得到的序列进行进一步的系统发育分析，并采用邻接法构建系统发育树见图32），最终获得38个有效16SRDNA克隆。从表32和图32中可知，38个有效16SRDNA克隆由变形菌门、蓝藻门、放线菌门、拟杆菌门以及厚壁菌门5个门构成，其下又包括8个纲，10个科，12个属，12个种，12个系统发育型。蓝藻门的细菌占据绝对优势，共分离出20株菌株分属于3个科，3个种，占到有效16SRDNA克隆总数的536。而蓝藻菌门则主要由鱼腥藻属所构成，共11株，占蓝藻菌门的550，占总克隆数的289。剩余的
25、4个门中，拟杆菌门共有10株菌株，3个种，占到了克隆总数的263。另外变形菌门变形杆菌纲、变形菌纲、变形杆菌纲、变形杆菌纲）、放线菌门和厚壁菌门都只有少量的菌株存在。8表327月份克隆文库细菌群落组成的演替TAB32SUCCESSIONOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESREARINGPONDINJULY16SRDNA相似性ACTINOBACTERIDAE/ACTINOMYCETALESCYANOBACTERIA/GPI/CYANOBACTERIAUNCULTUREDANABAENASPGPIIA/SYNECHOCOCCUSSPCHLOROPHYTA/U
26、NCULTUREDPHOTOTROPHICEUKARYOTEFIRMICUTES/BACILLALES/BACILLUS/BACILLIBACILLACEAEBACILLUSSPBACILLUSALCALOPHILUSA109EU231621993UNCULTUREDFIRMICUTESBACTERIUMA108EU703276961PROTEOBACTERIA/ALPHAPROTEOBACTERIAP/BETAPROTEOBACTERIABURKHOLDERIALESUNCULTUREDBETAPROTEOBACTERIUMA23EF4714541001CHROMATIALES/ECTOTH
27、IORHODOSPIRACEAEP/DELTAPROTEOPROTEOBACTERIAUNCLASSIFIEDPROTEOBACTERIAUNCULTUREDDELTAPROTEOBACTERIUMA4FM242397961BACTEROIDETES/FLAVOBACTERIALES/FLAVOBACTERIUM/FLAVOBACTERIAFLAVOBACTERIACEAEUNCULTUREDFLAVOBACTERIABACTERIUM38总数A42AF5344361001972P/GAMMAPROTEOBACTERIAALKALILIMNICOLA/UNCULTUREDBACTERIUMA6
28、9EU592402992UNCLASSIFIEDALPHAPROTEOBACTERIAUNCULTUREDBACTERIUMA68FJ7449558A51FJ613839996CHLOROPLASTA111AY8620089911FAMILYIIA25AB0582261001FAMILYIA59EU402397100登录号克隆数ACTINOBACTERIAUNCLASSIFIEDACTINOMYCETALES/UNCULTUREDBACTERIUMA10EU592404991门/纲目/科种代表克隆9图327月份三疣梭子蟹养殖塘水样克隆文库16SRDNA细菌序列的系统发育树FIG32DENDRG
29、RAMFORCLONELIBRARIESBACTERIABASEDONPARTIAL16SRRNAGENESEQUENCESOFWATERSAMPLESOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINJULY32八月份克隆文库分析321PCRDGGE分析从水样中共选取148个克隆编号为B1B148），有3个克隆在分离过程中死亡（B78、86、144）。我们将145个克隆分为70种不同带型表33，图33）。这些不同带型中又以B16为代表带型数量最（14个，占到总数的97），与B106条带类型相同的克隆共9个，占到总数的50,另外分别以B6和B167为代表的两种带型都包
30、括7个克隆（占到总数的47），其余都已23个为主。10表338月份水样克隆文库的DGGE带型统计结果TAB33DGGETYPESTATISTICALRESULTSOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESREARINGPONDINAUGUST克隆代表菌株具有相同条带类型的克隆编号相同克隆数量B16，17，5B4，14，15，12，13，8，9，30、31、34，3314B6，7，28，29，24，25B327B3B1，23B10B112B20，21B18，19，22，236B26B272B55无1B53、54B513B52无1B50无1B49无1B48B412
31、B47B39，353B46无1B45无1B44B422B40无1B36无1B372条明显条带，未测序1B38B432B63，64B85，77，81，846B67，68，75B69，70，82，767B73B742B71B722B65B56、663B61、62无2B57，58B793B59、60B803B83无1B97B90，92，964B87B952B88、89无2B93，105无2B94B1012B91无1B98无1B99无1B100无1B102无1B103无1B104无1B106B107、108、113、114、119、120、136、1379B134B123，124，1354B132B1
32、332B130B131、115、1184B127B129，121，1224B125B126，111，1124B116B117，109，1104B138B1482B128无1B139无1B140B142、143、145、1465B141无1B147无1145总数11ABCDEF图338月份水样克隆文库细菌16SRDNA的DGGE分析FIG33DGGEPROFILEOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESREARINGPONDINAUGUST注NO23B23；NO22B22；依此类推12在图33A中，可以清晰的看出，共有21个克隆，分别属于14种不同带型主要由以
33、B35为代表的带型（3个克隆），B42为代表的带型（2个克隆）以及B51为代表的带型（3个克隆）的12个克隆组成，其余克隆各代表一种带型（详见表33）。在图33B中，可以清晰地看出，共有34个克隆，分别属于7种不同带型主要由以B4为代表的带型（14个克隆），B1为代表的带型（3个克隆）、B10为代表的带型（2个克隆）、以B6为代表的带型（7个克隆），以B18为代表的带型（6个克隆）以及以B26为代表的带型（2个克隆）的34个克隆组成（详见表33）。从图33C,可以看出，B144无条带，未送去测序，其余11个克隆中，分别属于6种不同带型主要由以B140为代表的带型（5个克隆）以及B138为代表的
34、带型（2个克隆）的12个克隆组成，其余克隆各代表一种带型（详见表33）。从图33D中，可以清晰的看出，共有31个克隆，分别属于7种不同带型主要由以B115为代表的带型（4个克隆），B106为代表的带型（9个克隆）、B116为代表的带型（4个克隆）、以B121为代表的带型（4个克隆），以B132为代表的带型（2个克隆）以及以B123为代表的带型（2个克隆）的31个克隆组成（详见表33）。在图33E，可以清晰的看出，共有19个克隆，分别属于12种不同带型主要由以B87为代表的带型（2个克隆），B88为代表的带型（2个克隆）、B90为代表的带型（3个克隆）、B93为代表的带型（2个克隆）以及B94为
35、代表的带型（2个克隆），其余克隆各代表一种带型（详见表33）。从图33F中，可以清晰的看出，共有19个克隆，分别属于12种不同带型主要由以B56为代表的带型（3个克隆），B57为代表的带型（3个克隆）、B61为代表的带型（2个克隆）、B63为代表的带型（6个克隆）B59为代表的带型（3个克隆）、B71为代表的带型（2个克隆）、B73为代表的带型（6个克隆）以及B67为代表的带型（7个克隆），其余克隆各代表一种带型（详见表33）。321系统发育学分析我们将70个不同带型的克隆进行PMD检验，共有58株克隆与质粒完成连接。用细菌通用性引物对27F/1541R，扩增细菌16SRDNA的全序列，完成后
36、，送至（上海生工）测序，运用CHECKCHIMERA程序在RDP数据库中对得到的序列进行嵌合体检验，排除质量较差的序列。用FASTGROUPII程序对克隆文库的序列进行分组，并将相似性大于98的菌株作为一个OUT，每个OUT中选择一株菌作为代表菌株，并用BLAST程序进行同源性搜索见表34），然后选取与其同源性较高的菌株的16SRDNA序列作为参比对象。将得到的序列进行进一步的系统发育分析，并采用邻接法构建系统发育树见图34），最终获得93个有效16SRDNA克隆。从表34和图34中可知，93个有效16SRDNA克隆由变形菌门、蓝藻门、放线菌门以及拟杆菌门4个门构成，由4个门，8个纲，14个科
37、，20个属，23个种，23个系统发育型组成。各门中的克隆数量相差不大，变形菌门变形杆菌纲、变形杆菌纲、变形杆菌纲、变形菌纲6个科10个种）、放线菌门（2个科3个种）、蓝藻门（3个科4个种）、拟杆菌门（2个纲3个科6个种）分别有20、24、25、24个，占克隆总数的215、258、269、258。1316SRDNA相似性ACTINOBACTERIDAE/UNCLASSIFIEDACTINOMYCETALES/ACTINOMYCETALESUNCULTUREDBACTERIUMUNCLASSIFIEDACTINOMYCETALES/UNCULTUREDACTINOBACTERIUMUNCLASSI
38、FIEDACTINOBACTERIA/UNCULTUREDBACTERIUMCYANOBACTERIA/GPI/CYANOBACTERIAUNCULTUREDANABAENASPGPIIA/SYNECHOCOCCUSSPGPIIA/UNIDENTIFIEDBACTERIUMCHLOROPHYTA/UNCULTUREDPHOTOTROPHICEUKARYOTEPROTEOBACTERIARHODOBACTERALES/OCEANICOLAGRANULOSUSB46DQ915616911/ALPHAPROTEOBACTERIARHODOBACTERACEAEUNCLASSIFIEDRHODOBAC
39、TERACEAE/RHODOBACTERALESBACTERIUMB63FJ869046992UNCLASSIFIEDRHODOBACTERACEAE/UNCULTUREDALPHAPROTEOBACTERIUMB47EF471669993YANGIAPACIFICAB68AJ877265961ROSEICYCLUSMAHONEYENSISB139AJ315682981P/OCEANOSPIRILLALES/GAMMAPROTEOBACTERIAHALOMONADACEAEO/ALCANIVORAX/ALCANIVORACEAEUNCULTUREDGAMMAPROTEOBACTERIUMUNC
40、ULTUREDGAMMAPROTEOBACTERIUMP/DELTAPROTEOBACTERIAP/SULFURIMONAS/EPSILONPROTEOBACTERIAUNCULTUREDBACTERIUMBACTEROIDETES/FLAVOBACTERIALES/UNCLASSIFIEDFLAVOBACTERIACEAE/FLAVOBACTERIAFLAVOBACTERIACEAEUNCULTUREDBACTERIUMPSYCHROSERPENS/UNCULTUREDBACTERIUMB/SPHINGOBACTERIALES/BALNEOLA/SPHINGOBACTERIACRENOTRI
41、CHACEAEUNCULTUREDBACTERIUMB/UNCULTUREDBACTEROIDETESBACTERIUMS/UNCLASSIFIEDSAPROSPIRACEAE/SAPROSPIRACEAEUNCULTUREDBACTERIUMHALISCOMENOBACTER/UNCULTUREDBACTEROIDETESBACTERIUM93总数B26EF471455962B57FJ15506310011B28EF471452951B45EU592350981B100EF574469981B94EU5923359981003CAMPYLOBACTERALES/HLICOBACTERACEA
42、EB52EF379628951UNCLASSIFIEDDELTAPROTEOBACTERIAUNCULTUREDBACTERIUMB65FJ1550321UNCLASSIFIEDGAMMAPROTEOBACTERIAB44FJ7449389941HALOMONASSPB61AM945678993ACTINOBACTERIAFAMILYIIB98AY344431100B83FM2422011009910CHLOROPLASTB3AY8620083B67AB05822610011FAMILYIB16EU40239710021ACTINOBACTERIAB54DQ520190991B58AJ5755
43、22100登录号克隆数B103EU592404992门/纲目/科属/种代表克隆表348月份水样克隆文库细菌群落组成的演替TAB34SUCCESSIONOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESREARINGPONDINAUGUST14图348月份水样16SRDNA克隆文库的细菌序列的系统发育树FIG34DENDRGRAMFORCLONELIBRARIESBACTERIABASEDONPARTIAL16SRRNAGENESEQUENCESOFWATERSAMPLESOFREARINGPONDINAUGUST4讨论本文分别构建7月份和8月份两个克隆文库（A文库和B
44、文库），对这两个克隆文库不同时期的细菌群落组成和数量变化分析（见表32、表34、表41）。A文库中，38个有效16SRDNA克隆由变形菌门、蓝藻门、放线菌门、拟杆菌门以及厚壁菌门5个门构成，其下又包括8个纲，10个科，12个属，12个种，12个系统发育型。蓝藻门的细菌占据绝对优势，共分离出20株菌株分属于3个科，3个种，占到有效16SRDNA克隆总数的536。而蓝藻菌门则主要由鱼腥藻属所构成，共11株，占蓝藻菌门的550，占总克隆数的289。剩余的4个门中，拟杆菌门共有10株菌株，3个种，占到了克隆总数的263。另外变形菌门变形杆菌纲、B15变形菌纲、变形杆菌纲、变形杆菌纲）、放线菌门和厚壁菌
45、门都只有少量的菌株存在。菌种构成上主要以蓝藻门和拟杆菌门为主，其余均只有少量存在。B文库中，93个有效16SRDNA克隆由变形菌门、蓝藻门、放线菌门以及拟杆菌门4个门构成，由4个门，8个纲，14个科，20个属，23个种，23个系统发育型组成。各门中的克隆数量相差不大，变形菌门变形杆菌纲、变形杆菌纲、变形杆菌纲、变形菌纲6个科10个种）、放线菌门（2个科3个种）、蓝藻门（3个科4个种）、拟杆菌门（2个纲3个科6个种）分别有20、24、25、24个，占克隆总数的215、258、269、258。4个门菌株数差别不大。表4116SRDNA克隆文库中细菌类群的多样性TAB41BACTERIALDIVER
46、SITYOFIDENTIFIEDFROMEACH16SRDNALIBRARY克隆数目株）比例）克隆数目株）比例）ALPHAPROTEOBACTERIA253886BETAPROTEOBACTERIA126GAMMAPROTEOBACTERIA253886DELTAPROTEOBACTERIUM126332EPSILONPROTEOBACTERIA111FIRMICUTESBACILLI10263ACTINOBACTERIAACTINOBACTERIA12624258CYANOBACTERIACYANOBACTERIA2052625269BACTEROIDETESFLAVOBACTERIA/SP
47、HINGOBACTERIA126242583810093100多样性指数SHANNONWIENERINDEXHDIVERSITYINDEXEVENNESSINDEXJSIMPSONINDEXD03550221总数138216340665084门纲A文库B文库PROTEOBACTERIAA、B文库综合分析，从7月份到8月份，A文库中变形菌门包括变形杆菌纲、B变形菌纲、变形杆菌纲、变形杆菌纲，B文库则为变形杆菌纲、变形杆菌纲、变形杆菌纲、变形菌纲，数量方面在8月份大幅增加。厚壁菌门则从A文库的第二大纲（10株，占总克隆数263），在B文库中完全没有出现。放线菌门和拟杆菌门则从A文库的只有1株，B文
48、库大量增加（20株和24株，占总克隆数215和258）。蓝藻菌门则一直处于绝对优势。对于A、B文库中细菌组成的巨大变化，我们认为受多方面因素的影响1920，OLIVIER等指出16采样方法的差异往往大于研究方法对结果的影响。另外养殖塘中的水产动物种类、水产饵料的类型、养殖的时期等人为因素也可能会对养殖环境中的微生物种类及数量造成很大影响。蓝藻菌门一直占据绝对优势则和现代工业化对于海水中氮磷含量过高有着直接影响2124。计算覆盖率表明（7月份731，8月份855），对于水体的细菌多样性研究结果具较为准确。多样性计算结果，A文库的SHANNONWIENER指数H（A文库1382，B文库1634）、
49、EVENNESS指数J（A文库0665，B文库0840）均较低于B文库，SIMPSON指数D（A文库0355，B文库0221）高于B文库。B文库多样性和均匀度都有所提高，而总类优势度则降低。5结论7、8月份的文库共发现131条有效序列，分别属于变形菌门、蓝藻门、放线菌门、拟杆菌门以及厚壁菌门5个门。属于蓝藻菌门的细菌一直占据着绝对优势，其余以放线菌门和拟杆菌门出现频率较高。比较7月份和8月份细菌群落，覆盖率、多样性和均匀度在8月份均增加，而优势类群的优势度则降低。17参考文献1薛俊增中国三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUSMIERS的研究J东海海洋,1977,15422232王浦东三疣梭子蟹养殖技术J海洋科学,1996,820150173魏育红,薛仁宇,朱越雄蟹类的病毒性和细菌性疾病研究进展J内陆水产,2001,26242434吴后波,潘金培弧菌属细菌及其所致海水养殖动物疾病J中国水产科学,2001,8189935叶明亮,袁著忻,李晓娣等细菌随机扩增多DNA分析中模板提取方法的优化J军事医学科学院刊,2001,2521001066陈梅,李筠,徐怀恕梭子蟹及牡蛎
