1、毕业论文文献综述食品质量与安全透明质酸的研究现状摘要透明质酸是生物体内普遍存在的酸性黏多糖，具有独特的黏弹性、生物相容性及非免疫原性，在生命科学、食品行业以及医学领域都有较为广泛的应用，本文主要对透明质酸的生产、提取、分离纯化、降解方法等方面进行综述。关键词透明质酸；提取；纯化；HA降解1透明质酸简介透明质酸是一种由DN乙酰氨基葡萄糖和D葡萄糖醛酸为结构单元的高分子粘多糖，具有许多天然粘多糖共有的性质呈白色、为无定形固体、无臭无味、具有强烈的吸湿性、溶于水、不溶于有机溶剂等等。由于直链轴上单糖之间氢键的作用，透明质酸分子在空间上呈刚性的螺旋柱型1，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生强烈的亲水性；
2、同时羟基的连续定向排列，又在分子链上形成高度的憎水区，HA分子的亲水和憎水特性，使得浓度低于1的HA也能形成连续的三维蜂窝状网络结构，水分子则在网络内通过极性键和氢键与HA分子相结合，使得这些水在柱内固定不动，不易流失，HA亲和吸附的水分约为其本身重量的1000倍，这是其它粘多糖无法比拟的。且HA具有独特的分子结构和理化性质，它在有机体内显示出多种重要的生理功能，具有特殊的保湿作用；分子量大的可在皮肤表面形成膜状，起到比较强的保湿润滑作用，而且分子量小的还能被皮肤吸收进入真皮层，促进人体血液循环、改善中间代谢等，从而使皮肤变得光滑、柔嫩2，而且透明质酸无致炎性及抗原性，是理想的“粘性手术”材料
3、，对眼科、骨科手术的完成和康复起重要作用3，所以被广泛应用于化妆品、医药等方面。但是EGURA27和TMIYAZAKI28等人的研究表明，透明质酸的构想受温度、PH、外界机械剪应力以及盐浓度的影响，因此在获得相对分子量分布带比较窄的的透明质酸时需要控制好各个实验条件。透明质酸广泛分布于各种动物组织中，而且不同的动物组织中得到的与细菌发酵得到得透明质酸无种属差异4。迄今为止，已在很多动物结缔组织以及动物眼玻璃体等组织中已分离得到HA。目前所了解的制备透明质酸的方法主要有两种，一种是从动物组织中提取，一种是从微生物发酵液中提取5。国内大多从鸡冠以及动物眼球等组织中提取透明质酸。但是动物组织提取法所
4、得的HA的纯度相对不是很高，而且生产效率低、成本高，其原料来源也受限制。虽然该法有很多缺陷，但它仍然是现今生产医学用HA主要的方法6。2透明质酸研究现状21透明质酸的提取HA制备的方法目前主要有组织提取法、细菌发酵法和人工合成法。组织提取法工艺流程比较简单，获得的HA分子量也较大，一般都大于60万，且其粘度高，保湿性能好。透明质酸在动物组织中的分布很广泛，几乎所有的动物组织中均含有一定水平的透明质酸，只是含量不同而已。目前我们已从下列组织中分离出了透明质酸结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料透明质酸含量的高低、数量的
5、多少和提取难易的程度等因素的影响，能够真正投与生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球，同时HA又还与硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织中，这就导致透明质酸提纯难度加大，生产成本较高78。姚美琴等9采用水提醇沉，等电点法脱蛋白质与超滤相结合的加工工艺，运用正交实验法对提取工艺参数进行优化，制备得到的透明质酸为白色粉末，得率为296。酶法提取一般有单酶提取和双酶提取两种，但由于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，因此为去除生成物中较长的肽段在不改变糖链结构的前提下，可先采用碱提法或GDNHCL抽提法1012,再用两种或两种以上的酶水解,能有效地提高粘多糖的得率。所得的多糖提取液有的因粘稠，常常用离心
6、法除去不溶物。郭育涛13，赵玉红14等人用胰蛋白酶水解动物组织，得到纯度较好的HA；汪建等15人采用粗胰蛋白酶水解鸡冠，并分批次加入酶，水解效果较好。此外常见的水解酶还有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、和链霉菌蛋白酶等。酶法脱蛋白效果较好，损失率低，但酶解强度不宜过大、时间不宜过长，否则易使太多多糖蛋白质的复合物分解，造成某些多糖蛋白质复合物特有的生理活性降低16,17。细菌发酵法是利用某些种属的链球菌，如兽疫链球菌，在生长繁殖过程中，向胞外分泌以透明质酸为主要成分的荚膜。细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业
7、生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点，但产率较低，一般不会超过02，得到的透明质酸分子量也较低。汪江波18等人首次通过亚硝基胍NTG诱变获得甘油缺陷型菌株，通过控制甘油的添加量来调节细胞膜的通透性，透明质酸的产量和相对分子质量都可达到较高水平。据文献查询，目前国际透明质酸发酵水平最高为65G/L。透明质酸无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（R）有差别。日本京都大学19通过天然酶聚合反应，人工合成出了用途广泛的HA。使用多糖类聚合物合成“透明质酸氧氨杂环戊烯衍生物”，然后添加水解酶产出衍生物和酶的复合体，再清除反应液
8、中的酶合成HA。据报道，人工合成的HA与天然品在质量上没有差别。诺维信与美国的HYALOSELLC公司在进行利用带有HA遗传信息的基因植入微生物体内，进行HA生产的研究。以上两种方法处于研究阶段,若能实现规模化生产HA，为人类社会提供质优价廉的产品,将是HA行业的一场革命20。23透明质酸纯化通过查找文献可知，分离纯化透明质酸的方法有酶分解结合季铵盐法、季铵盐法、酶分解与树脂交换法、离子交换层析法、芳香树脂和活性炭法、电膜分离法、超滤法、季铵盐DEAE凝胶过滤法等。不过从动物组织中分离纯化透明质酸，纯化中使用季铵盐的话不但操作过程复杂，而且透明质酸损失比较大；芳香树脂和活性炭法的HA损失也比较
9、大；电膜分离方法纯化程度有限；离子交换法操作不稳定，不容易实现工业化生产操作。张谦朋等21采取了DEAE一纤维素柱层析法和蛋白水解酶降解法处理样品，分别对鸡冠和脐带GAG中的蛋白部分处理，再利用各种GAG和季铵盐如氯代十六烷基吡啶）生成的复合物在氯化钠溶液中解离所需的临界盐浓度不同而将所得的GAG复合物分级分离。已知透明质酸氯代十六烷基吡啶复合物解离所需盐浓度远较其他含硫酸基的GAG为低，因此选择适当的低盐浓度，在其他GAG复合物保持不溶性的同时，透明质酸季铵盐优先解离而成游离的可溶性聚糖，从而获得多糖纯品。洪水声等22用N甲基N硝基N亚硝基胍NTG对兽疫链球菌进行诱变，获得高产菌株。经过对该
10、菌株的发酵培养，将产生的多糖经SAVAGE法、季铵复合物沉淀法、DEAE纤维素DE52离子交换层析法及SEPHADEXG75凝胶过滤法分离纯化，纯化的多糖结构经化学组成分析、核磁共振波谱、红外光谱及圆二色谱鉴定，证明了诱变得到的高产菌株STREPTOCOCCUSZOOEPIDEMICUSJ18再经发酵，得到的多糖为透明质酸，通过刚果红实验证明了透明质酸的构象为单股螺旋结构,其平均分子量约为116106。周海东等人23研究了利用膜技术分离透明质酸发酵液的可行性，试验表明，采用微滤和超滤相结合的工艺能够实现HA发酵液的分离提纯。应国清等24采用D315大孔离子交换树脂进行分离纯化透明质酸，以去离子
11、水为淋洗液,06MOL/LNACL溶液为洗脱液,纯化效果较佳。GERARD等25曾报道了采用DEAE纤维素、DEAE葡聚糖分离HA的研究，但由于这两种层析剂价格昂贵，限制了在工业上的应用。24透明质酸降解HA聚合链很容易在各种理化因素如机械（剪切）应力、热降解、辐射作用、氧化和酶消化等条件下被降解。目前，主要有化学法、物理法和酶法三类降解方法241化学降解法研究表明化学降解主要由水解和羟基上的活性氧引起的。TOKITA等对HA在不同PH条件下的水解降解进行了研究，并对机理进行了探讨。结果表明，在酸性条件下，水解发生在糖醛酸残基上的C1、C4和羰基C所连的C等部位，在C1和C4部位的水解导致链的
12、断裂，保留半缩醛环。在碱性溶液中，断裂则多发生在C1、环中的O及乙酰氨基上的N原子上。郭学平等26人研究表明随着过氧化氢浓度增加，反应温度的升高，降解速率加快。中性条件下HA的氧化降解速率较快，而酸性或碱性时却较慢。为了方便降解过程的可控性，过氧化氢浓度选005，反应温度定为50，反应PH为中性。随着HA相对分子质量的降低，运动黏度迅速下降，而糖醛酸含量基本不变。不同过氧化氢浓度降解时，低分子HA收率基本相同。EGURA27研究发现高分子量的透明质酸在超声波处理后被降解为分子量在0420106G/MOL之间的HA分子。且发现当PH小于15或者PH大于11时，HA分子被不可逆的水解破环。242物
13、理降解法常见的物理降解方法主要是超声波法，MIYAZAKI等28研究了超声降解HA过程中声强、温度、HA浓度、共存离子、离子强度对降解的影响。研究发现,温度越低越有利于降解MR的降低，推断原因为温度高时，HA黏度下降,分子间运动加剧,机械剪切力一部分转化为振动能；温度高时，蒸汽压增大，空化气泡中的气体增加,由于缓冲作用，空化气泡塌陷的机会减少；而且，温度升高导致溶解在溶液中的气体减少。声强是最主要的影响因素。有专利报道，联合使用超声波和次氯酸钠降解HA的方法可降解制得MR在5103一2104的低分子量HA，分子量分布较窄。另外，还有研究发现，在中性、碱性条件下超声降解变化不大，过氧化氢存在的超
14、声降解，降解后HA有结构变化。贺芸等29研究了电化学法和高压均质法降解透明质酸。采用电化学法降解透明质酸时，采用TI/SB一SNOZ电极进行电解实验，其降解效果随着降解时间的增加而提高，随着电流密度的增加而提高，随着初始浓度的增加而降低，随着电解质浓度的增加而降低，随电解温度的增加而提高。采用高压均质法降解透明质酸时发现其降解效果随着初始相对分子量的增加而提高，随着初始浓度的增加而降低，随着均质压力的增加而提高，随着循环次数的增加而提高，不随氯化钠浓度和均质温度的变化而变化。此外，物理方法有机械剪切力法、微波法、Y射线辐射法、加热法和紫外线照射法等。经过物理降解后HA红外光谱与降解前比较无差异
15、，因为降解力作用于HA分子链，致使分子链断裂。243酶法降解30生物大分子的酶法水解由于其专一性强、反应条件温和并且没有副产物，常被人们首选用于大分子的降解。透明质酸酶是对催化降解透明质酸的酶的通称。酶解法是降解HA温和的方法，最适于制备OLIGOHA。酶解主要是透明质酸酶和硫酸软骨素酶两种。因为化学降解等方法将HA降解成寡聚糖，需要较剧烈的反应条件，如较高的酸、碱浓度等，才能达到高的降解程度。此时不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖残基的结构也可能遭到破坏，如乙酰基被水解掉、单糖六元环断裂等。当然酶解法也可用于制备LMWHA。MAHONEY将HA用玻璃酸酶降解，然后经凝胶色
16、谱和阴离子交换色谱纯化分别制得434糖，其中416糖在糖链长度上是均一的，即纯化得到均一的4、6、8、16糖；1834糖是这些糖的混合物。制备均一的OLIGOHA很重要，分别对几种均一OLIGOHA的生物活性进行研究，可以明确某种寡糖的作用，而不是多种寡糖混合物的作用。参考文献1EVEREDD,WHELANJ,EDSTHEBIOLOGYOFHYALURONAN,CIBAFOUNDATIONSYMPOSIUM143MJOHNWILEYSONS,19896152张红霞，徐三魁程宝珠等提取法制备透明质酸的研究J郑州工业高等专科学校学报，2002，18（3）63张彬，周武羊眼透明质酸的制备J食品科技，
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18、AO,ETALEXTENSIVEHETEROGENEITYOFPROTEOGLYCANSBEARINGFUCOSEBRANCHEDCHONDROITINSULFATEEXTRACEDFROMTHECONNECTIVETISSUEOFSEACUCUMBERJJBIOLCHEM,1993,322254226211郑艾初，陈健等糙海参酸性粘多糖的提取纯化工艺探讨J现代食品科技，2007，235656712罗红宇，高鹏等赤魟软骨粘多糖的制备J中国海洋药物杂志，2005，244141713郭玉涛，陈斌，江元汝等从牛眼玻璃体中分离纯化透明质酸的新方法J精细化工，2008,25324625014赵玉红，韩琳
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