1、毕业论文开题报告海洋生物资源与环境鲈鱼CPTI基因CDNA的克隆一、选题的背景与意义肉毒碱棕榈酰转移酶（CARNITINEPALMITOYLTRANSFERASES,CPT,EC2312）是脂肪酸的氧化中主要的限制酶，丙二酸单酰辅酶A是其主要抑制剂。该酶系统由两种类型组成肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT）和肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT）。线粒体内细胞质一侧的脂酰COA由肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶催化与肉碱结合形成脂酰肉碱，脂酰肉碱通过线粒体内膜的移位酶的作用穿过线粒体内膜，进入线粒体。在线粒体内基质的一侧的肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶的催化下，脂酰肉碱上的脂酰基又转移到COA上，重新形成脂酰COA,成为氧化
2、的底物。而鲈鱼LATEOLABRAXJAPOMCUS肉质坚实，洁白细嫩，肉味鲜美，营养特别丰富，是人类优质的蛋白质来源，也是我国水产从业人员捕捞、养殖的主要高档水产品种，经济价值很高,在我国渔业经济中占重要地位。目前大量的对肉毒碱棕榈酰转移酶的研究主要集中在哺乳动物如人、大鼠方面等上。国内黄其春等（2008）报道，猪肝脏和肌肉肉碱脂酰转移酶I基因片段克隆及序列分析。他们的研究旨在对肉毒碱棕榈酰转移酶转运机制和该酶对细胞代谢的影响及缺乏此酶对机体的影响等，但在鱼类方面研究较少，只是在鱼的肝脏和肌肉中测出有CPT的活性（FROYLAND1998等）。本研究通过对鲈鱼CPT基因的克隆来，来研究CPT
3、对鲈鱼鱼体的影响，主要是包括鱼体生长发育方面（水温适应），鱼肉口感方面及对人类身体的影响等做理论依据，为鲈鱼的最优养殖做指导二、研究的基本内容与拟解决的主要问题本研究通过提取鲈鱼肝脏中总RNA，并逆转录成CDNA，将所得到CDNA的进行PCR克隆从而得到该基因的核心序列，最后通过RACE技术拉出全长，得出该基因全长序列。为以后CPTI基因分析、深入研究营养物质如甜菜碱等对鲈鱼肝脏、肌肉组织CPTIMRNA表达的影响及阐明其分解脂类物质的分子基础等做铺垫，从而进一步从分子水平研究肉毒碱棕榈酰转移酶在鱼体中的作用，为最后通过基因工程技术改变CPTI的活性，并将其应用于生产。拟解决问题有实验前鲈鱼培
4、养条件确定，PCR引物设计合理性，PCR克隆最优条件的确定及等。三、研究的方法与技术路线1RNA的提取及逆转录表达总RNA在鲈鱼的肝脏中是通过TRIZOL试剂盒说明书提取出来将鲈鱼肝剪碎后放入研钵中倒入液氮进行研磨，加入1MLTRIZOL试剂呈液态后转移到经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的EPPENDORF管中在1530室温中放置5MIN，加入200UL氯仿手摇匀5S并放置23MIN，在41200R/MIN离心5MIN，取上层水相转至新的EP管中，加入05ML异丙醇，室温放10MIN，在41200R/MIN离心10MIN，弃上清，沉淀用现配的75乙醇洗涤后室温干燥，干燥后用30UL的无酶水溶解
5、即得总RNA提取液。取两个干净的05MLEP管，依次加入RNA05UL，OLIGODT引物50UMOL/L1UL，5BUFFER5UL，DNTP10MMOL/L1UL，MMLV逆转录酶200U/UL1UL，加DEPC处理水至总体积为25UL以上均冰上操作，离心后，置于42水浴60MIN，65水浴10MIN。得到CDNA产物，置于20储存。2设计PCR引物在GENBANK中找出人（HUMAN），小鼠（MUSMUSCULUS），虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS，大西洋鲷SPARUSAURATA，牛（BOSTAURUS），鸡（GALLUSGALLUS），食蟹猴（MACACAFASCICULA
6、RIS），斑马鱼（DANIORERIO），绵羊（OVISARIES），野猪（SUSSCROFA）及大西洋鲑鱼（SALMOSALAR）肝中的CPT的CDNA序列，通过BIOEDIT软件进行同源性对比，找出同源性较好的片段，然后通过PRIMER5软件设计出CPT的上游引物和下游引物，然后将此引物在NCBI数据库中进行BLSAT下，选出最优的几对引物进行PCR实验。3PCR及其产物处理聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION,PCR反应包含变性，退火，延伸三步骤。将反应管在50UL体系（5ULBUFFER，1ULCDNA模版，1UL各DNTP,1UL上游引物,1UL下游引物，05
7、ULTAQDNA聚合酶，灭菌蒸馏水375UL）中进行PCR反应。此反应条件为94预变性5MIN；接着30个循环941MIN,5245（前8个循环降落）1MIN,722MIN；最后72延伸2MIN。然后将PCR产物混合在1浓度的琼脂糖凝胶电泳进行，加入适量溴乙啶（ETHIDIUMBROMIDE,EB）染料对PCR产物进行染色，将电泳标本放置在紫外线下观察，通过MARK比较来找出目标片段，通过切胶回收来获得PCR产物，最后进行测序，获得核心片段。4RACEPCRCCDNA末端快速扩增（5AND3RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS,RCAE）技术，目的是为了鲈鱼CPT基因的3R
8、ACE扩增和5RACE扩增。RACE扩增RACE操作按照SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKIT说明书进行，设计克隆CPT基因的3RACE引物LYCPT3F3和5RACE引物LYCPT5R3，分别以3CPTCDNA和5CPTCDNA为模板，以试剂盒提供的通用引物UPM进行3RACE和5RACEPCR反应。PCR条件如下9430S，723MIN，5个循环9430S，7030S，723MIN，5个循环9430S，6830S，723MIN，25个循环最后72延伸8MIN以第1轮PCR产物稀释50倍作为模板，设计巢氏引物3RACE引物LYCPT3F4和5RACE引物LYCPT5R
9、4，和试剂盒提供的引物NESTUPM分别进行第2轮PCR扩增PCR反应条件如下预变性943MIN9430S，683S，723MIN，30个循环最后72延伸10MIN。将3RACE和5RACE产物纯化、克隆后送测序，并分析结果5结果通过将3RACE和5RACE产物用VECTORNTISUITE7软件进行连接得出基因的全长，为以后的进一步分析做基础。四、研究的总体安排与进度2010年12月实验前准备1查询中英文资料、文献2设计实验方案3准备实验中所需的仪器和材料2011年13月进行实验1RNA的提取及逆转录2PCR及PCR其产物处理3CPT1核心片段的鉴定4通过RACE拉出全长2011年4月撰写论
10、文1实验数据整理、分析2完成论文初稿并交指导老师修改2011年5月准备答辩1完成论文正稿2准备毕业答辩五、主要参考文献1EATON,SCONTROLOFMITOCHONDRIALBOXIDATIONFLUXPROGLIPIDRESJ2002,41,1972392FRASER,F,CORSTORPHINE,CG,ZAMMIT,VA,TOPOLOGYOFCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIINTHEMITOCHONDRIALOUTERMEMBRANEBIOCHEMJ1997323,7117183BRITTON,CH,MACKEY,DW,ESSER,VETALFINECHRO
11、MOSOMEMAPPINGOFTHEGENESFORHUMANLIVERANDMUSCLECARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEICPT1AANDCPT1BJ1997GENOMICS40,2092114GUDERLEY,H,JOHNSTON,IAPLASTICITYOFFISHMUSCLEMITOCHONDRIAWITHTHERMALACCLIMATIONJ1996EXPBIOL199,131113175SMALL,GM,BURDETT,KANDCONNOCK,MJASENSITIVESPECTROPHOTOMETRICASSAYFORPEROXISOMALACYLCOAO
12、XIDASE,BIOCHEMJ1985227,2052106PONSR,CARROZZOR,TEINI,ETALDEDCIENTMUSCLECARNITINETRANSPORTINPRIMARYCARNITINEDECIENCYJ1997PEDIATRRES425835877MOYES,CD,BUCK,LT,HOCHACHKA,PW,SUAREZ,RKOXIDATIVEPROPERTIESOFCARPREDANDWHITEMUSCLEJ1989EXPBIOL143,3213318EGGINTON,SEFFECTOFTEMPERATUREONTHEOPTIMALSUBSTRATEFOROXIDA
13、TIONJ1996FISHBIOL49,7537589SARGENT,JR,BELL,MV,TOCHER,DRTHELIPIDSINHALVER,JED,FISHNUTRITIONACADEMICPRESSINC,PP198915321810HENDERSON,RJFATTYACIDMETABOLISMINFRESHWATERFISHWITHPARTICULARREFERENCETOPOLYUNSATURATEDFATTYACIDS,ARCHANIMJ1996NUTR49,52211MIYASAKI,T,SATO,M,YOSHINAKA,R,SAKAGUCHI,MEFFECTOFVITAMIN
14、CONLIPIDANDCARNITINEMETABOLISMINRAINBOWTROUTFISHJ1995SCI61,50150612HARPAZ,S,LCARNITINEANDITSATTRIBUTEDFUNCTIONSINFISHCULTUREANDNUTRITIONAREVIEWJAQUACULTURE249200532113黄其春,许梓荣,李卫芬等猪肝脏和肌肉肉碱脂酰转移酶I基因片段克隆及序列分析J龙岩学院学报,200826卷314GUTIERESA,S,DAMONB,M,PANSERATA,S,KAUSHIKA,S,MEDALEA,F,ETALCLONINGANDTISSUEDIST
15、RIBUTIONOFACARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIGENEINRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYPARTB,135200313915115FROYLAND,L,MADSEN,L,ECKHOFF,KM,LIE,O,BERGE,RKCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEI,CARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEII,ANDACYLCOAOXIDASEACTIVITIESINATLANTICSALMONSALMOSALARJ199
16、8LIPIDS33,92393016CHOMCZINSKI,F,SACCHI,MSINGLESTEPMETHODOFRNAISOLATIONBYGUANIDIUMTHIOCYANATEPHENOLCHLOROFORMEXTRACTIONJANALBIOCHEM1987162,15615917HIGGINS,D,SHARP,PFASTANDSENSITIVEMULTIPLESEQUENCEALIGNMENTSONAMICROCOMPUTER1989CABIOS5,15115318BARNES,WMPCRAMPLIFICATIONOFUPTO35KBDNAWITHHIGHFIDELITYANDHI
17、GHYIELDFROMBACTERIOPHAGETEMPLATESJPROCNATLACADSCI1994USA912216222019BORSON,ND,SATO,WLDREWES,LRALOCKDOCKINGOLIGODTPRIMERFOR5AND3RACEPCRJ1992PCRMETHODSAPPLIC214414820ATLSCHUL,S,GISH,W,MILLER,W,MYERS,E,LIPMAN,D,1990BASICLOCALALIGNMENTSEARCHTOOLJMOLBIOL215,40341021SWANSON,ST,FOSTER,DW,MCGARRY,JD,BROWN,N
18、F,ROLESOFTHENANDCTERMINALDOMAINSOFCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIISOFORMSINMALONYLCOASENSITIVITYOFTHEENZYMESINSIGHTSFROMEXPRESSIONOFCHIMAERICPROTEINSANDMUTATIONOFCONSERVEDHISTIDINERESIDUESBIOCHEMJ1998335,51351922DAI,J,ZHU,H,SHI,J,WOLDEGIORGIS,GIDENTIFICATIONBYMUTAGENESISOFCONSERVEDARGININEANDTRYPTOPH
19、ANERESIDUESINRATLIVERCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIIMPORTANTFORCATALYTICACTIVITYJ2000BIOLCHEM275,220202202423SHI,J,ZHU,H,ARVIDSON,DN,CREGG,JM,WOLDEGIORGIS,GDELETIONOFTHECONSERVEDFIRST18NTERMINALAMINOACIDRESIDUESINRATLIVERCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIABOLISHESMALONYLCOASENSITIVITYANDBINDINGJ1998BIOCHEMISTRY37,1103311038
