1、 本科毕业论文 （ 20 届） 食品科学与工程 超 临 界 CO2萃取枇杷 叶 中熊果酸的研究 摘 要 本文对超临界 CO2 萃取枇杷叶中的熊果酸进行了研究，考察了萃取温度、萃取时间、萃取压力 3 个因素对提取结果的影响。采用响应面法 (RSM 法 )优化枇杷叶熊果酸的提取条件。用高效液相色谱法测定枇杷叶提取物中熊果酸的含量，利用中心组合设计，研究以上 3 个自变量对响应值熊果酸得率的影响。结果表明：超临界 CO2 法萃取枇杷叶熊果酸的最佳工艺条件为萃取温度 58，萃取时间 68min，萃取压强为 243bar；在此条件下熊 果酸含量为 2.21mg/g，在所选取的各因素水平范围内，对影响试验
2、因素的主次排序：萃取压力 萃取温度 萃取时间。 关键词： 超临界二氧化碳萃取；枇杷叶；熊果酸；高效液相色谱法 ABSTRACT In this paper, supercritical CO2 extraction of ursolic acid in loquat leaves were studied to investigate the extraction temperature, extraction time, extraction pressure of three factors on the results. By response surface method (RSM m
3、ethod) to optimize the extraction of ursolic acid in loquat. High performance liquid chromatography Ursolic Acid Loquat Leaf Extract the content, using a central composite design to study the above three variables on the response from the yield of ursolic acid. The results showed that: Supercritical
4、 CO2 Extraction of Ursolic Acid Loquat Leaf optimum conditions of extraction temperature 58 , extraction time of 68min, extraction pressure was 243bar; Under these conditions, ursolic acid content of 2.21mg/g, in the selected the level of each factor within the experimental factors affecting the pri
5、mary and secondary sort: extraction pressure temperature extraction time. Key Words: supercritical CO2 extraction;Follum eriobotryae;ursolic acid;HPLC I 目 录 1前言 . 1 2材料与方法 . 2 2.1 实验材料 . 2 2.1.1 实验原料 . 2 2.1.2 实验试剂 . 2 2.1.3 实验仪器 . 2 2.2 实验方法 . 2 2.2.1 标准曲线的绘制 . 2 2.2.2 实验设计 . 2 2.2.3 枇杷叶中熊果酸的提取并测定
6、. 3 2.2.4 色谱条件 . 3 3. 实验结果 . 3 3.1 高效液相色谱法测定熊果酸的含量 . 3 3.2 单因素萃取实验 . 3 3.2.1 萃取温度对熊果酸提取率的影响 . 4 3.2.2 萃取压力对熊果酸提取率的影响 . 4 3.2.3 萃取时间对熊果酸提取率的影响 . 5 3.3 多因素萃取实验 . 5 3.3.1 熊果酸提取参数数学回归分析结果 . 6 3.3.2 实验数据分析 . 7 3.3.3 因数间的交叉影响 . 7 3.3.4 熊果酸的 HPLC 结果 . 10 3.3.5 最佳条件确定 . 11 4. 结论 . 12 参考文献 . 13 1 1 前言 枇杷叶为蔷薇
7、科植物枇杷 Eriobotryajaponica（ Thunb.） Lindl.的叶。有清肺止咳，和胃降逆，止渴的功效 1。富 含苦杏仁甙（ amygdalin）、熊果酸、齐墩果酸、维生素 B1、和 C、鞣质、有机酸、糖类等化学成分。枇杷叶中的熊果酸具有镇静、抗炎、抗菌、抗 糖尿病 、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能 ，因而被广泛地用作医药和化妆品原料 2。熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、血清转氨酶、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用，具有见效快、疗程短、效果稳定的特点。 随着当前科学界对熊果酸的研究越来越深入细致，越来越多的试验研究数据显示
8、， 熊果酸具有抗致癌、抗促癌、诱导 F9 畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用 3-5。研究发现：熊果酸能明显抑制 HL 60 细胞增殖，可诱导其凋亡；能使小鼠的巨噬细胞吞噬功能显著提高。体内试验证明，熊果酸可以明显增强机体免疫功能。说明熊果酸的抗肿瘤作用广泛，极有可能成为低 毒有效的新型抗癌药物。熊果酸对精子也有一定毒性作用，它能破坏胆间桥的肌动蛋白，打开桥键，产生共质体，抑制精子的形成 , 利用这一作用有望开发成男性避孕药 6。 现有文献报导 7-9的关于熊果酸的提取分离方法中 ,多采用乙醇提取、石油醚脱色、硅胶柱 (或聚酰胺柱等 ) 分离、多次结晶的实验室方法 , 本研究以枇杷叶为原料，用超临
9、界萃取法探索其熊果酸的最优提取条件，为枇杷叶的综合开发利用提供依据。 最早将 超临界 CO2 萃取 技术应用于大规模生产的是美国通用食品公司，之后法、英、德等国也很快将该技术应用于大规模生产中 10。 90 年代初， 中国 开始了超临界萃取技术的产业化工作，发展速度很快。实现了 超临界流体萃取技术 从理论研究、中小水 平向大规模 产业化的转变，使中国在该领域的研究、应用已同国际接轨，在某些方面达到了国际领先水平。目前，超临界流体萃取已被广泛应用于从 石油 渣油中回收油品、从 咖啡 中提取 咖啡因 、从 啤酒花 中提取有效成分等工业中 11。 超临界流体萃取是利用温度和压力略超过或靠近临界温度和
10、临界压力介于气体和液体之间的流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取某种高沸点和热敏性成分，以达到分离和提纯的目的 12。目前常用的萃取剂为二氧化碳。此法可避免使用有毒溶剂，溶剂回收简便，可在较低温度下操作，防止多酚高温氧化，保证产品质量 。具有夹带剂用量少，萃取时间短，萃取效率高的优点。 2 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 实验原料 枇杷叶 10 月购于药房。 枇杷叶的前处理： 购买的枇杷叶为 10g 一小包的粉末状，将它放在干燥处保存 2.1.2 实验试剂 本研究使用的主要化学药品和试剂如下（见表 1）： 表 1 主要化 学药 品和 试剂 Table 1 Main chemical
11、 and reagents 试剂名称 等级 产地 甲醇 分析纯 天津市巴斯夫化工有限公司 乙醇（ 95%） 分析纯 上海三鹰化学试剂有限公司 冰醋酸 分析纯 浙江 中星化工试剂有限公司 熊果酸 98% 2.1.3 实验仪器 主要仪器和设备如下（见表 2）： 表 2 主要仪器和设备 Table 2 The main instruments and equipment 高效液相色谱仪系统 美国安捷伦科技有限公司 超临界 CO2 萃取仪 美国应用分离公司 电子称 型号 AL104 2.2 实验方法 2.2.1 标准曲线的绘制 精密称取熊果酸对照品 200.0mg 置于 100mL 容量瓶中，以甲醇定
12、容，得到2.0mg/mL 的对照品溶液。再依次稀释制备得 1.5， 1.0， 0.5， 0.25mg/mL 熊果酸对照品溶液。分别精密吸取熊果酸对照品溶液进行测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。其峰面积和浓度呈线性相关。 2.2.2 实验设计 2.2.2.1 单因素 实验设计 3 超临界 CO2 萃取熊果酸选取萃取温度、萃取压力、萃取时间三个因素。温度分别为 40 、 50 、 60 、 70 、 80 ，压力为 150 bar、 200 bar、 250bar、 300bar、350bar，时间为 30min、 55min、 80min、 105min、 130m
13、in。 2.2.2.2 响应面 实验设计 先 对 萃取 温 度（ X1）萃取 压力 (X2)和萃取 时间 (X3)进 行 编码， 熊果酸超 临 界提 取响应 曲面分析 试验设计 方案与 试验结 果 见 表 4。 2.2.3 枇杷叶中熊果酸的提取并测定 准确称取 2.0g 枇杷叶与试纸上，用 超临界 CO2 萃取装置按既定的萃取温度、萃取压强、萃取时间三个因素萃取熊果酸 ，再用 95%的乙醇溶液定容至 10mL， 溶解，取上清液用高效液相色谱法测定提取物中的熊果酸含量。 2.2.4 色谱条件 ODS 柱 (4.6 mm 250 mm， 5m)，流动相为甲醇 -水 -冰醋酸 (90： 10： 0.
14、06)，检测波 长为 205nm，流速为 0.6 mL/min，柱温为 25 ， 进样量为 20L。 3 实验结果 3.1 高效液相色谱法测定熊果酸的含量 图 1 熊果酸的 标 准 曲线 Figure1 The standard curve of ursolic acid 该曲线的回归方程为 y=3246.7x-22.493，相关系数 R=0.9956。 3.2 单因素萃取实验 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 熊果酸对照样品溶液浓度（ mg) 峰面积 4 3.2.1 萃取温度对熊果酸提取率的影响 00.511.522
15、.530 40 50 60 70 80 90萃取温度（）熊果酸提取量（mg/g）图 2 温度对熊果酸提取量的影响 Figure2 the amount of temperature on the extraction of ursolic acid 图 2 萃取压力为 250bar，萃取时间为 45min，萃取温度分别为 40 、 50 、 60 、70 、 80。横坐标为萃取温度，纵坐标为熊果酸提取量。 从图得知 60 为最佳萃取温度。表明温度影响超临界萃取的二重性： 一方面温度升高， 溶质挥发度增大，在 CO2 中的溶解度增大；另一方面温度升高， CO2 密度下降，溶剂的溶解能力下降。 3
16、.2.2 萃取压力对熊果酸提取率的影响 00.511.522.5100 150 200 250 300 350 400压强（bar）熊果酸提取量（mg/g）图 3 压力对熊果酸提取量的影响 Figure3 the amount of pressure on the extraction of ursolic acid 5 图 3 温度控制在 60 ，萃取时间为 45min，萃取压力分别为 150bar、 200bar、250bar、 300bar、 350bar。 横坐标为萃取压力，纵坐标为熊果酸提取量。 结果表明：在 150-250bar，压力升高， CO2 密度增加，熊果酸收率增加极为明显
17、，超过 250bar 后，熊果酸收率随压力升高而下降，所以最佳压力选为 250bar。 3.2.3 萃取时间对熊果酸提取率的影响 1.81.821.841.861.881.91.921.941.961.9822.0220 40 60 80 100 120 140萃取时间（min）熊果酸提取量（mg/g）图 4 萃取时间对熊果酸提取量的影响 Figure4 the extraction time on extraction yield of ursolic acid 图 4温度控制在 60 ，萃取压力为 250bar，萃取时间分别为 30min、 55min、 80min、105min、 130
18、min。 横坐标为萃取时间，纵坐标为熊果酸提取量。 从图可知随着时间的增加熊果酸的提取量在逐渐增加，之后变得缓慢，波 动幅度非常小。故 68min 为最佳萃取时间。 3.3 多因素萃取实验 通过以上的单因素实验，选取 萃取温度 、 萃取压力 、 萃取时间 三个相对影响较大的因素作多因素实验。 多因素试验表设计如下： 表 3 因素水平表 Table 3 Factors and levels 水平 萃取 温 度 X1( ) 萃取 压 力 X2（ bar） 萃取 时间 X3（ min） -1 45 150 30 0 56 225 45 1 70 338 68 6 表 4 试验结果表 Table 4
19、The result of test 试验号 X1 X2 X3 熊果酸提取率（ mg/g） 1 1 -1 0 0.32 2 -1 1 0 0.6 3 1 -1 0 0.47 4 1 1 0 1.08 5 0 -1 -1 0.53 6 0 -1 1 0.89 7 0 1 -1 1.32 8 0 1 1 1.53 9 -1 0 -1 1.45 10 1 0 -1 1.93 11 -1 0 1 1.83 12 1 0 1 1.94 13 0 0 0 2.05 14 0 0 0 1.96 15 0 0 0 1.98 3.3.1 熊果酸提取参数数学回归 分析结果 表 5 参数数学回归分析结果 表 Tab
20、le 5 parameter mathematical regression analysis table 来源 自由度 方差 标准差 F 值 Pr F X1 1 0.001861 0.001861 20.59594 0.006178 X2 1 0.006728 0.006728 74.4797 0.000345 X3 1 0.001152 0.001152 12.75277 0.016025 X12 1 0.004011 0.004011 44.39973 0.001149 X1X2 1 0.000272 0.000272 3.013838 0.143073 X1X3 1 0.000342 0.000342 3.788745 0.109162 X22 1 0.040675 0.040675 450.2811 0.0001 X2X3 1 0.000056 0.000056 0.622694 0.465802 X32 1 0.000535 0.000535 5.926838 0.059052 总模式 9 0.055176 0.006131 67.86724 0.000108 残差 5 0.000452 0.00009 总误差 14 0.055628
