1、 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 一个水稻黄绿叶突变体的基因定位 来源： GENES accepted February 27, 2009. 摘要 :一个用 EMS 处理恢复系缙恢 10 号获得的黄绿叶突变体，它在生长阶段叶绿素含量低， 农艺性状差。正常水稻与突变体杂交 F1 后代植株的叶色表现为正常的绿色，并且 F2 群体中正常植株与黄绿叶突变植株的分离比为 3:1。这表明了黄绿叶突变性状是由 1 对隐性核基因控制，暂时命名为 ygl3。该基因定位于 3号染色体的 RM468 和 RM3684 之间，它们之间的遗传距离为 8.4cM 和 1.8cM。这个结果将用于 ygl3 基因的遗传定位
2、及图位克隆。 关键词： 水稻；黄绿叶突变体；叶绿素；荧光动力学参数；基因定位 引言 作物的生物量和经济产量主要依赖于 叶片的光合同化作用，作物干物质的90来自于水稻光合作用的产物积累。黄化或是白化突变体一般是改变了代谢合成一种利用光能的主要色素，即叶绿素。作物叶绿素缺失突变也被称为叶色突变。这些突变体被广泛用于研究叶绿素生物合成和代谢，叶绿体发育，四吡咯合成途径和光合作用（ Mochizuki等， 2001； Larkin 等， 2003； Davison 等， 2004； Stern等， 2004； Beale 等， 2005）。作物叶色突变也被用来作为纯度鉴定和高光效育种的标记（ Dong
3、 等， 1995； Wu 等， 2002； Sato 等， 2007）。 许多黄色叶 突变体在大量的植物中被发现，如玉米（ Braun 等， 2006）、小麦（ Falbel 等， 1996），油菜（ Zhao 等， 2000），胡萝卜（ Nothnagel 等， 2003）和拟南芥（ Meinke 和 Koornneef， 1997）。在拟南芥中，至少有 27 个基因编码 15个有关叶绿素生物合成的酶（ Nagata 等， 2005）。这些基因在叶绿素生物合成的2 突变是叶色黄化的关键原因。水稻是单子叶植物，是世界上最重要的农作物，它的叶色突变体已经引起了很多关注（ Wang 等， 2006
4、）。图位克隆技术已经成为水稻突变体基因鉴 定的最有效和最可靠的方法。至今为止，已有超过 70 种水稻叶色突变体被报道，至少有 10 个相关基因已被定位于染色体或连锁群上，一些基因已经被克隆（ Jung 等， 2003； Lee 等， 2005 年； Wu 等， 2007）。 根据最新研究 报道，发现了 一个由恢复系缙恢 10号 （水稻 L， ssp，籼稻） 用EMS处理得到的黄绿叶突变体，并对这个突变体的 叶绿素含量，叶绿素荧光动力学参数及农艺性状进行了研究。通过对 F2代群体用基因 SSR标记技术连锁分析，定位了控制突变体黄绿叶的基因，该研究结果为突变基因的图位克隆和育种利用提供了依据。 材
5、料 与方法 植物材料 籼稻缙恢 10号是一个很好的恢复系，并已广泛应用在水稻杂交育种中。黄绿叶突变体 ygl3是由缙恢 10号用 EMS处理后连续自交 5代选育产生的。其 F1代进行 5个杂交产生 F2代群体： 西农 1A（水稻 L.ssp.籼稻 ） ygl3， 西农 1B（水稻 L.ssp.籼稻 ） ygl3， ygl3西农 1B， II-32B（水稻 L.ssp.籼稻 ） ygl3，和 ygl3II-32B。黄绿叶突变体从第三叶期开始被研究。 色素含量的检测 移植后每隔 15天混合新鲜叶片进行色素含量的测定。使用由 Lichtenthaler（ 1987）描述的方法进行提取、测量和计算。
6、净光合速率的测定与叶绿素荧光动力学参数 便携式 LI-6400系统被用于在晴朗的天气测量新生的第二片叶子 0830到 1000小时间的净光合速率（ Pn）。叶绿素荧光动力学参数测量使用带有荧光计 6400-02的便携式 LI-6400系统，每种材料测量重复 3次。 农艺性状测试 在成熟阶段，筛选出 10 个突变体植株并来测量它们的农艺性状，包括材料的有效穗，株高，主穗长，第一分枝数，主穗粒重，千粒重和结实率。 数据利用DPS3.01 系统进行分析。 DNA提取 3 西农 1A ygl3杂交的 F2代种子做为定位群体，采用 alkali-methods的方法从1122突变体植株新鲜的嫩叶中提取
7、DNA（ Sang等， 2006）。基因库 DNA的提取采用改进 CTAB法（ Murray和 Thompson， 1980）。 连锁分析 采用引自 http:/www.gramene.org/microsat由上海生工公司合成 的 微卫星引物序列。根据 Luo等的描述进行聚合酶链反应（ PCR）的 SSR标记检测（ 2007）。扩增产物在 10聚丙 烯酰胺凝胶电泳银染色成像（ Panaud等， 1996）。 基因定位 西农 1A和 ygl3分别记录为 A和 B，杂合子记作 H。连锁分析利用 MAPMAR- KER/EXP3.0b版本作图软件（ Lander等， 1987）。用 Kosambi
8、功能计算遗传距离（ centiMorgans， cM）。 表 1 ygl3突变体和野生型缙恢 10号的主要农艺性状 结果 农艺特性 ygl3突变体幼苗显黄绿色，在生长时发育不良，尤其是在分蘖期（图 1）。突变体的农艺性状有着显著的改变， 特别是突变体有效穗数和穗重分别只有野生型的 43和 30（表 1）。 突变系 ygl3的叶绿素含量 ygl3的叶绿素 a/b的比值（ 8.91-4.02）高于野生型（ 2.14-2.00）。在 ygl3的生长中，叶绿素 a/b的比值移植前 60天明显要高于移植后 60天。与野生型相比，该ygl3突变体叶绿素含量显著下降，包括叶绿素 a、叶绿素 b和总叶绿素含量
9、（图 2）。ygl3的总叶绿素含量（平均 1.09mg/g）比野生型（平均 3.26mg/g）的少。4 图 1 突变体 ygl3和野生型在分蘖期和抽穗期的表型 （ a）野生型缙恢 10号及突变体 ygl3在分蘖期的表型。（ b）野生型缙恢 10号 及突变体 ygl3在抽穗期的表型。（ c）野生型缙恢 10号及突变体 ygl3在田里的表型。 图 2 不同生长阶段的叶绿素含量分析 移植后每隔 15天混合新鲜叶片测定色素含量。应用 Lichtenthaler的方法进行提取、测量和计算。 - -代表野生型缙恢 10号， - -代表 ygl3。 净光合速率和叶绿素荧光动力学参数 与野生型相比，在分蘖期
10、ygl3突变体净光合速率（ Pn）降低了 14.5（表 2），其结果表明，该突变体仍然保持了相对较高的光合作用能力。 对应于突变体叶绿素含量下降， ygl3突变体初始荧光值（ F0）是野生 型的 31.3（表 2）。光化学猝灭系数（ qP）在突变体和野生型之间改变很少， PSII的最大效率（ Fv/Fm）为 0.65，野生型为 0.8。 PSII的实际效率（ Y）和电子传递速率（ ETR）分别为 0.25和 0.40，而野生型分别为 0.46和 0.79。这一结果表明，基因突变导致了5 光合抑制。我们可以得出这样的结论光合作用和光系统受到了 ygl3基因突变的影响。 表 2 突变体 ygl3和
11、野生型的 叶绿素的荧光动力学参数和 净光合速率 遗传分析 5个 F1杂交群体野生型是绿色的叶子。 F1代群体与野生型缙恢 10号的叶绿素含 量没有显著的差别。 F2代群体中绿叶与黄绿叶的分离比都符合 3： 1（表 3），这一结果证实， ygl3突变体黄绿叶的性状是由一对隐性主要核基因控制。 基因定位 西农 1A和 ygl3杂交选育出 F2群体，来做为与 ygl3基因有关分子标记的定位群体。 400对微卫星标记对两个亲本西农 1A和 ygl3进行多态性分析， 100对（ 25%）微卫星标记表现出多态性。这可能因为偏远的亲本亲缘关系，这些 F2群体可以有效的用于基因定位。 图 3 分子标记和突变位
12、点之间的联系分析 SSR标记 RM1230联系基因位点的 ygl3轨迹。 1， Xinog1A； 2， ygl3； 3，野生型基因库； 4，突变基因库； 5-12， F2群体中的野生型植物； 13-20， F2群体中的突变植物。 对于大多数的 DNA分离分析，来自 F2代群体的 10对黄绿叶单株和 10个绿叶单株的 染色体组 DNA分别独自混合构建一个突变体池（ MP）和一个野生型池（ WP）。在两个亲本多态性引物中，只有引物 RM1230和 RM1221（图 3）在 MP和 WP之间 仍然表现出多态性，这一结果表明了与黄绿叶突变体 ygl3有关的基因可能与这两个标记连锁。对 F2代群体的 1
13、122黄绿叶隐性性状突变体进行分析，进一步确定它们 的连锁关系，这对隐性基因定位于在 RM1230和 RM1221之间，与RM1230和 RM1221的遗传距离分别为 13.4cM和 5.8cM。 为了对 ygl3基因进一步定位，对另外 13个位于 RM1230和 RM1221之间 SSR标记引物进行了分析。 RM468和 RM3684两个标记在西农 1A和 ygl3之间表现多态6 性，它们分别与 ygl3基因的遗传距离为 8.4cM和 1.8cM（图 4）。 图 4 3号染色体的 ygl3的基因定位。 连锁分析确定黄色绿叶利用分离群体组成的 1122位点突变植物基因位点。微卫星引物序列，通过
14、 http:/www.gramene.org/microsat/，本研究的数据基础上来计算遗传距离。表 3 ygl3突变体的遗传分析 讨论 水稻是单子叶模式植物，水稻功能基因组学的研究在其染色体完全序列发表后引起了更多的关注。在水稻基础研究中，水稻突变体是极好的实验材料，至少有 12个国家和研究机构建立了突变体库（ Hirochika等， 2004）。叶色突变体被广泛用于研究叶绿体的生长发育，约有 70个叶绿素基因被报道（ Kurata等， 2005）。 这个 ygl3 叶色突变体在其成长过程中是一个稳定的黄绿叶突变体 ，并且叶绿素含量急剧下降。叶绿素含量与叶片的颜色有明显的相关性。这与之前的
15、叶色突变体研究相一致（ Ayumi 和 Ryouichi， 2006 年）。其农艺性状差，包括株高，有效穗数。但是它有一个相对稳定的农艺性状，在 ygl3 突变体中，它的千粒重为 24.1g，只的野生型的 87.6。 荧光测量技术的最新改进已经被应用在植物生理学研究（ Krause 和 Weis，1991）。为了估计 ygl3 突变体光合作用体系的影响，在幼苗阶段进行了荧光动30 力学参数的计算。 Pn， F0， Fv/Fm， qP， ETR 和 Y 都减小，特别是 F0 和 Fv/Fm。当时推定在光系统中，光抑制作用起了一定的功能，从而影响了光合作用和光合体系。这种突变会促进在实验室进行光合
16、作用的分子生物学以及相关研究。 叶色性状可由核基因或细胞质基因控制，也可能是它们共同控制（ Miura等 ，2007）。该 ygl3的基因是一个隐性核基因控制的，被定位在 3号染色体上，位于SSR微卫星标记的 RM468和 RM3684之间，它们的遗传距离分别为 8.4cM和 1.8cM的。实际上水稻第三染色体上已有许多被报道的叶绿素突变基因，如控制水稻叶片黄化的基因有 al10， chl1， chl2， chl3， chl9， st6（ t）， v1， v2， v3， oschlh，alb21 ，以及 CHL1 ， CHL9 ， CHL2 ， CHL3 ， CHL11 （ t ）， OsCH
17、LH（ http:/www.gramene.org）。 该 CHL2和 CHL3只通过经典遗传分析被定位（ Iwata和 Satoh， 1977）。该 CHL11（ t）被定位于 3号染色体的短臂端（ Huang等， 2007）。一个 oschlh突变植物在在温室条件下发芽（在四叶期） 4周后，由于没有足够的光合作用最终死亡（ Jung等， 2003）。本研究的 ygl3被定位于 3号染色体长臂端，紧接于 RM468和 RM3684之间。 CHL1的和 CHL9也定位在 3号染色体长臂端。CHL1表现淡黄浅绿色，在成熟期转变成正常绿色，但是 ygl3突变体在整个生长过程中都表现出明确的黄绿叶特性。 Chl9在整个生长过程中都表现为的淡黄色，否则它就定位于 3号染色体上的 RM2346至 RM7370与 RM468至 RM3684不重叠的范围内（ Zhang等， 2006）。因此， ygl3等位基因既不是 CHL1也不是 CHL9，而目前的研究表明，在叶片颜色发育中有新的 基因存在。 致谢 本项研究得到了国家自然科学基金项目（ 30800598）、重庆杰出青年科学基金（ CSTC， 2008BA1033），重庆自然科学基金（ CSTC， 2008BB1258）和 重庆市动植物良种创新重大专项资助 （ CSTC， 2007AA1019）的资助。 31 外文翻译原文 32 33
