1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物 技术 根霉原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究 摘 要 本实验是对根霉的原生质体进行双亲灭活融合，获得融合后代，对其进行传代培养，观察 2、 4、 6、 8 代菌株的形态特征，利用透明圈测定蛋白、淀粉酶活并与亲本相比较。实验结果得， 灭活最佳条件高温为 55 ， 10min，紫外为 15W， 10min。融合的最佳条件 PEG 浓度为 40%，融合时间为 10min。通过观察发现后代与亲本无多大区别，其生长速度都比较快， 基本形状为圆形， 最外圈为白色菌丝。菌 丝直接一般在 10-15um之间，孢子囊在 30um 左右。但其酶活却与亲本
2、有很大差别，均小于亲本。融合八代 2 的蛋白酶活和淀粉酶活 Hc 值分别为 1.87、 1.18，而亲本 1 则为 2.19、 1.59，在 5%显著差异和1%极显著差异都有很大的差异。通过电泳和 Quantity one软件分析后代产生的新的蛋白，而原有的一些亲本蛋白在后代中几乎很少出现，说明融合过程中发生了变异，并且后代遗传很不稳定。 关键词： 根霉；灭活；融合；后代观察；透明圈；电泳 ABSTRACT The experiment is to make fusion of the Rhizopus parents inactivated protoplast,then get the f
3、usion generation.After subculturing them,we observed the morphological characteristics of the 2,4,6,8 generation.We took advantage of the transparent ring to analyse the activity of amylase and compared it with the parents.The experiments result shows that the optimum conditions of inactivation is:u
4、nder 55 with 10min;under UV of 15W with 10min. The optimum conditions of fusion is:the concentration of PEG is 40%,and the time is 10min. After observing,we can find out that the future generation do not have much difference with the parents,they grow up fast,their basic shape is round,and their out
5、er ring is surrounded with white mycelium. Hyphals diameter is generally between 10-15um,and the sporangiums diameter is about 30um.However, the activity of them is very different with the parents,they are much smaller than the parents. The eight generation fusion 2s activity of protein and amylase
6、shows that their HC values were 1.87 and 1.18,respectively.However,the parents values were 2.19 and 1.59.We analysed the new proteins of future generation through the help of the electrophoresis and Quantity one software:some of the original protein rarely existed.The phenomenon suggests that the mu
7、tation occurred in the fusion process,and the genetic inheritance is very unstable. Key Words ： Rhizopus;Inactivation ； Fusion;The descendant observation;Transparent ring;Electrophoresis I 目 录 1 前言 . 1 1.1 根霉的功能 . 1 1.2 当前研究热点及本题研究意义 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 材料、试剂和设备 . 2 2.1.1 材料 . 2 2.1.2 培养基 . 2 2.1.3
8、主要试剂 . 2 2.1.4 主要溶液试剂及配制 . 3 2.2 方法 . 4 2.2.1 原生质体制 备与再生 . 4 2.2.2 原生质体灭活 . 5 2.2.3 双亲灭活原生质体融合 . 5 2.2.4 融合子筛选 . 6 2.2.5 酶活测定 . 6 2.2.6 后代培养 . 6 2.2.7 形态观察 . 6 2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 . 6 3 结果与分析 . 7 3.1 最佳灭活条件确定 . 7 3.2 融合条 件 . 7 3.3 筛选菌种 . 8 3.4 后代形态分析 . 8 3.4.1 培养基观察结果 . 8 3.4.2 菌丝观察 . 10 3.4.3 孢子观察
9、. 12 3.5 透明圈观察结果 . 14 3.5.1 酪蛋白透明圈 比较亲本与后代的蛋白酶活 . 14 3.4.2 牛肉膏蛋白胨透明圈 比较亲本与后代的淀粉酶活 . 15 3.6 SDS 电泳分析 . 16 II 3.6.1 电泳扫描图 . 16 3.6.2 蛋白质定量 . 17 3.6.3 定量检验报告 . 17 3.6.4 蛋白 质带分析 . 21 3.6.5 泳道中带分布报告 . 22 3.6.6 列相似性分析 . 23 3.6.7 亲本及其后代的聚类分析 . 24 4 小结 . 24 参考文献 . 26 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 前言 1.1 根霉的功能 小曲酿酒在我
10、国已有悠久的历史 ， 其中起主要作用的是根霉 ， 通常所说的霉菌糖化法制酒精也是用的根霉。 其生长过程中分泌的蛋白酶和谷氨酰胺酶等对酱油、豆瓣、米酒等传统发酵食品的产率和风味起着非常重要的作用。根霉分泌的胞外酶不仅种类多而且量大 ， 从它的发酵上清液中可提取很多有用蛋白质。传统大豆发酵食品中主要利用的微生物有米曲霉、毛霉、根霉和细菌。其中，根霉能在高温条件下生长，其淀粉酶活力强，且分泌蛋白酶和脂肪酶的能力很强，因此用途也很多。另外根霉还可以生产出 L-乳酸，在食品、医药及化工领域应用广泛 1。 1.2 当前研究热点及本题研究意义 在生产实践中，根霉菌株的生长速度的快慢和其分泌蛋白酶活性的高低很
11、难同时兼得。因此，通过原生质体融合技术选育生长速度快且蛋白酶活性高的根霉菌株是目前研究的热点 2。 原生质体融合育种是七十年代后期兴起的在细胞水平上遗传重组的现代生物技术 ,具有操作简便 ， 不需特殊贵重仪器和药物 ,重组频率高的优点。在高渗环境下两亲株细胞分别经溶菌酶作用除壁得球状原生质体后 ， 两者混合 ， 在聚乙二醇和 Ca2+的助融下互相凝聚 ， 通过细胞质融合进而发生基因间的接触交换 ， 实现基因重组 ， 最后由再生细胞 获得融合子 。 1974 年，匈牙利的 Ferenczy3离心力诱导的方法报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技
12、术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合 (如光合细菌与酵母菌的融合 )。 1979 年匈牙利的 Pesti4首先提出了融合育种提高青霉素产量的报告，开创了原生质体融合技术在实际工作中的应用，使原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。 Hopwood5等质体融合重组可能实现隐性基因的重组暴露，使一些隐性基因表达或随机产生新的基因表型 。 从而使之成为 链霉菌抗生素产生菌育种的新途径。 在抗菌素产生菌的育种中 ,通过原生质体在培养中发生变异 ， 从中筛选出高产优良菌株已有不少报道 6。我国利用根霉制曲酿酒虽有悠久历史 ， 但所应用菌种是从自然界中分离选择的优良菌株 。 通过原生质体培养选育
13、根霉优良菌株未见报道 , 这一方法在根霉中是否可行 ， 只有通过实验才能回答。 原生质体融合是进行遗传育种研究的重要手段，也是获得菌种融合体和重组体的有2 效方法。但是亲本菌株遗传标记的诱变筛选较费时费力，而且会带来一些不良突变。利用双亲灭活原生质体作为供体进行融合是近年来选育曲霉的重要方向。 所谓 “双灭活 7”就是将两种菌株的原生质体用不同的理化手段进行处理 ， 相应地使其某一小部位的生理结构被损伤而失去活性 ， 但决不是彻底杀死。灭活后的原生质体不能再生，而由损伤部位不同的原生质体相结合形成的融合子 ， 因损伤部位互补则可以再生。由于灭活原生质体融合减少了寻找稳定遗传标记的繁琐工作及由此
14、可能带来的亲株优良性状的丢失 ， 而且使融合子的检出变得直观 ， 提高了筛选效率 ， 因此它是杂交育种的一条有效途径。本实验是利用热紫外双亲 100%灭活融合，再用透明圈法测定酶活力从而观察后代酶活的高低。 2 材料与方法 2.1 材料、试剂和设备 2.1.1 材料 根霉（均由万里学院提供）。 2.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖培养基（ PDA）：取一定量的马铃薯，洗净、去皮、切块，在电子天平上称取 100g 左右，与 500ml 的蒸馏水一起放入锅中，煮沸 20 分钟，用四层纱布过滤后取浸出液，加入葡萄糖 10g， 琼脂 10g， 溶解后加蒸馏水至 500ml。 液体菌丝培养基：液体马铃薯培养
15、基（ PSA），用于菌丝体摇瓶发酵。配制方法：取一定量的马铃薯，洗净、去皮、切块，在电子天平上称取 100g 左右，与 500ml 的蒸馏水一起放入锅中，煮沸 20 分钟后，用四层 纱布过滤。然后取浸出液，加入蔗糖 10g，溶解后用蒸馏水定容至 500ml。 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，琼脂 16g,淀粉 2g,加蒸馏水定容到1000ml， PH7.4-7.6 。 酪蛋白水解培养基： Na2HPO47H20 1.07g， KH2PO4 0.36g，酪蛋白 10g琼脂粉 15g，加蒸馏水定容到 1000mL。 2.1.3 主要试剂 表 1 主要化学药品和试剂 名称 规格 制
16、造商 酪蛋白 细菌级 杭州微生物试剂有限公司 3 蛋白胨 细菌级 杭州微 生物试剂有限公司 蜗牛酶 细菌级 上海蓝季科技发展有限公司 溶菌酶 细菌级 上海蓝季科技发展有限公司 纤维素酶 细菌级 上海蓝季科技发展有限公司 盐酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 甲叉双丙烯酰胺 分析纯 New Jersey,USAa 甘氨酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 过硫酸铵 分析纯 温州市化学用料厂 SDS-PAGE 低分子量标准蛋白 分析纯 中国科学院上海生物化学研究所监制 甲醇 分析纯 中国杭州化学试剂有限公 冰乙酸 分析纯 杭州高晶精细化工有限公司 表 2 主要仪器和设备 名称 型号 生产厂家 L
17、S 系列立式压力蒸汽灭菌锅 LS-B150L 江阴滨江医疗设备有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9070A 上海精宏实验设备有限公司 电子天平 BS210S 北京塞多利思仪器系统有限公司 冷冻离心机 Fresco 德国 数显恒温水浴锅 HH-2 常州国华电器有限公司 双人单面超净工作台 SW-CJ-1B(U) 苏州净化设备有限公司制造 电泳仪 DYY-6C 北京市六一仪器厂 稳压稳流电泳仪 DYY 4 北 京市六一仪器厂 显微镜 XS-212 南京江南光学仪器厂 2.1.4 主要溶液试剂及配制 1、 30%丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺 29.2g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加蒸馏水 至 1
18、00mL，装于棕色瓶于 4 并向保存备用。 2、 SDS-分离胶缓冲液： 1.5mol/L Tris-HCL， pH 为 8.8，加入 0.4%SDS。 3、 SDS-浓缩胶缓冲液： 0.5mol/L Tris-HCL， pH 为 8.8，加入 0.4%SDS。 4 4、 SDS-电极缓冲液： 0.025mol/L Tris， 0.192mol/L 甘氨酸， 0.1%SDS， pH8.3。 5、分离胶：配置比例为 12.5%，其中 SDS-分离胶缓冲液 4.5mL， 30%丙烯酰胺贮存液7.5mL， 10%过硫酸铵 60L，加水 6mL，抽气后，加入 TEMED30L，迅速混匀倒入两玻璃板之间
19、（占玻璃板高度的 2/3），上层用喷雾器覆盖一水层，让其聚合30-60min。 6、浓缩胶：配置比例为 5%，其中 SDS-分离胶缓冲液 4.5mL， 30%丙烯酰胺贮存液 1.5mL， 10%过硫酸铵溶液 15L，加水 1mL，加入 TEMED15L，迅速混匀倒在制备好的分离胶上，并插入样品槽模板，上层用喷 雾器覆盖一水层，聚合 30min。 7、 Tris 提取液： 12.114g Tris 蒸馏水定溶到 100mL，用 HCl 调节 pH 至 6.9。 2.2 方法 2.2.1 原生质体制备与再生 2.2.1.1 菌株活化 在无菌环境下，将已灭菌的 PDA 培养基倾入灭过菌的培养皿中，制
20、成平板；待其冷却凝固后，用无菌接种针蘸取少量保藏的根霉菌种，接种于平板上，倒置于 30 恒温培养箱内，培养 5 天。 2.2.1.2 菌丝体培养 于无菌室的无菌环境下，在酒精灯火焰旁，将液体培养基分装入灭过菌的培养瓶中并标号。将活化好的菌株接种入已经灭过菌 的盛有约 30ml液体菌丝培养基的摇瓶中（菌丝大小不限，只要用接种针在培养基表面菌落处轻轻蘸取一下即可，每次接种后接种针均要在酒精灯火焰中灭菌并冷却才可挑取下一个菌丝）。之后放入 30 ，转速为120rad/min的摇床内培养 16-18h。 2.2.1.3 菌丝提取 将培养好的菌丝体培养液用四层擦镜纸过滤，根据离心管大小装入一定量的菌丝体
21、到已灭菌的离心管中，以 1400r/min的低转速离心 10min。之后去除上清液。然后将沉淀移入另一个已经称量过的灭过菌的离心管内，封好进行称量（菌丝的移动和菌丝的接种，还有上清 液的去除等等材料有机会接触外界环境的情况下，这些操作都要在无菌的条件进行）。 2.2.1.4 酶液配置 酶解液的体积按照以下方法来换算：菌丝重量的 1.5倍就是酶解液的量，酶解液为混合酶液，蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶以一定的浓度混合，用渗透压稳定剂配制而成。通5 过正交试验得到 3种酶的最佳配比为 7： 3： 18，并以 PBA溶液 (含 0.4mol/L HN4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲溶液， pH6)配制，滤
22、膜除菌后于 4 冰箱过夜。酶液的配置要当天配当天用。一是为了防止酶的失活，二是防止对量的估计不足而造成浪费。酶液的 配置要在无菌条件下配置防止有杂菌的进入，最后影响试验的结果。 2.2.1.5 酶解 加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀，放入适当的温度、转速 100rad/min的摇床中酶解一定的时间。酶解完成之后将混合液用四层擦镜纸过滤，接着将滤液装入 EP管（已灭菌）以 6000r/min的转速离心 20min。之后取少许上清液在显微镜下进行观察，如没有原生质体说明原生质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除（即将酶液去除，酶液的去除要尽快，否则会使酶解过程过度，从而造成原生质体的破裂，影响
23、原生质体的形成 ）， 用渗稳剂溶液离心洗 涤 3次，收集原生质体重悬于 0.8mol/LNaCl溶液中。 2.2.1.6 原生质体再生 将所得原生质体悬浮液用 0.8mol/LNaCI溶液梯度稀释至适当浓度后取 lml接种于再生培养基上。 2.2.2 原生质体灭活 2.2.2.1 紫外灭活 紫外线对微生物营养细胞的杀灭作用主要与细胞内的核酸的光化学变化有关，其灭活的机制主要包括产生嘧啶二聚体以及 DNA解螺旋 7。 稀释后的原生质体溶液于 15W紫外光线下照射 1、 3、 5、 10、 15min,分析致死率，取未诱变和紫外照射过的原生质体 1ml涂布到再生平板上，在 26 28 条件下避光培
24、养23天。确定紫外灭活最佳时间。 2.2.2.2 高温灭活 热的作用可使细胞内有功能蛋白、酶蛋白变性失活。同样，取根霉原生质体悬液适量于无菌离心管中，选取 35， 40， 45， 50， 55 ，分别作用 10 min，分析致死率。取未诱变和高温诱变的原生质体 1ml涂布到再生平板上，在 26 28 条件下避光培养 23天。确定灭活最佳温度 7。 2.2.3 双亲灭活原生质体融合 将用不同方法灭活后的亲本原生质体，分别进行两两融合，用聚乙二醇 (PEG)作促融剂。分别选融合时间 5、 10、 15、 20、 25min和 PEG浓度 20、 30、 40、 50、 60%来确定最佳融合时间和浓度。融合后用渗稳剂洗涤离心，取 1 mL悬液接种到再生平板上， 28
