1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物 技术 影响根霉原生质体制备因素及高蛋白酶菌株筛选 摘 要 本实验研究了酶系统、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂、菌龄、预处理方式等因素对根霉原生质体形成的影响，获得了制备根霉原生质体的最佳条件。同时也研究了不同时间的高温诱变与紫外诱变对原生质体再生及再生后的根霉酶活力的影响。结果表明，当菌龄为 18h， 0.8mol/L 的 NaCl 作渗透压稳定剂， 采用混合酶（蜗牛酶 0.1%、纤维素酶 0.5%、溶菌酶 0.3%）， 酶解温度 30 ，酶解 2h， 原生质体的形 成率最高。 时间为 5 分钟， 7 分钟的紫外诱变 胞外蛋白酶和淀粉酶有提高。 关键
2、词： 根霉；原生质体；融合；再生ABSTRACT The factors affecting the protoplast of Rhizopus was studied in details, including enzyme system and concentration, enzyme digestion temperature and time, osmotic pressure stabilizer, fungus age, pretreatment and so on. The results were as follows: the mycelia was cultured f
3、or 18h, 0.8mol/L NaCl as osmotic pressure stabilizer, then incubated with 0.1%Snailase,0.6%cellulose and 0.3%lysozyme for 2h at 30 , under such circumstance the formation rate of protoplast is highest. provided useful experiences of producing other epiphyte protoplasts. Key Words: Rhizopus; protopla
4、st; factors; regenerationI 目 录 1 前言 .1 1.1 根霉的特性及应用 .1 1.2 本实验的研究现状与意义 .1 2 材料与方法 .2 2.1 实 验材料 .2 2.1.1 供试菌株 .2 2.1.2 培养基 .2 2.1.3 主要仪器及试剂 .2 2.1.4 渗透压稳定剂 .4 2.1.5 酶液的制备 .4 2.1.6 其他试剂 .4 2.2 实验方法 .4 2.2.1 菌株活化 .4 2.2.2 菌体培养 .4 2.2.3 酶系和酶浓度的确定 .5 2.2.4 渗透压稳定剂的确定 .5 2.2.5 酶解温度和时间的确定 .6 2.2.6 原生质体制备 .6
5、 2.2.7 双亲灭活 .7 2.2.8 原生质体融合与再生 .7 2.2.9 融合子筛选 .7 2.2.10 融合子胞外蛋白酶及淀粉酶活力测定 .8 3 结果与分析 .8 3.1 影响原生质体制备因素结果 .8 3.1.1 不同配比酶解液对原生质体形成的影响 .8 3.1.2 渗透压稳定剂对原生质体形成的影响 .9 3.1.3 菌龄对原生质体形成的影响 .9 3.1.4 酶解温度对原生质体形成的影响 .10 3.1.5 酶解时间对原生质体形成的影响 . 11 II 3.1.6 预处理方式对原生质体形成的影响 . 11 3.1.7 其他影响因素 . 11 3.2 原生质体结果及再生选择高酶活力
6、菌种 .12 3.2.1 菌株活化及菌体培养 .12 3.2.2 原 生质体制备 .12 3.2.3 原生质体的再生 .13 3.2.4 高酶菌株的筛选 .13 4 结论与讨论 .20 参考文献 .22 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 1 前言 1.1 根霉的特性及应用 根霉 (Rhizopus)是一种好气性真菌，分类学归属于半知菌亚门、曲霉属。 根霉的菌丝无隔膜、有分枝和假根，营养菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成特有的假根，从假根 处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成圆形的孢子囊，囊内产生孢囊孢子。孢子囊内囊轴明显，球形或近球形，囊轴基部与梗相连处有囊托。根霉的孢子可以
7、在固体培养基内保存，能长期保持生活力。根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉 (即阿明诺法 )生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性的酯类物质。根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。与生物技术关系密切的根霉主要有黑根霉、华根霉和米根霉。 根霉主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处，是 我国传统酿造食品酱、酱油和酒类的生产菌种，也可用于生产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益生素等 1。随着应用领域的蓬勃发展，人们对根霉的关注日渐增长。根霉在食品酿造方面的应用历史悠久，近些年在饲料加工方面的研究也日趋深入，这些方面的
8、研究主要集中在根霉发酵产蛋白酶方面上。最近有文献报道，根霉发酵产蛋白酶可以水解制备蛋白胨。蛋白胨广泛应用于食品、发酵、医药、卫生、临床细菌检验及科研等方面。根霉发酵产纤维素酶在食品、饲料、农副产品加工、石油开采和资源再利用等方面具有广泛应用前景，而果胶酶可以降低果汁的粘度、澄清果 汁、提高果汁超滤通量、提高葡萄酒得率及过滤速度，其应用对食品加工业做出了很大贡献。此外，根霉还应用于发酵产淀粉酶、氨基酰化酶、大豆异黄酮糖苷酶、植酸酶等各种酶制剂。根霉发酵产有机酸，如曲酸，是一种具有抗菌作用的有机酸，对水果、蔬菜有护色作用，还可以消除人体内自由基，同时具有抑制黑色素生成酶活性的能力，还可用作摄影、胶
9、片去斑剂等，因此在食品、化妆品、农业、医药、化工等行业有着广阔的应用前景。 1.2 本实验的研究现状与意义 根霉是酿造业中的重要微生物，在其生长过程中分泌淀粉酶，能 糖化淀粉生产酒精 。所以，研究根 霉特性对大力发展发酵工业，研发高质量的产品有着广泛的发展前景。然而生产实践中，根霉的生产能力往往欠佳，或是蛋白酶活性高的菌株往往生长速度慢，而生长速度快的菌株往往蛋白酶活性低，所以人们为了改善这种状况作了大量工作。在我国的酿造业中，根霉的选育主要采用物理和化学的诱变方法，但融合子筛选所采用的标记方法往往使营养缺陷，且工作量较大，而且这些遗传标记还往往会干扰菌株的正常2 代谢，影响菌株的一些重要性状
10、。原生质体融合工作在丝状真菌中广泛开展。原生质体融合技术是微生物遗传育种上的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大 ， 不 受亲缘关系的影响，可有目的地选择亲株以选育理想的融合株 ， 便于操作等优点 2， 科技工作者3-7经过大量的努力，利用原生质体融合技术在微生物育种上取得了大量的成绩。 目前国内外利用原生质体融合法选育优良真菌成为一个热门课题，然而制备高形成率及高再生率的真菌原生质体是原生质体融合技术最基础也是最首要的一步。 通过对根霉原生质体一次基因改组选育出的高酶活力菌株，再次进行原生质体制备、双亲灭活、融合、再生后代融合菌株，进行融合菌株后代蛋白酶活力、淀粉酶活力等多种方法测定、分析，
11、同亲本和一次基因改组选育出的高酶活力 菌株等相比较，初步得到原生质体二次基因改组技术和高酶活力菌株菌株。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 供试菌株 一次融合后的根霉菌株，来自于万里学院 07 级的郭巍同学。实验前先进行菌株的活化，之后才能进行接种。 2.1.2 培养基 马铃薯蔗糖培养基 (PDA)：取一定量的马铃薯，洗净、去皮、切块，在电子天平上称取 100g 左右，与 500mL 的蒸馏水一起放入锅中，煮沸 20min，用四层纱布过滤后取浸出液，加入蔗糖 10g，琼脂 10g，溶解后加蒸馏水至 500mL。 马铃薯液体培养基 (PSA+蛋白胨 )：取一定 量的马铃薯、洗净、去皮
12、、切块，称取 100g左右放入煮沸的蒸馏水中 (约 500mL 左右 )， 20min 后取浸出液，加入蔗糖 10g，牛肉浸膏 2.5g，蛋白胨 2.5g，定容为 500mL 的液体培养基，而马铃薯固体培养基是在此基础上添加琼脂粉。 马铃薯再生培养基：马铃薯 200g 洗净去皮，之后切片放入沸水中煮 20min，最后得到其浸出液，加 4.5g 琼脂 (最终溶液含量为 0.9%)，加入葡萄糖 20g 以及甘露醇和无菌水配制成 1L 的甘露醇浓度为 0.6mol/L 的混合溶液。 酪蛋白水解培养基： Na2HPO47H201.07g， KH2PO40.36g，酪蛋白 10g琼脂粉 15g，加蒸馏水
13、定容到 1000mL。 以上培养基配置都为自然 pH值条件下于 0.1Mpa条件下灭菌 20min获得 。 2.1.3 主要仪器及 试剂 表 1 实验主要仪器 3 名称 型号 生产厂家 LS 系列立式压力蒸汽灭菌锅 LS-B150L 江阴滨江医疗设备有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9070A 上海精宏实验设备有限公司 显微镜 XS-212 南京江南光学仪器厂 台式离心机 TDL-16G 上海安亭科学仪器厂 智能人工气候箱 RXZ 宁波江南仪器厂 双人单面 超净工作台 SW-CJ-1B(U) 苏州净化设备有限公司制造 电子天平 PL203 梅特勒 -托利多仪器有限公司 恒温培养摇床 HY-
14、1000 长沙湘仪离心机仪器有限公司 数显恒温水浴锅 HH-2 常州国华电器有限公司 表 2 实验主要药品 名称 规格 生产厂家 蜗牛酶 (snailase) 细菌级 上海蓝季科技发展有限公司 溶菌酶 (lysozyme) 细菌级 上海蓝季科技发展有限公司 纤维素酶 细菌级 上海蓝季科技发展有限公司 琼脂粉 细菌级 杭州微生物试剂有限公司 蛋白胨 细菌级 杭州微生 物试剂有限公司 酵母膏 细菌级 杭州微生物试剂有限公司 酪蛋白 细菌级 杭州微生物试剂有限公司 甘露醇 优级纯 国药集团化学试剂有限公司 葡萄糖 优级纯 国药集团化学试剂有限公司 蔗糖 优级纯 上海展云化工有限公司 氯化钠 分析纯
15、无锡市瑞运化工有限公司 续表 2 名称 规格 生产厂家 磷酸二氢钠 化学纯 浙江临平化工试剂厂 磷酸氢二钠 化学纯 上海新华化工厂 无水氯化钙 化学纯 上海市奉贤奉城试剂厂 聚乙二醇 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 4 2.1.4 渗透压稳定剂 渗透压稳定剂种 类：氯化钠，氯化钾，甘露醇，硫酸镁。配制方法：用无菌水配制成 0.8mol/L 的溶液，配制之后都要进行高温高压灭菌，在 0.1MPa， 121 的条件下高温高压灭菌 20min 后备用。渗透压稳定剂必须在无菌条件下使用，每次使用完之后马上封口，尽快放入冰箱，以防杂菌的污染。 2.1.5 酶液的制备 混合酶液由蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶
16、三种酶以一定的浓度混合，用渗透压稳定剂配制而成。酶液的配置要当天配当天用。一是为了防止酶的失活，二是防止对量的估计不足而造成浪费。酶制剂用完之后都要尽快地放入冰箱，这也是为了防止酶的失活。 在称量之前要保证电子天平的水平，还有在箱内放入吸湿硅胶，这是因为酶的高效性只要很少的量就可以酶解，故每次称量的量不多，大多数只要几毫克或几微克，所以由于上述原因，就要做好准备防止称量的人为误差和设备误差而造成的酶制剂的称量不准确，最后造成酶解的不成功。同时酶液的配置。 要在无菌条件下配置防止有杂菌的进入。此外，盛放酶液的容器和吸量用的移液管在使用前必须在 0.1MPa， 121 的条件下高温高压灭菌 20m
17、in，将杂菌除去，使实验误差降到最低。 2.1.6 其他试剂 融合剂： 30%PEG(聚乙二醇 )(MW=6000)， 0.01mol/LCaCl2， pH7.5， 0.25m滤膜除菌。 磷酸盐缓冲液 (PB)：取 0.2mol/LNaH2PO4 溶液 87.7mL 与 0.2mol/LNaH2PO4 溶液13.3mL 混匀， 121 高压蒸汽灭菌 20min，得到 pH值 6.0 的 PB 缓冲液。 2.2 实验方法 2.2.1 菌株活化 在无菌环境下，将已灭菌的 PDA 培养基倾入灭过菌的培养皿中，制成平板；待其冷却凝固后，用无菌接种针蘸取少量保藏的根霉菌种，采用 “三点法 ”点种于平板上
18、，同样蘸取少量保藏的酵母菌种，采用划线法接种于平板上，倒置于 30 恒温培养箱内，培养 3 天。 2.2.2 菌体培养 于无菌室的无菌环境下，在酒精灯火焰旁，将液体培养基分装入灭过菌的培养瓶中并标号。将活化好的菌株接种入已经灭过菌的盛有约 30ml 液体菌丝培养基的摇瓶中 (菌丝大小不限，只要用接种针在培养基表面菌落处轻轻蘸取一下即可，每次接种后接种针5 均要在酒精灯火焰中灭菌并冷却才可挑取下一个菌丝 )。之后放入 30 ，转速为120rad/min 的摇床内培养 18h。培养到这个时候的菌丝还没有大的菌丝团，菌丝团的大小刚好（酶的进入阻碍不大）还没有孢子的生成，培养 20h 以后的菌丝开始产
19、生孢子 ，会干扰了原生质体的计数，因为显微镜下看起来原生质体的大小和孢子相近，容易造成混淆。所以培养 18h 的菌丝最好，有利于酶解。 2.2.3 酶系和酶浓度的确定 由于丝状真菌细胞壁组成较为复杂，要获得较高的原生质体数，选择适宜的裂解酶系统非常重要，使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好 8，本实验选取了浓度作为水平，酶的种类作为因素，制定了正交试验因素水平表 (见表 3)。 培养得根霉菌丝后，经离心与培养液分离，根据表 4 中设计的比例配制混合酶液，并编号。称取 9 份等量的菌丝体，对应编号中加入 相应的混合酶液，各酶液的体积是等量的。以下步骤如 2.2.6，制
20、得原生质体悬液，血球计数板计数。酵母菌体做同样处理。 表 3 因素水平 因素水平 纤维素酶（ A） 蜗牛酶（ B） 溶菌酶（ C） 1 2 3 0.1% 0.3% 0.6% 0.1% 0.3% 0.6% 0.1% 0.3% 0.6% 2.2.4 渗透压稳定剂的确定 根据渗透压稳定剂的性质，选择无机盐类渗透压稳定剂 NaCl、 KCl、 MgSO4 和糖类渗透压稳定剂甘露醇，设置 0.8mol/L 浓度。 培养得根霉菌丝后，菌丝经离心与培养液分离，称取 5 份等量的菌丝体，将离心管编号为 1、 2、 3、 4 和无菌水对照，选用蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶浓度分别为 0.1%、0.6%、 0.3%作为酶解系统，加入以 0.8mol/L 的 NaCl、 KCl、甘露醇、 MgSO4 溶液和无菌水作为渗透压稳定剂配制的混合酶液，各酶液的体积是等量的。以下步骤如 2.2.6，制得原生质体悬液，血球计数板计数。酵母菌体做同样处理。
