1、 本科毕业论文 （ 20 届） 营养活性肽的分离纯化工艺 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 1 ABSTRACT 2 1 前言 3 1.1 肽营养的提出 3 1.2 生物活性肽的制备方法 4 1.3 生物活性肽的分离分析方法 5 1.4 营养活性肽的生理功能 6 2 实验材料与方法 7 2.1 实验材料 7 2.2 实验试剂 7 2.3 实验仪器 7 2.4 实验方法 7 3 超滤条件的确定 8 3.1 超滤时间 对膜通透量的影响 8 3.2 超滤压力对膜通透量的 影响 8 3.3 浓度对膜通透量的 影响 9 3.4 搅拌速度对膜
2、通透量的 影响 10 3.5 酶解液的分段收集 10 4 结论 11 参考文献 11 致谢 13 附录 英 文翻译 14 附录 英 文原文 24 1 摘要 本文主要以金枪鱼酶解液为原料，采用超滤技术对金枪鱼酶解液进行分离纯化，通过测定膜通透量来衡量分离纯化的程度，同时研究超滤时间，超滤压力，酶解液浓度和搅拌器转速对膜通透量的影响。 依次采用截留分子量为 10kDa 和 5kDa 大小 的超滤膜对酶解液进行分段分离 ，得出的结果为采用 5 kDa 和 10kDa 大小的膜超滤的最适条件均为： 操作压力为 30psi、超滤时间为 40min、酶解液浓 度为 10%、搅拌器转速为 90r/min。
3、分段收集得到 10kDa、 5 kDa 10kDa、 10kDa, 5 kDa 10kDa, 5kDa of three components, the yield was 19.23%, 30.71%, 7.69% . Key words Nutritional peptides;ultrafiltration; membrane permeability 3 1 前言 营养活性肽 (Bioactive Peptides)是具有特殊生理功能的肽 ， 它是蛋白质中 20 个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形、环行结构的不同肽类的总称 ， 是源于蛋白质的多功能最复杂的化合物。
4、以前 ， 人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径。近年来 ， 科学家经研究发现 ， 蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收 ， 比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用。这是肽研究理论和实践的重大突破 1。 营养活性多肽的提出经历了一个漫长的过程。自 1902 年伦敦大学医学院的 Buyliss 和 Star首次发现活性多肽物质 促胰激素以来 2，人们对肽的研究逐渐深入，世界上许多科学家都在致力于活性多肽物质的研究。营养活性肽的分离纯化方法有很多种，有盐析法，色谱法，电泳法，超滤法等。其中又以超滤法最为常用。 超滤技术由于具有通量高、操作条件温和、易于放大等特点，特别适合生物过程及生物
5、活性大分子的分离。在生物技术领域，超滤技术目前已广泛应用于生物产品的固液分离、缓冲液置换分级 (fractionation)、脱盐及浓缩。特别是随着膜性能的提高、组件的标准化、膜清洗技术的完善以及自动控制技术的发展，超滤技术已经成熟并在生物产业中得到愈来愈广泛的应用。 超滤 (UF)是根据筛分原理，以一定的压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂或较小分子物质的操作。在一定的压力差下溶剂或小分子量的物质可以透过膜孔，而大分子物质及细微颗粒却被截留以达到分离目的。超滤的分离范围为分子量介于 500500000Da 的大分子和胶体颗粒，相应的粒径为 120nm。最近研究表明，除了膜孔径大小，膜表面电荷与
6、带电溶质之间的静电相互作用也可以增强 膜的分离效果。 在生物技术领域，超滤主要应用于发酵液的澄清 (固液分离 )、生物产品的精制 (如浓缩、脱盐等 )和蛋白质的分离纯化。近年来随着基因治疗和 DNA 疫苗的发展，超滤也逐渐应用于质粒 DNA 的分离纯化。 1.1 肽营养的提出 早在 1921年 Boegland就提出了肽转运的可能性 ， 随后 Newey等 (1960)研究发现 ,蛋白质在小肠内的消化产物除了氨基酸 ， 还有大量的小肽 ， 并且肽可完整进入肠黏膜细胞 ， 并在黏膜细胞中进一步水解成氨基酸 ， 而后以氨基酸形式进入血液循环 3。大量研究表明 ， 肽是生命活动中不可缺少的物质 ,影
7、 响生物体内许多重要的生理生化功能 ， 作为神经递质、神经调节因子和激素参与受体介质的信号传导。经近半个世纪的研究 ， 人们对肽的种类、功能和吸收等已有一定认识 ， 并且在生产实践中也得到了初步应用 4。 海洋中的生物种类繁多，资源极其丰富，而且生物链基本健全，再生能力强，每年全球海洋浮游生物的产量约有 5000 亿吨，近十多年来，全世界每年从海洋获取的鱼、虾、贝、藻已达8000 万吨以上 5。 从上世纪 60 年代至今 ， 已发现多达 2000 种的具有重要生理及药理活性的化合物，如海绵多肽、海鞘多肽、海葵多肽、芋螺多肽、海藻多肽、 海兔多肽、海蛇多肽等 6。鱼类是人们最早食用的海洋生物之一
8、，其体内含有丰富的蛋白质成分，营养价值相当高，但从其中开发具有4 保健和药用价值的活性物质的研究却相对较少。 表 1 当前研究较多的活性肽类 研究较多的活性肽类 功能 来源 胶原多肽 抗溃疡、抑制血压升高、促进骨骼形成、促进皮肤胶原代谢、预防和治疗关节炎、改善老年人记忆力等 鱼肉、鱼皮、鱼骨、鱼鳍、鱼鳞、霞水母、深海鲑鱼 conopeptide 抗神经源性痛 Conus 系腹足动物 抗肿瘤 活性肽 抑制肿瘤细胞生长、提高身体免疫力 海鞘、海绵、鲨鱼软 骨、海兔 鲨鱼多肽 对风湿性关节炎有一定的疗效，免 疫功能可得到改善 鲨鱼软骨 抗氧化肽 清除各种自由基，延缓衰老，有些 抗氧化肽还具有抗癌活性
9、 金枪鱼、鳕鱼、鲭鱼、栉孔扇贝、黄鳍舌鳎、牡蛎、从皮氏叫姑鱼、秘鲁鱿鱼、花腹鲭、贻贝、波纹巴非蛤 抗菌肽 杀伤微生物 美洲拟鲽、彩虹鲑鱼、豹鳎、海七鳃鳗、红鳟鱼等海洋鱼类、鲎 降压肽 降低血压 沙丁鱼、带鱼、鳕鱼 多肽毒素 具有很强的麻醉、强心，抗癌、抗 菌和抗病毒作用 攻瑰红绿海葵、海鞘、海绵、 红斑指水母 1.2 生物活性肽的制备方法 生物活性肽的制备方法 很多 ， 归纳起来主要包括以下几种： 从动植物等生物体内分离、纯化出天然活性肽。采用这种方法制得的活性肽 ， 绿色安全，但因活性肽在生物体内的含量甚微，因而规模化提取比较困难，成本也较高 7。 合成法获取，又分为化学合成法和酶合成法。化
10、学合成法，典型的是美国化学家于 1963年创建的固相多肽合成法 8。 此法是指在不溶性树脂上固定带有氨基保护端的氨基酸，利用氨基酸之间的脱水缩合反应实现肽链的延长，而酶合成法则是利用某些蛋白酶可以催化指定氨基酸缩合的特性进行肽链的合成。合成法的操作参数可以人为设定，但合成过程难以 控制，副反应物多，成本高、合成试剂毒性大等，不利于推广应用。 水解法，分为化学水解法和酶解法，化学水解法是利用酸或碱对天然蛋白质进行水解，获取目标多肽。酶解法是通过选用合适的蛋白酶，水解蛋白质的多肽链，使其释放出功能性的肽片段，其一般工艺流程为：蛋白原料 预处理 酶解 灭酶 精制 干燥 成品 检测 ，首先根据原料蛋白
11、的性质，采用合适的方法使蛋白质变性，然后选择适当的蛋白酶，在其最佳条件下水解蛋白并获得水解度高的肽溶液。水解液经灭酶、脱苦、脱盐、浓缩等精制工艺后，再经喷雾干燥，即获得富含生物活性肽的多肽产品 9。酶解制备活性肽的影响因素很多，主要有原料及原料预处理方法、酶种的选择及酶解条件等。单酶水解是常用的酶解方法，但其水解效果通常不太理想，水解率较低，而双酶酶解则因其良好的酶解效果而得到人们的广5 泛应用。吴文龙等 10利用枯草杆菌中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成双酶水解体系对牡蛎肉进行水解，结果表明，每 100g 底物经双酶同时水解后 ， 底物中 -氨基氮的含量高达 102.6mg， 远高于单酶水解的 78
12、.8mg、 86.5mg。 陈敏等 11考察了高效蛋白酶和胰蛋白酶对豆粕粉的水解效果，结果表明，单酶水解液中蛋白质含量均低 于 80%，而双酶水解液中蛋白质含量在 85%左右 ， 双酶间隔加入可以获得最佳水解效果，水解率最高可以达到 17.21%， 高于单酶水解的 8.25%和 12.03%。这可能是因为双酶同时处理时，底物在其中一种酶的作用下，暴露出利于另一种酶水解的位点，从而加速酶解反应或者使反应更彻底。 其他方法。微生物发酵制备活性肽是一种比较新的制备方法，它是利用蛋白酶产生菌产生蛋白酶水解目标蛋白，并对水解产物进行分离纯化制备出活性肽。该法的明显优势在于生产成本低，有些微生物可以直接生
13、产出脱苦的肽，但当前可利用的微生物资源很少，限制了 该法的应用。从基因水平制备活性肽的技术也有研究，但还不成熟 12。 1.3 生物活性肽的分离分析方法 采用何种分离纯化方法主要取决于所提取组分的组织材料和所要提取物的性质。对于蛋白质或多肽 ， 提取分离方法有盐析法、超滤法、高效液相色谱法和电泳法等 13。 1.3.1 盐析法 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称盐析。其基本原理是 :蛋白质或肽分子中的 -COOH、 -NH2和 -OH都是亲水基因 ， 这些基因与水相互作用形成水化层 ， 包围于蛋白质分子周围形成的 1100nm颗粒的亲水胶体 ， 削弱了蛋白质分子间 的作用力 ， 蛋
14、白质表面极性基因越多 ， 水化层越厚 ， 蛋白质分子与溶剂分子之间亲和力越大 ， 因而溶解度也越大 14。亲水胶体在水中的稳定因素是电荷和水膜 ， 因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子或肽的亲水性 ，所以加入大量中性盐后 ， 夺走了水分子 ， 破坏了膜 ,暴露出疏水区域 ， 同时又中和电荷 ， 破坏了亲水胶体 ， 蛋白质分子即形成沉淀 15。这是传统的分离提纯方法。盐析法的优点是操作简便 ， 成本低廉 ， 对蛋白质或肽有保护作用 ， 重复性好。 1.3.2 高效液相色谱 (HPLC) HPLC是 19世纪 60年代末发展起来的新型分离分析技术 ， 它的出 现为肽类物质的分离提供了有利手段。近年来
15、， HPLC被成功用来分离、鉴定和纯化合成肽等。根据样品在固定相和流动相分离过程的物理化学原理可分离附色谱、分配色谱 (正相、反相 )、离子交换色谱、凝胶色谱和反相色谱等。 HPLC分离效果好 ， 速度快 ， 样品容量大 ， 回收率高 ， 已成为生物多肽的主要分离纯化方法 16 。 1.3.3 电泳法 电泳就是利用在电场作用下 ， 由于待分离样品中各种分子带电性质 ， 以及分子本身大小、形状等性质的差异 ， 使带电分子产生不同的迁移速度 ， 从而对样品进行分离鉴定或提纯的技术 17。 1.3.4 超滤 法 超滤 (UF)是根据筛分原理，以一定的压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂或较小分子物6
16、质的操作。在一定的压力差下溶剂或小分子量的物质可以透过膜孔，而大分子物质及细微颗粒却被截留以达到分离目的。超滤的分离范围为分子量介于 500500000Da的大分子和胶体颗粒，相应的粒径为 120nm。 超滤技术具有耗能低，分离过程中物质不发生相变，分离效果好，操作简便，无副作用，无二次污染，分离产物易于回收等优点，已被广泛应用于工业生产中的产品分离，纯化等。 盐析法、电泳 法 等传统方法均需添加一些化学物质，可能会影响多肽的活 性，还可能造成环境污染。液相色谱法需要精密的仪器，操作比较繁琐，且对操作人员的技能要求比较高。 与上述方法相比，超滤技术有下列特点： 1、超滤过程是在常温下进行，不会
17、导致热敏性物质失活。 2、超滤是通过外在施压来实现大小分子的分离和浓缩，期间不发生相的变化，不需要添加任何化学物质，也不需要人为加热，能源消耗低，对环境友好。 3、超滤技术通过选用合适的超滤膜即可对目标分子量的成分进行分离，且分离效率高，尤其适用于有效成分初始浓度较低的稀溶液，但最终富集得到的浓缩液的浓度也不高，一般只有 10% 50。 4、超 滤分离的装置简单、操作方便、分离的时间短、易于控制和维护。 5、超滤不适用于高浓度溶液中的成分分离，因超滤膜的孔径很小，被截留的大分子容易在膜表面聚集，即发生浓差极化现象，使膜的分离效率降低。 1.4 营养活性肽的生理功能 1.4.1 营养功能 小肽和
18、游离氨基酸在动物体内具有相互独立的吸收机制，二者互不干扰。与游离氨基酸相比，小肽转运系统具有速度快、耗能低、不易饱和等特点 18。 1.4.2 调节血压 体内血压的调节是在肾素 -血管紧张素系统中，高血压蛋白原酶水解血管紧张素原，释放出无升压活性的十肽血管紧张 素；血管紧张素转化酶水解血管紧张素得到八肽的血管紧张素，则能引起血管收缩，造成高血压。另外，血管紧张素还可抑制血管舒缓激肽的活性并刺激肾上腺皮质释放醛固酮，而血管舒缓激肽可以舒张血管，使血压降低，醛甾酮的作用则是减少肾脏对水分和盐的排泄，增加细胞外液量和血浆量，加大静脉回流量，间接引起高血压 19。 1.4.3 免疫调节 一般具有增强免
19、疫功能的活性肽叫免疫活性肽。免疫活性肽是继牛乳提取物中发现阿片样肽后第 2个被发现的生物活性肽，也是人乳蛋白中第 1个被发现的生物活性肽 20。研究表明，该肽不仅影响 机体免疫系统，同时也影响免疫反应和细胞功能。利用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解牛乳酪蛋白可分离出具有免疫活性的免疫肽，即三肽 Leu-Leu-Tyr酪蛋白（ -酪蛋白的C末端）和六肽 Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Tyr（ -酪蛋白的 C末端） 21。该活性肽的主要功能是激活 B淋巴细胞和 T淋巴细胞，增强其吞噬能力，从而使人体产生对细菌和病毒的直接抗性。 1.4.4 调节风味 7 风味肽包括甜味肽、酸味肽、咸味肽和苦味肽
20、等，这些肽类添加到饲料中，能明显改变饲料原有的口感。蛋白质中的谷氨酸本身不是一种风味增强剂 ，但在某些肽中的谷氨酸则具有增强风味的特征 22。 1.4.5 抗氧化 天然抗氧化肽是最近被广泛研究的一类活性肽，具有较强的抗氧化活性和很高的安全性。研究表明，以一定的蛋白质为底物，在适宜的酶作用下可产生小分子抗氧化肽，其分子质量小，易消化吸收，安全可靠，不会引起过敏反应，具有良好的开发利用前景 23。国内外研究人员已从不同来源的蛋白质中提取到各种具有抗氧化活性的肽类物质，研究最多的是肌肽和谷胱甘肽等少数肽 24。 2 实验材料与方法 2.1 实验材料 金枪鱼碎 鱼 肉酶解液。 2.2 实验试剂 试剂
21、规格 厂家 氢氧化钠 分析纯 A.R 南京化学试剂有限公司 甲醛溶液 分析纯 A.R 国药化学实际有限公司 2.3 实验仪器 仪器名称 厂家 密理博小型 切向流超滤装置 美国密理博公司 Pellicon XL 板式膜包 （ 5000Da， 10000Da） 美国密理博公司 0.45m 微滤膜 上海新亚净化器厂 2.4 实验方法 2.4.1 超滤原理 超滤技术是通过超滤膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离。如图 1 所示，当原料液槽中的液体混合物在输液泵的作用下流经超滤膜包的超滤膜表面时，小分子溶质透过膜（称为超滤液），进入收集槽，而大分子物质则被截留，使原液中大分子浓度逐渐提高（称为浓缩液），
22、从而实现大、小分子的分离、浓缩、纯化的目的 25。为了实现大小分子的充分分离，被截留的溶液在回流阀门的作用下，流回原料液槽， 重复上述过程。 2.4.2 超滤条件的优化 真空抽滤去除酶解液中的固形物，采用 0.45m 的滤膜过滤酶解液，然后加超纯水稀释酶解液，并调节其 pH。稀释的酶解液经过 10 kDa 滤膜，收集截留液得到分子量大于 10kDa 组分 ，然后渗透液再过 5 kDa 滤膜，收集截留液得到分子量在 5 kDa 10 kDa 的组分 ，透过的渗透液为分子量小于 5 kDa 的组分 ，利用膜通透量指标来优化超滤条件 26。膜通透量指的是单位时间内、单位膜表面积通过膜表面的液体的量，
23、膜通透量（ J）按照下式计算： 8 / ( )J V A t 其中， J 为膜通透量，单位为 L/(m2h)； V 为滤过液体积，单位为 L； A 为膜的有效面积，单位为 m2； t 为超滤时间，单位为 h。 1，原料液槽 2，输液泵 3，压力表 4，收集装置 5，超滤膜包 6，回流阀门 7，收集液阀门 图 1 超滤系统工作原理图 3 超滤条件的确定 3.1 超滤时间对膜通透量的影响 超滤时间越长 ， 超滤膜表面的浓差极化现象越严重，最后导致超滤膜完全失去效用。为了探究最佳操作时间，我们比较了不同超滤时间下膜通透量变化，结果如图 2 所示 。 图 2 超滤时间对膜通透量的影响 由图 2 可知，
24、两种膜在超滤进行的前 30min 中呈现快速下降的趋势， 5kDa、 10kDa 的膜分别在 30min、 40min 以后，膜通 透量开始趋于稳定。虽然本试验采用的是切向流的超滤技术，但运行一段时间后，膜表面仍然出现浓差极化现象，可能是膜表面凝胶层增厚以及酶解液中大分子物质由于重力作用沉积在膜表面所致，使得膜通透量降低。在 40min 时，膜通透量维持在一个较低水平上，此时需要对膜进行清洗，以保证膜的正常使用。从提高原料利用率以及膜效能角度考虑，超滤循环控制在 40min 为宜。 3. 2 超滤压力对膜通透量的影响 超滤是以膜两侧的压力差为驱动力来实现物质的分离与浓缩，增大压力可以在一定程度上使膜通透量增加，从而提高生产效率，但压力过大又会产生 严重的浓差极化现象，影响超
