1、 本科毕业论文 （ 20 届） 5,7-二羟基二氢黄酮化合物合成及抗抑郁作用研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 2 - 目录 1.前言 . 3 1.1 概述 . 3 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 5 2.1 实验材料 : . 5 2.2 主要仪器 . 5 2.3 主要试剂 . 5 3 实验方法 . 6 3.1 合成实验 . 6 3.2. 抗抑郁药理实验方法： . 7 4 实验结果 . 7 5 讨论 . 8 6 小结 . 10 参考文献： . 10 1 摘要 目的 以黄酮类化合物芹菜素（ Apigenin） 为先导化合物，按照新药设计的原理设
2、计合成 5， 7-二羟基二氢黄酮类化合物，为寻找到抗抑郁活性好，毒副作用低的化合物 ，为新型抗抑郁药的研制提供实验理论依据。 方法 以芹菜素为先导化合物，设计 5,7-二羟基二氢黄酮化合物（化合物 4）合成路线，通过 小鼠强迫游泳实验 对所合成化合物进行 抗抑郁 药理活性筛选。结果 采用红外光谱、核磁共振氢谱和质谱确定了化学结构 。 经药理活性筛选，结果显示，化合物 4 与模型组相比无 显著的 抗抑郁活性（ p0.05） 。 结论 合成路线方便，产物纯度较好。 关键词 二氢黄酮；合成；抗抑郁； 2 Synthesis of 5,7 - dihydroxy flavanone and study
3、 of antidepressant effect Abstract purpose Flavonoid apigenin as a leading compound, according to the principles of design and synthesis of new drug design 5,7 - dihydroxy flavanone compounds, to find a good anti-depressant activity, low toxicity compound, for the new antidepressants Provide experim
4、ental basis for the development theory.Methods Apigenin as a leading compound to design 5,7 - dihydroxy flavanone compound (compound 4) synthetic route, through the forced swimming test in mice of the synthesized compounds were screened for antidepressant pharmacological activity. Results By IR, 1H
5、NMR and mass spectrometry to determine the chemical structure. The bioassay results showed that, compared with the model compound 4 no remarkable antidepressant activity (p 0.05) Conclusion The synthesis route is Convenient and the separation of outcome is easy. Purity of Products is better. Key wor
6、ds flavanone; Synthesis; Antidepressant 3 1.前言 抑郁症是精神病的一种，表现为情绪异常低落， 常有强烈的自杀倾向，并有蜘蛛伸进或躯体性伴随症状。抑郁症发病率很高，几乎每 7个成年人中就有 1个抑郁症患者，因此它被称为精神病学中的 感冒 。据研究，抑郁症患者的自杀率比一般人群高 20倍，社会自杀人群中可能有一半以上是抑郁症患者。目前抑郁 症在世界十大疾病中排位第四，据 WHO 预测，到 2020 年抑郁症将上升为第二大疾病 1 。 抑郁症的出现可能与脑内去甲肾上腺素（ NE）和 5-羟色胺（ 5-HT）浓度的降低有关。抗抑郁药于 20世纪 50年代问世
7、，在此前抑郁性疾病并无合适的药物治疗手段 ,常仰仗 电休克治疗 。 20世纪 50年代以后 ,抗抑郁药已成为抑郁病人的首选治疗手段，很大程度上取代了休克治疗，使需作休克治疗的病人数目 大大减少。 现有的抑郁药，按作用机制可分为去甲肾上腺素重摄取抑制剂（三环类抗抑郁药， TCA），单胺氧化酶抑制剂（ MAOIs） ,选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂（ SSRIs）和其他类。其中，单胺氧化酶抑制剂因毒副作用较大，现已用的很少 2。 第一代经典抗抑郁药包括 单胺氧化酶抑制剂 （ MAOI）和三环类抗抑郁药（ TCA）。 由于新药发展很快，新药层出不穷，如万拉法星、萘法唑酮等， 但目前仍以选择性五羟色胺
8、（ 5-HT）再摄取抑剂为主，临床应用这类药物也最多最广，我们称之为第二代新型抗抑郁药。而某些抗精神病药如 舒必利 、抗焦虑药阿普唑仑、罗拉、丁螺环酮和中枢兴奋药哌甲酯的抗抑郁作用尚存在争议 3。 目前抑郁症主要采用化学药物治疗，传统的抗抑郁如：氯丙咪嗪、阿米替林、丙咪嗪、多虑平、吗氯贝胺、麦普替林等虽在一定程度上控制了抑郁的发作，但是存在着口干、便秘、尿 潴留、视力模糊及眼内压升高等，严重者可产生心脏毒性，尤其是老年患者更易发生，如体位性低血压、心律失常、房室传导阻滞、心力衰竭、心肌梗塞等。而且，应用现有的抗抑郁药物也只有 70%患者可以得到控制。因此，积极开展抗抑郁新药的的研制，寻找长期服
9、用却不出现严重毒副作用，具有高度选择性作用的广谱有效抗抑郁药物具有重要意义。 1.1 概述 1.1.1 黄酮及二氢黄酮 黄酮化合物是广泛存在于植物界中的一类天然物质 , 黄酮类化合物具有清除自由基、抗 氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等作用 4-5。黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（ A-与 B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为 2-苯基色原酮 4 近年来，有关黄酮类化合物的抗抑郁作用陆续有了研究报道，其中对抗抑郁植物药贯叶金丝桃的研究发现，黄酮类化合物在其抗抑郁有效成分中发挥着重要的作用。为此，这些研究结果表明黄酮类化合物可能
10、是一类安全有效的抗抑郁先导化合物 6。 二氢黄酮是自然界中存在的一类多酚类物质 ,属黄酮类化合物。而二氢黄酮类化合物作为一类微量黄酮类化合物 , 在自然界分布相对有限 ,对其相关研究报道较少，其合成 、结构与活性之间的联系未见系统深入研究。 1.1.2 抗抑郁药 -氟西汀 氟西汀（ Fluoxetine）是一种 选择性血清再吸收抑制剂 （ SSRI）型的 抗抑郁药 ，其药物形态为盐酸氟西汀（ Fluoxetine hydrochloride） ，商品名为 “ 百忧解 ” 或 “ 百优解 ”（ Prozac）。在临床上用于成人抑郁症、神经性贪食症和 强迫症 的治疗，还用于治疗具有或不具有广场恐惧
11、症的惊恐症。 尽管现在已有不少较新的药物，氟西汀在临床应用中依然广受欢迎。在 2007年， 美国 各医疗机构总共开出超过 2.22亿次氟西汀的处方，这使得氟西汀是美国市场上第三常用抗抑郁药物（仅位于 舍曲林 和依地普仑之后）。而在 中国 ，百优解也曾经是处方量最大的抗抑郁药物。 氟西汀通过抑制神经突触细胞对神经递质血清素的再吸收以增加细胞外可以和突触后受体结合的血清素水平。而对其它 受体，如 -肾上腺素能、 -肾上腺素能、 5-羟色胺能、多巴胺能等，氟西汀则几乎没有结合力。 氟西汀口服后从胃肠道吸收良好，进食不影响其生物利用度。吸收后与血浆蛋白大量结合，分布广泛。服药数周后达到稳态血浆浓度。
12、氟西汀基本由肝脏代谢，通过去甲基化作用生成活性代谢产物去甲氟西汀（ demethylfluoxetine）。氟西汀的消除半衰期为 4-6天，去甲氟西汀则为 4-16天。主要经肾脏排泄。由于可分泌至母乳，所以建议向孕妇及哺乳期妇女处方要谨慎。 在多项针对抑郁症患者进行的安慰剂和活性药物对照临床 试验中，以汉密顿抑郁量表（ HAM-D）作为评估工具，已经证实氟西汀对抑郁症的疗效明显优于安慰剂。针对强迫症和神经性厌食症患者的试验也有类似的结论。 1.1.3 先导化合物 -芹菜素 在寻找新的抗抑郁药的先导化合物时，发现黄酮类化合物芹菜素（ Apigenin）不仅具有良好的抗癌和抗 HIV的活性，还具有
13、较好的抗抑郁活性，但有致癌活性。 OH OO HOO HABCOH OO HOO H234561 2 3 4 5 6 78Apigenin （先导化合物） 为了寻找到抗抑郁活性更好，毒副作用更低的化合物，以 I（ 2,3二氢芹菜素）为先导化合物， A,C 环不变，在 B 环上增加，减少，或取代不同的基团，合成并测试其药理活性。本文研究设计合成的目标化合物，为未见文献报道的新化合物，结构经核磁共振氢谱确证。抗抑郁药理实验采用国际上公认的美国国立卫生院公布的抗抑郁药开发程序。 5 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 : 2.1.1 实验动物 动物昆明雄性小鼠 :体质量 (22 2) g
14、 ，由延边大学 医学部实验动物科提供，饲养在 25 条件下，实验前稳定 3 d，自由进食饮水 7。 2.1.2 实验药物 药物阳性对照药 :盐酸氟西汀 (由 美国 礼来 公司 生产 )，化合物由延边大学药学院提供，经 1H NMR， 13C NMR和 MS确证结构与参考文献一致。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 精密天平 BS323S 赛多利斯科学仪器有限公司 旋转蒸发仪 RE-2000 上海亚荣生化仪器厂 可见光分光光度计 722 上海精密科技有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9023A 上海亚荣生化仪器厂 恒温水浴锅 HH-S 巩义市予华仪器责任有限公司 磁力搅拌器 85-2
15、常州国华电器有限公司 硅胶预制板 H 国药集团化学试剂有限公司 变压器 TOGC2-3 环宇集团有限公司 循环水式多用真空泵 SHB-IIIA 河南省太康科教器材厂 核磁共振仪 BRUKER AV-300 上海精密科技有限公司 PH-试纸 中国上海三爱思试剂有限公司 圆底烧瓶 50ml,100ml 中国医药（集团）上海化学试剂公司 锥形瓶 100ml,250ml 中国医药（集团）上海化学试剂公司 量筒 10ml,100ml,250ml 中国医药（集团）上海化学试剂公司 硅胶柱 2.3 主要试剂 试剂（规格） 厂家 丙酮（分 析纯 AP） 国药集团化学试剂有限公司 碳酸钾（分析纯 A.R） 国药
16、集团化学试剂有限公司 石油醚（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 乙酸乙酯（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 无水碳酸钠（分析纯 A.R） 宁波市化学试剂厂 无 水乙酸钠（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 6 甲醇（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 氯甲基甲醚（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 2,4,6-三羟基苯乙酮（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限 公司 氢氧化钾（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 浓盐酸（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 二甲基硅油（分析纯 A.
17、R） 阿拉丁化学试剂有限公司 氯化钙（分析纯 A.R） 中国泗联化工厂 柱层层析硅胶 100200 目（分析纯 A.R） 青岛海洋化工厂分厂 蒸馏水（分析纯 A.R） 自备 3 实验方法 3.1 合成实验 合成路线见 Scheme18-13： Scheme1 3.1.1 2-羟基 -4,6-二甲氧基甲氧基苯乙酮（ 1）的合成 将 4.5g（ 29.6mmol） 2,4,6-三羟基苯乙酮， 8.46 g 无水 K2CO3(61.3mmol）， 73.2ml 无水丙酮放入 100mL 两口瓶中，在油浴 50 条件下，剧烈搅拌一个小时后。慢慢滴加用 5ml 丙酮稀释的 ClCH2OCH3 (78mm
18、ol） 6ml， TLC 监测反 应到原料点消失后，过滤用少量丙酮淋洗残杂，旋干滤液，以石油醚 /乙酸乙酯 /V(石油醚） /V（乙酸乙酯） =10:1 过柱得无色油状液体 2-羟基-4,6-二甲氧基甲氧基苯乙酮 5.68g，产率 75%。 3.1.2 （ 2 -羟基 -4， 6 -二甲氧甲氧基苯基 )-1-苯基 -2-丙烯 -1-酮（ 2）的合成 在氮气流保护下， 100mL 两口圆底烧瓶中加入 2.48g（ 9.7mmol） 2-羟基 -4， 6-二甲氧甲氧基苯乙酮 1.03 g（ 9.7mmol）苯甲醛，在搅拌下滴加由 83mL 无水乙醇和 7.5gKOH 配成的溶液（ 10%），室温
19、搅拌 18h，析出大量的黄色固体， TLC 跟踪反应到原料点和产物点浓度平衡，停止反应，抽滤得黄色固体物质，用少量水洗涤后，用乙醇重结晶得到黄色针状结晶（ 2-羟7 基 -4， 6-二甲氧甲氧基苯基 )-1-苯基 -2-丙烯 -1-酮 2.67g，产率： 80%， m.p.7577 。 3.1.3 5,7-二甲氧甲氧基二氢黄酮（ 3）的合成 在 50ml 圆底烧瓶中加入（ 2-羟基 -4,6-二甲氧甲氧基苯基 )-1-苯基 -2-丙烯 -1-酮 0.66g,乙酸钠 0.66g 和无水乙醇 10ml 回流反应 24 小时。回流溶解后， TLC 跟踪反应直到 原料点消失，停止反应。冷却析出深黄色针
20、状结晶 5,7-甲氧甲氧基二氢黄酮 0.56g，产率： 85%。 3.1.4 5,7-二羟基二氢黄酮（ 4）的合成 0.56g（ 1.63mmol） 5,7-二甲氧甲氧基二氢黄酮放置于 100mL 的两口瓶中后，加入 25mL甲醇，回流溶解后，滴加 3mL 稀盐酸（ 5mol/L),滴完后， TLC 跟踪反应直到原料点消失，停止反应。冷却析出微细深黄色针状结晶（经 TLC 分析很纯），抽滤后，抽真空干燥后得到黄色固体 5,7-二羟基二氢黄酮 0.27g，产率 65%， m.p.168-170 1H-NMR (DMSO-d6, ppm): 2.78 (1H, dd, J = 17.1, 2.8
21、Hz, 3-H), 3.24 (1H, dd, J = 12.8, 17.1 Hz, 3-H), 5.59 (1H, dd, J = 12.8, 2.8 Hz, 2-H), 5.90-7.53 (m, 7H, Ar-H), 10.83 (s, H, -OH), 12.13 (s, H, -OH); IR (KBr) cm : 3116, 1639; MS m/z: 257 M + 1. 3.2. 抗抑郁药理实验方 法： 3.2.1 小鼠强迫游泳实验： 参见（ Porsolt RD et al, Arch Int Pharmaeodyn Ther,1977）等报道的方法，腹腔注射给药 30 分钟
22、后，将小鼠放入 XSC 小鼠恒温游泳仪内 (水深 10cm、直径 34cm的桶内，水温 252oC)，观察 6 分钟内小鼠游泳情况，统计小鼠后 4 分钟内游泳累积不动时间(不动即小鼠停止挣扎或小鼠呈漂浮状态，小鼠四肢有轻微动作以保持头部在水面 )，与模型组比较。 4 实验结果 药理实验结果见 Table 1 Table 1: Antidepressant activities of the compounds Compounds R Dose (mg/kg) Antidepressant activities Duration of immobility Change from control
23、 (s)(meanS.E.M.) (%) - 10 102.415.3 * -27.38 4 4-H 10 121.617.1 -13.76 Fluoxetine 10 70.35.8 * -50.14 Control 141.014.2 Values represent the mean S.E.M. ( n = 10). *Significantly compared to control (Dunnets test: p 0.05, *p 0.05）。 8 5 讨论 5.1 合成 1的反应属于酚的成醚反应，在 K2CO3溶液形成的碱性条件下，酚羟基解离成酚盐负离子，与氯甲基甲醚发生亲 核
24、取代反应，但是 2位羟基没有发生取代，因为 2位羟基与羰基形成分子内氢键，比较稳定，不容易被取代。由于氯甲基甲醚的活性较强，因此此步反应时间较短，产率较高。 5.2 合成 2 的反应属于醛和酮的定向缩合反应（ orientation aldol condensation） 14，在 10%KOH形成碱性条件下，由于苯甲醛没有 氢，因此 I 羰基旁边的甲基失去一个 H,形成碳负离子，加成后失水，便形成产物 2。溶液的碱性不能太强，也不能太弱。碱性太强，则苯甲醛发生cannizzaro 反应，发生分子间氧化还原，结果一分子苯甲醛 被氧化成为苯甲酸，一分子苯甲醛还原成为苯甲醇。如果碱性太弱，产物不能
25、失水完全，会以加成物的形式出现。此外，反应还会产生少量 1 与 1 的加成产物，因此，此步的碱性强度，加热温度，加热时间是此步反应的关键。 5.3 合成 3 的反应属于分子内加成反应。由于产物 II 的羰基与双键形成 - 共轭，因此氧原子上的电子密度下降，与 2 位酚羟基不再形成氢键，所以在醋酸钠溶液的弱碱性条件下， 2位酚羟基变为负离子，进攻双键，形成一个含氧的六元环结构，即产物 3。由于该反应是分子内加成反应，可视为反应物有效浓度极高，所以产率较高，回流 24 小 时产率可达 85%。 5.4 合成 4 的反应属于典型的强酸催化的醚的水解反应，产物为 5,7-二羟基二氢黄酮，氯甲基甲醚的作
26、用是保护 4,6 位的酚羟基，并且巧妙的利用分子内氢键，使得 2 位酚羟基不受影响，继续反应。最终脱去保护，酚羟基重现，得到产物 4。 一般来说，醚用氢碘酸加热处理，用盐酸也可以，但是没有氢碘酸活泼，所以需用浓酸和较高的温度 15。 由于盐酸在加热过程中， HCl 分子不断挥发，导致盐酸浓度下降，所以这一步往往要经过 24 小时 ,产率为 65%。 5.5 小鼠强迫游泳实验 (FST)是由 Porsolt 与 1977 年首 先提出，该实验 提供了无法回避的压迫环境 , 实验中 小鼠最初表现为挣扎、试图逃脱，一段时间后 小鼠所体现的不动状态 , 反映了一种被称为 “ 行为绝望和扭曲 ” 或 “ 对强压环境适应的失败 ” 状态。这种经典的模型对绝大多数抗抑郁药敏感 , 不同作用机制的抗抑郁药可选择性缩短小鼠强迫游泳的时间，提高对应激的耐受性。该模型 操作简单 、 快捷 ， 被广泛应用于该类药物的初筛 16-17。 5.6 本实验采用此模型对目标化合物进行了初步抗抑郁活性筛选。实验结果显示 , 在 10 m g /kg 剂量下，小鼠持续不动时间为 121.61 7.1s， p0.05, 化合物 4 与模型组相比无显著的抗抑郁活性。 5,7-二羟基二氢黄酮的结构式如下：
