1、 本科毕业论文 （ 20 届） 乌梅等提取物的抑菌活性研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 2 - 目录 摘要 . 错误 !未定义书签。 Abstrac t . . 2 1 前言 . 3 2 实验材料 主要试剂与仪器 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.2 主 要试剂 . 4 2.3 仪器 . 5 2.4 实验菌种 . . 5 3 实验方法 . 5 3.1 粗提物的制备 . 5 3.2 抑菌性的测定 . 5 3.2.1 培养基的制备 . 5 3.2.2 菌悬液的制备 . 6 3.2.3 平板的制备 . 6 3.2.4 实验菌种的活化 . 6 3
2、.2.5 琼脂平板孔穴法 （ K-B 法） . 6 3.2.6 抑菌圈的测定 . 6 3.2.7 最低抑菌浓度（ MIC）的测定 . 7 3.3 乙醚的最佳提取工艺 . 7 3.4 乌梅 提取物稳定性的研究 . 7 3.4.1 温度对 乌梅 提取物稳定性的研究 . 7 3.4.2 pH 值对 乌梅 提取物稳定性的研究 . 8 3.4.3 光对 乌梅 提取物稳定性的研究 . 8 4 实验结果与讨论 . . 8 4.1 乙醚最佳提取工艺的优化 . 8 4.2 不同提取工艺的抑菌结果 . 9 4.3 最低抑菌浓度的测定结果 . . 9 4.4 稳定性研究结果 . 10 4.4.1 温度对 乌梅 提取
3、物稳定性的研究结果 . 10 4.4.2 pH 对 乌梅 提取物稳定性的研究结果 . 10 4.4.3 光照对 乌梅 提取物稳定性的研究结果 .11 5 小结 .11 参考文献 . .12 致谢 . .13 - 3 - 摘要 ： 本文将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 副溶血性弧菌 作为供试菌种，研究了 乌梅 的不同提取工艺以及不同提取工艺提取物抑菌活性大小、 乙醚 提取物的 最低抑菌浓度和 PH 值、光照时间、温度等因素对 乌梅 乙醇提取物稳定性的研究。结果表明 :乌梅 提取物对三种供试菌种都有一定的抑菌活性，且抑菌活性大小为： 副溶血性弧菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌。乙醚 提取物对供试菌的最低抑
4、菌浓度分别 0.1、 0.05、 0.025。 关键词 : 乌梅； 提取物；抑菌活性 ；最低抑菌浓度 - 4 - Fuctus Mume extract antibacterial activity study Abstract In this paper, E. coli, Staphylococcus aureus, Bibrio Parahemolyticus as a test for bacteria,Fuctus Mume studied the extraction process, as well as different extraction process of diffe
5、rent extracts of the size of antibacterial activity, ethyl ether extract of the minimum inhibitory concentration and PH value , illumination time, temperature and other factors on Fuctus Mume L. ethanol extract of the stability studies. The results showed that: Fuctus Mume extract on the three strai
6、ns tested have a certain degree of antibacterial activity and antibacterial activity of the size as follows: Bibrio Parahemolyticus E. coli S. aureus. Ether extract of the bacteria tested, respectively, the minimum inhibitory concentration 0.1、 0.05、 0.025。 Key words Fuctus Mume ;Extract ;Antibacter
7、ial activity ;MIC - 5 - 1 前言 乌梅 (Fuctus Mume)是由蔷薇科植物梅 Prunusmume （ Sieb.） Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果实加工而成。始载于神农本草经，列为中品。乌梅性平，味酸涩，归肝、脾、肺、大肠经，具有敛肺涩肠、 生津止渴、驱虫止痢的功效。它含有丰富的有机酸。如柠檬酸、苹果酸、草酸、乳酸、琥珀酸、焦精谷氨酸、甲酸、丙酸、乙酸、延胡索酸等，其中以柠檬酸和苹果酸含量最高。此外，乌梅还含黄酮 、 萜类、甾醇、脂类、挥发油、生物碱、糖类等化学成分。 乌梅是一味开发前景广泛的中药品种，有相当大的挖掘探讨的潜力。目前国内外许多科研人士
8、已从药理作用角度研究，总结出其以下几点作用： （ 1）驱虫作用 实验已证实，乌梅可使蛔虫活动增强且可使大部分蛔虫从引流胆囊中后退。这与乌梅具有收缩胆囊作用，并可增加胆汁分泌、使胆汁趋于酸性和松弛胆道口括约肌的作用有关。 （ 2）对平滑肌的作用 乌梅煎液能增强豚鼠离体膀胱逼尿肌肌条的张力，增加膀胱逼尿肌肌条的收缩频率和收缩波平均振幅，其作用机理可能与兴奋细胞膜膜上 L 型 Ca2+通道作用有关。乌梅对豚鼠离体胆囊的作用表现为双向性反应，即低浓度乌梅对胆囊肌条表现为抑制作用，当乌梅累积至一定浓度时，对胆囊肌条的张力呈现为先降低后增高的双向性反应。 （ 3）抗肿瘤作用 乌梅煎剂对小鼠肉瘤 S180
9、艾氏胶水瘤有抑制作用，体外试验对人子宫颈瘤 JTC-2s 株的抑制率在 90以上。体外抗肿瘤及体外免疫调节试验结果表明，乌梅水提液、 醇提液具有抑制人原始巨核白血病细胞和人早幼粒白血病细胞生长的作用，对这两种细胞的克隆形成都有不同程度的抑制作用，呈一定的量效关系。乌梅对 HL-40 细胞的作用机制之一是抑制了细胞 DNA 合成，并使细胞停滞于 G2 M 期。低浓度乌梅水提液和醇提液对小鼠免疫器官和体液免疫无明显影响，而高浓度（ 10g kg-1）乌梅水提液则能明显减轻小鼠胸腺、脾脏、肝脏的重量，但对体液免疫影响不明显。提示乌梅抗肿瘤作用通过整体免疫调节而达到的可能性较小，可能以对肿瘤的直接作用
10、为主。乌梅的抗肿瘤作用与其 pH 值无关，所含熊果酸具有一定 作用，但非主要成分。 （ 4）抗生育作用 乌梅煎液对末孕和早孕大鼠子宫平滑肌均有兴奋作用，妊娠子宫对其尤为敏感，有明显的抗着床、抗早孕作用。乌梅有较强的杀精子作用，其主要有效成分为乌梅 -枸橼酸，其杀精子机理为破坏精子的顶体、线粒体及膜结构，最低有效浓度为 0.09。同时乌梅 -枸橼酸具有良好的阻抑精子穿透宫颈粘液的作用，精子经不同浓度乌梅 -枸橼酸作用后，运动能力明显减弱，精子穿透宫颈粘液管的距离与精子受乌梅 -枸橼酸作用的浓度呈负相关。 （ 5）抗过敏作用 乌梅对豚鼠的蛋白质过敏性及组织胺休克具有对抗作用，但对组织 胺- 6 -
11、 性哮喘则无对抗作用。 （ 6）抗氧化作用 乌梅对邻苯三酚及肾上腺素氧化系统产生的氧自由基有很强的清除能力，并在垂直凝胶电泳中表现出抑制氮蓝四唑 (NBT)光化还原的能力。体外试验表明，乌梅果桨有明显抗氧化溶血和抗肝匀浆脂质过氧化作用，且抑制率和剂量呈正相关。 （ 7）解毒作用 乌梅所含琥珀酸是重金属及巴比妥类药物中毒的解毒剂，枸橼酸可做碱中毒的解毒剂。 （ 8）其他作用 乌梅提取物体外具有抑凝血抗纤溶活性、抗衰老和保肝等作用。 综上所述，可以看出，目前对乌梅的研究还不够深入，尤其是从乌梅的化学成分从药用的角度研 究并不多，乌梅药理作用机制研究得较少，乌梅现行质量标准仍有较大的局限性等。应结合
12、药理分离提取乌梅的有效成分，阐明其药理作用机制，为发现新的具有较强活性的化合物创造条件。 本文是对乌梅中提取液抑菌的研究。在体其外对大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、霍乱杆菌、百日咳杆菌、变形杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、类白喉杆菌、人型结核杆菌、脑膜炎球菌、金葡菌、肺炎球菌、溶血性链球菌等均有抑制作用，其醇浸渍液对沙门氏菌、绿脓杆菌作用敏感。乌梅水煎液对临床分离得到的 28 株肠球菌有很好的抑制作用，其 MIC90 为 1:320。 研究发现乌梅对脑膜炎球菌有较强的体外抑菌作用。乌梅的抑菌作用强弱受采收、加工、植物基原的影响，以核仁、果肉均成熟时采收加工的乌梅比其它时期采收加工的乌梅抑菌
13、作用强；烫晒法与烘干法的加工成的乌梅抑菌效应相同，熏法制成的乌梅对某些菌的作用略优于烫晒、烘法，松木或杂木熏制的乌梅，对痢疾、伤寒杆菌的敏感度稍有不同，但差异不明显；比较了不同基原的乌梅，对肠道致病菌均有一定的作用，但对某一细菌的作用程度稍有差异。 2 实验材料、主要 试剂 和 仪器 2.1 实验材料 乌梅 于 2010 年 9 月份在舟山市 定海区芝林大药房购买。 2.2 主要试剂 试剂 规格 厂家 无水乙醇 (CR) 国药集团化学试剂有限公司 95%乙醇 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 乙醚 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 正丁醇 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 甲醇 （
14、 AR） 国药集团化学试剂有限公司 - 7 - 石油醚（ 30-60） （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 乙酸乙酯 （ AR） 国药集团化学试剂有限公司 营养琼脂 杭州微生物试剂有限公司 营养肉汤 杭州微生物试剂有限公司 蒸馏水 浙江海洋学院 药学 实验室 2.3 仪器 仪器名称 型号 厂家 电热恒温水浴锅 HHS 型 上 海博讯实业有限公司医疗设备厂 万用电炉 浙江上虞市通州实验仪器厂 旋转蒸发仪 RE-2000 型 上海亚荣生化仪器厂 真空泵 SHB-IIIA 型 上海亚荣生化仪器厂 移液枪 京明力普瑞移液器专业制造厂 超声波清洗器 KQ-500E 型 昆山市超声仪器有限公司 智能恒温
15、恒湿箱 HWS 型 宁波东南仪器有限公司 单人双面净化工作台 SW-CJ-IF 型 苏州净化设备有限公司 立式自动电热压力蒸汽灭菌器 LDZX-40BI 型 上海申安医疗器械厂 小型粉碎机 电子天平 刻度尺 锥形瓶（ 200ml-400ml) 培 养皿（内径 90.0 0.1mm，高 16 17 mm） 2.4 实验菌种 大肠杆菌（ Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）、 副溶血性弧 菌（ Bibrio Parahemolyticus） ，以上三种菌种均 为舟山市定海区疾控中心 提供。 3 实验方法 3.1 粗提物的制备 水提法：称
16、取 乌梅 粉末 5.0g,用 蒸馏水 净泡 2h,过滤，用旋转蒸发仪进行旋转浓缩，将滤液减压蒸馏至 1.0g,即得 乌梅粉末 的抑菌物，记为 1 号。 酸提法： 1、称取 乌梅 粉末 5.0g,用石油 醚（ 30-60）回流提取 1 次，每次 3h, 倒出两次的溶液合并后，用旋转蒸发仪进行旋转浓缩，得到的浓缩液记为 2 号。 2、在圆底烧瓶中加入乙醚溶液回流提取 1 次，每次 3h,倒出两次的溶液合并后，用旋转蒸发仪进行旋转浓缩，得到的浓缩液记为 3 号。 3、在圆底烧瓶中加入乙醇水溶液回流提取 1 次，每次 3h,倒出两- 8 - 次的溶液合并后，用旋转蒸发仪进行旋转浓缩，得到的浓缩液记为
17、4 号。 4、在圆底烧瓶中加入沸水回流提取 1 次，每次 3h,倒出两次的溶液合并后，用旋转蒸发仪进行旋转浓缩，得到的浓缩液记为 5 号。 5、在圆底烧瓶中加入 1%HCl 溶液 回流提取 1 次，每次 3h,倒出两次的溶液合并后，用旋转蒸发仪进行旋转浓缩，得到的浓缩液记为 6 号。 醇提法：称取 乌梅 粉末 5.0g,用 95%的乙醇溶液回流提取 1 次，每次 3h,倒出两次的溶液合并后，过滤后，用旋转蒸发仪进行旋转浓缩，将滤液减压蒸馏至 1.0g,即得 乌梅 中的抑菌物得到浓缩记为 7 号。 3.2 抑菌性的测定 3.2.1 培养基的制备 量取 200ml 蒸馏水于 400ml 的烧杯中
18、置于 万用电炉上加热至沸腾，后按 3.5： 100 的固液比加入 14g 营养培养基使其溶解制成溶液，然后用 锥形 瓶分装，于 121的电热杀菌锅中灭菌 30 分钟，待用。 3.2.2 菌悬液的制备 用无菌生理盐水将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 副溶血性弧 菌稀释成浓度都在 1 1025 102cfu/mL。 3.2.3 平板的制备 刮取每种 乌梅 提取物于试管中，在每支试管中加入 5 毫 升 无水乙醇，用超声使其溶解完全。用移液枪移取每种提取物 1ml 于其他试管中（该浓度记为 100%），再各移取 1ml 以该溶液为标准依次稀释成 75%和 50%浓度的提取液，待用。 3.2.4 试验菌种的
19、活化 将斜面培养基上的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 副溶血性弧 菌接种到 250mL 锥形瓶 瓶的营养肉汤培养基中，在振荡培养箱中以 150r/min 的转速和 37的温度下活化培养 24h 后，移出 1mL 菌液在相同条件下重复培养相同时间，得到初始菌液。 3.2.5 琼脂平板孔穴法（ K-B 法） 抑菌圈直径作为药物敏感初筛。将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等 4种菌悬液各 5ml分别倒入 150ml 融化且冷却至 45 50的营养琼脂培养基中充分摇匀，迅速分装于培养皿（ 90mm）中，培养基厚约 5mm，待凝固后，琼脂平板上打 4个对称且直径为 6mm 的小孔，在小孔内注入 0.2ml 各种
20、提取液，每个菌种做 3个平行样本。置于 37 恒温培箱中培养 24h，观察结果，测量抑菌圈直径（以完全不生长菌作为测量标准），以各产物对测试菌 3次平均值为抑菌圈直径，抑菌圈大于 10mm 为有效，小于 8mm 或无抑菌圈为阴性。 - 9 - 3.2.6 抑菌圈的测定 将 7 种提取物分别溶于无水乙醇中配制成 1的浓度，用细菌过滤器过滤除菌，各种提取物即用及配。将直径为 6mm 的无菌滤纸片浸入浓度为 l的药物中备用。取经活化的斜面菌种加入生理盐水中，制成孢子浓度在 105-106 个 ml 之间的均一菌悬液，再取 0.1ml 菌悬液，加入到装有无菌的凝固的 PDA 培养基的培养皿中，涂抹均匀
21、， 贴上上述准备好的滤纸片，每皿 3 片。 37下培养 2 天，测定抑菌圈大小。 吸取提取物原液 0.25 mL 至 培养皿 中，注意不要将菌悬液溢出 培养皿 外。并用无菌生理盐水做空白对照，每个样品设三个平行样， 37培养 24h 后观察结果。测量抑菌圈的大小，结果取平均值。 3.2.7 最低抑菌浓度 (MIC)的测定 用倍比稀释法将一种药物水溶液稀释成 4 种浓度，在各平皿内分别加 2mL 不同浓度的稀释液，每个浓度重复三个平皿，然后倒入 20mL 左右已经高温灭菌的固体培养基，充分混匀，冷却凝固后，每皿加入 0.2mL 菌悬液涂均，培养（培养 方法同上）。取出观察结果，以不长菌的稀释液浓
22、度为最小抑菌浓度（ MIC）。 将原液稀释成浓度为 0.40g/ml、 0.20g/ml、 0.10g/ml、 0.050g/ml、 0.025g/ml、0.0125g/ml 的浓度梯度，吸取各浓度 0.25 mL 至 培养皿 中，并用无菌生理盐水做空白对照，每个样品设三个平行样，结果取平均值， 37培养 24h 后观察结果。 3.3 乙醚的最佳提取工艺 为了优化提取工艺，根据实验结果，选择剂料比、提取时间、提取温度作为考察因素，以 乌梅 有效成分得率作为考察指标 ,，每个因素取 3 个水平，运用 L9(34)正交试验设计法进行试验，因素水平表如表 1 所示。 表 1 乙醚提取因素水平表 水平
23、 因素 剂料比 (ml. g-1) 提取时间（ h） 提取温度 ( ) 1 15 1 45 2 25 2 60 3 35 3 75 3.4 乌梅 提取物稳定性的研究 3.4.1 温度对 乌梅 提取物稳定性的研究 将浓度为 0.050g/ml的 乌梅 提取物于 40、 60、 80、 100及 121水浴中处理 20min。采用滤- 10 - 纸片法 ,测定 乌梅 提取物对 3种供试菌的抑菌性。 3.4.2pH 值对 乌梅 提取物稳定性的研究 取乙 醇 最佳提取工艺下 的部分溶液，用不同 pH 值的缓冲液稀释，各溶液的 pH 值分别 2.0、 4.0、 6.0、 7.0、 8.0、和 10.0，
24、并以不同 pH 值的缓冲溶液和原液为对照，以金黄色葡萄球菌、 副溶血性弧 菌和大肠杆菌为指示菌，测定其抑菌效力。 3.4.3 光对 乌梅 提取物稳定性的研究 取乙醚最佳提取工艺下的部分溶液，将其置于紫外灯下分别照射 5、 10、 15、 20、 25、30min 后，原液作为对照，以金黄色葡萄球菌、 副溶血性弧 菌和大肠杆菌为指示菌，测定其抑菌效力。 4 实验结果与讨论 4.1 乙醚最佳提取工艺的优化 为了进一 步考察乙醚回流提取工艺 ,根据 乌梅 的理化性质和主要的影响因素 ,也为了使乙醚提取物的最高得率，故对乙醚进行工艺的优化，结果如下表所示 表 2：正交实验安排及结果 试验号 因素 得率 (%) 剂料比 (ml. g-1) 提取时间（ h） 提取温度 ( ) 1 1 1 1 2.61 2 1 2 2 2.91 3 1 3 3 3.08 4 2 1 2 2.94 5 2 2 3 2.13 6 2 3 1 2.92 7 3 1 3 2.69 8 3 2 1 2.97 9 3 3 2 2.46 K1 3.42 2.88 3.37 X=28.38 X2=926.24 K2 2.37 3.12 3.24 K3 3.33 2.92 2.47 R 0.09 0.57 0.16
