1、MSX加压筛选与 MTX加压筛选分子生物与细胞培养蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力；氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。1. CHO 细胞表达体系常用的 CHO 细胞系有两种：CHO 和 CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO 表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰
2、功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到 1000L 以上；CHO 细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。 改造 CHO 细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将 bcl-2 基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2 基因的过量表达能抑制 Gln 或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向 CH
3、O 细胞中导入 p21、p27 基因，可使细胞 G1 期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。2. 载体系统借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子增强子元件、转录剪切和 Poly A 信号等；CHO 细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。2.1 启动子和增强子 启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既
4、需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、 LTR 和 CMV 启动子在 CHO 细胞中效果良好。有研究表明：在 CHO 细胞中，CMV启动子的转录活性分别是 SV40 启动子和 LTR 启动子的 10 倍和 30 倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如 T7 启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链延长因子基因的启动子（EF-1）、鸡胞浆 肌动蛋白启动子等。EF-1 启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用 SV
5、40、CMV 和 EF-1 启动子。 外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言，也就是决定于特定的表达载体中的启动子，一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞，各启动子起始转录的效率有很大的差别，因此我们认为在进行外源基因的表达研究中，应考虑选用几种不同的强
6、启动子，才有可能获得较为理想的表达效果。与启动子相连的是增强子元件，具种、组织特异性，CHO 细胞中一般采用 SV40和 CMV 增强子。2.2 选择标记和基因扩增 CHO 细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是 neo 等非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影响，用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。 外源基因在 CHO 细胞中扩增是提高表达水平的重要策略之一。dhfr 基因扩增系统最常用，当携带 dhfr 基因的表达质
7、粒转染CHO 细胞后，或携带 dhfr 基因的标志质粒与携带外源基因的表达质粒共转染 CHO-dhfr-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，dhfr 可被叶酸类似物氨甲喋呤（Amethopterin ，MTX）所抑制，不断提高 MTX 浓度，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr 基因均得以扩增。进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系，结果会导致与 dhfr 串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于 dhfr 基因本身，即与 dhfr 基因相邻的 DNA 区域同时被扩增。但它也
8、有缺陷，表达细胞仅限 dhfr 缺陷型细胞，重复筛选抗性细胞费时费力，去除选择压力后，扩增基因不稳定。细胞遗传学表明，在选择压力下，扩增基因的大小和结构处在不断变化之中。在细胞分裂的不同时间，不同的宿主细胞和选择药物使基因的扩增范围处于不断变化之中，从 1001000kb。即使是同一种细胞，选择过程不同，基因扩增的范围也不同。谷氨酰胺合成酶（GS）扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率，但细胞长期连续培养时，生长状况不佳，DHFR 系统表达水平虽较 GS 系统低，但细胞生长稳定。 基因扩增还可通过弱化选择标记基因表达来达到。弱化选择标记基因的表达，在使用与常规的表达载体相同的选择
9、压力时，dhfr 基因拷贝数更高，外源基因的表达水平也得到提高。如一种双顺反子载体将dhfr 基因连在外源基因的 3端，从而位于外源基因 3端下游的 dhfr 基因的翻译起始效率大大降低，dhfr 基因表达被弱化。另一种载体将 dhfr 基因插入人工合成的内含子内部，两边为剪接供体 SD 和剪接受体 SA，外源基因在内含子的下游，mRNA 剪切时，95%的 dhfr mRNA 被剪切掉。也有一些表达质粒不含选择基因，则必须共转染一个可表达选择基因的标志质粒，如 pSV dhfr,该质粒由 Psv2 dhfr 去除 SV40 的增强子构建而成，起到弱化 dhfr基因表达的作用。2.3 其它 表达
10、载体引入天然或人工合成的内含子序列，有利于外源基因组 DNA 转录的 mRNA 剪接内含子，增加稳定性，提高翻译效率，许多真核表达载体带有 SV40 的内含子。但因大多数插入的外源基因是 cDNA，所以一般也用不着剪接信号。真核基因的mRNA 加工需要多聚腺苷酸加尾信号（pA ），实验表明，除去 pA 后，外源蛋白表达量降低 90%。目前多采用 SV40 的晚期及早期 pA、牛生长素基因的 pA 和人工合成的 pA。3. 外源基因启动子之后是克隆的基因组 DNA 或 cDNA。基因组 DNA 比 cDNA 表达量要高，应尽量使用基因组 DNA。除此之外，可以通过下列方法增加外源基因的表达量：(
11、1)在基因起始密码子的前后设置 Kozak 序列，即 GCCGCCA-3/GCCA UGG+4，其中最重要的是-3 位的嘌呤，其次是+4 位的嘌呤。具有 Kozak 序列与否，翻译起始强弱会有一个数量级的差异；(2)尽量切除 cDNA 中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少 5未翻译前导区和克隆中的 GC 尾部对表达水平的不良影响，以及减少 3未翻译区对 mRNA 稳定性的不良影响； (3)拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌蛋白的输出等；(4)在不改变蛋白氨基酸序列的前提下，修饰个别基因的编码序列，解决密码偏性问题。实际表达中，可根据表达效果
12、，对基因加以改造，以提高表达量。4. 表达克隆的筛选不同的细胞克隆，外源蛋白表达水平高低不同，原因可能有二方面，一是外源质粒片段整合入细胞染色体的位置不同，有的区域转录活性高，有的转录活性低；二是不同的细胞克隆，质粒的拷贝数是不同的。挑选高表达的单克隆细胞株一般采用两种流程：第一种方案首先通过检测外源基因的表达，逐一筛选 dhfr 阳性单克隆，再转到浓度持续升高的 MTX 之下生长，分别进行扩增；另一种方法先把 dhfr 阳性单克隆合并，在不断升高的MTX 之下加压扩增外源基因的表达，最后挑出稳定的、高表达的单克隆细胞株。加压扩增外源基因表达，除了单纯使用 dhfr 扩增系统或 GS 扩增系统
13、外，也可采用 G418 与 MTX 联合作用细胞，G418 与 MSX（ methioninesulphoximine，GS 抑制物）联合作用细胞，或者利用 dhfr 扩增系统与 GS 扩增系统共加压。 混合克隆的表达水平远赶不上表达较高的单个克隆，这是因为转染的 CHO 细胞中存在不表达或低表达的非生产细胞，并可在长期生存，甚至 MTX 加压时占生长优势，排斥其它高表达细胞，成为细胞群体中的主要部分，导致产量严重下降，并对 MTX 加压无反应。当撤除 MTX，会发生外源蛋白表达量下降的情况，原因也可能在此。5. 工程细胞大规模培养细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点
14、，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较均一性。常用的细胞系均是性质均一的细胞，需要时还可采用克隆化等方法使细胞进一步纯化；四是研究的内容便于观察、检测和记录。体外培养的细胞可采用显微镜，电镜等直接观察记录，充分满足实验的要求。另外还具有研究范围比较广泛，研究费用相对经济等优点。 然而，细胞培养也有其局限性。由于培养的细胞脱离了机体复杂的环境条件，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变。尤其是体外反复传代、
15、长期培养的细胞，有可能发生染色体非二倍体改变等情况。因此，应将体外培养的细胞视为一种既保持动物体内原细胞一定的性状又具有某些改变的特定的细胞群体。 由于细胞培养技术的优点是其他实验方法和技术所不能比拟的，所以近年来细胞培养技术在分子生物学、细胞生物学、遗传学、老年学、免疫学、肿瘤学和病毒学等很多领域都得到了广泛的应用，其中对于分子生物学家及细胞生物学家而言，应用细胞培养对感兴趣的基因产物进行定位、运动及功能研究变得越来越重要。在克隆一个基因后的下一步，往往是将其导入不同类型细胞，以分析其表达，测定表达对细胞生长的影响，或将高表达的基因产物纯化。5.1 血清 利用含血清培养基生产蛋白制品有许多不
16、利，如增加培养成本和污染机会，增加纯化难度和成本，增加产品质控指标。因此，大规模生产临床使用的生物制品，应尽量减少血清的用量，最好用无血清培养基取代。为此，应尽可能增加大规模细胞培养的接种密度，以缩短生长延滞期，提高细胞比生长速率。如果接种密度较低时，在培养开始阶段，可使用含血清培养基，待细胞密度达到一定浓度(如 106/ml)，细胞进入对数生长期，再降低血清浓度或使用无血清培养基。外源蛋白的实际产量无明显下降。许多实验表明，细胞的比生长速度相对降低时，产物的比生长速率提高，原因可能是用于细胞增殖的能量减少，有利于外源蛋白的生产。 使用无血清培养墓代替含血清培养基，可克服血清带来的弊端。但失去
17、血清中的促细胞生长因子，细胞生长减慢，密度降低，生存周期缩短，导致蛋白产最下降。因此，往往通过增加无血清培养基中的营养物质，以优化细胞培养，提高蛋白表达。用作血清替代成份的种类很多，大致可分为激素和生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子及低分子量营养因子四类。有研究报道，添加 BSA 对促进细胞生长作用显著，丙酮酸钠、腐胺、丁酸钠有利于表达目的产物。不同的 CHO 工程细胞的培养基添加成份可能存在差异，一般需要自己进行摸索最优条件。5.2 氧气和二氧化碳 一般认为动物细胞培养的适宜溶氧在 10%60%之间，过高可损伤细胞膜甚至 DNA，从而导致细胞死亡。而溶氧过低又会改变细胞的代谢，降低细胞蛋白表
18、达水平，甚至因缺氧而导致细胞逐渐死亡。胡显文等在利用多孔微载体大规模培养CHO 细胞时发现，溶氧维持在 20%45%时，对细胞表达产物和葡萄糖代谢无明显影响，但溶氧降至 7%9%时，细胞表达水平明显降低，葡萄糖代谢转化为乳酸 的比例上升，培养基的有效利用率明显降低。 随着细胞培养规模和密度的增大，可导致 CO2 积聚，从而对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。CHO 细胞大规模培养的生物反应器中，最适CO2 水平为 4%10%。当达到 14%时便会阻碍细胞生长。高 CO2 分压使重组 CHO 细胞系的生长和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)产率均受到抑制，而且 t-PA 糖链中包含 N-羟乙酰
19、神经氨酸的唾液酸比例稍下降。5.3 氮和乳酸 氨和乳酸是细胞培养过程中的主要代谢副产品。与乳酸相比，较低浓度的氨就会对重组 CHO 细胞产生明显的抑制作用，最终的细胞密度随着氨浓度的提高而降低。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢产生。二者都涉及谷氨酸胺，因此需要防止培养基中 Gln 自然分解，限制 Gln 用量，并尽量去除培养基中的氨。乳酸是细胞糖代谢的产物，高浓度的乳酸也会抑制细胞的生长。氨和乳酸对细胞的毒性作用在多种不同的细胞系均存在，不同细胞系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大，原因可能是不同细胞系葡萄糖和谷氨酰胺代谢过程中关键酶的敏感性不同，或者在不良的生长环境下，氨基
20、酸代谢发生改变。由于 Gln 和葡萄糖代谢的相互影响，因此降低培养基中葡萄糖浓度以及减少乳酸产生的同时，必须平衡葡萄糖和 Gln 的比例。6. 问题和展望外源蛋白在 CHO 细胞中表达的影响因素非常复杂，建立稳定、高效表达的重组CHO 细胞系并非易事。目前主要存在问题如下：重组 CHO 细胞生产效率低；某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；重组 CHO 细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现为上游构建时着重考虑它的高效表达，而对产物的分离纯化过程考虑较少；重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 重组蛋白在 CHO 细胞中高效表达是一个涉及多学科的问题，需多个研究领域的共同合作探讨。科研人员可能
21、把以下问题作为今后的主攻方向：提高表达水平，如寻找一些新的强启动子和合适的增强子、在载体上装配适合基因高效表达的必要元件、根据 CHO 细胞翻译特点，调整外源基因密码子等；注重分离纯化的问题，如改变DNA 中的个别序列，使表达产物在不影响生物活性的前提下，携带有利于分离纯化的基因；细胞培养的低成本、高密度、高产量和培养设备的大型化，自动化、精巧化；分离纯化的低成本和高活性回收率等方面。讨论有些天然的具有生物活性的蛋白类物质，在人类疾病的治疗中发挥着巨大的作用。但是这些活性物质，有些在自然界中含量很少，满足不了人们的需要；有些含异源蛋白太多，纯化难度大等缺点，基因工程药物的产生解决了这些难题，具
22、有跨时代的意义，是生物技术水平发展的重要标志之一。重组蛋白质药物具有活性高、用量少、易于规模化生产等优点，是国内外生物药物开发的重点。细胞表达源蛋白最重要的是要保持其天然结构及活性。而早期的原核表达系统不能分泌有活性的蛋白，都是以内涵体的形式存在的，真核表达系统因为具有转录后的修饰加工功能，包括蛋白折叠、二硫键形成、亚基多聚化、肚链裂解、蛋白磷酸化以及 N 型和O 型糖基化等，因而表达的重组蛋白在结构和功能方面更接近于天然的蛋白分子，具有生物活性，可分泌胞外。CHO 细胞是外源蛋白表达运用得较为成功的哺乳动物细胞，其用于外源基因表达也具有很多优点，如外源基因能够稳定整合于细胞染色体内，易于规模
23、化培养等。由于 CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（ dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthine ）、胸腺嘧啶（ Thymidine）和甘氨酸的培养液中才能得以存活。而通过目的基因与 dhfr 基因共转染，不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于 dhfr 可被叶酸类似物 MTX 所抑制，在 MTX浓度选择压力下，dhfr 基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗 MTX 细胞系；又由于与 dhfr 基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着 dhf
24、r 基因的扩增而扩增，我们就得到了能大量表达外源蛋白的细胞克隆，这在基因工程抗体及各种基因工程蛋白的表达中是可行度很高的一种措施。上面也提到影响重组蛋白在 CHO 细胞中表达的因素很多，涉及 CHO 细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等。我认为表达载体的构建是影响细胞能否表达的关键问题，因为 dhfr 基因及邻近区段染色体 DNA拷贝数是共扩增的关系，因此必须将外源基因片段整合到 dhfr 基因的上游或者下游，位置不能太远，否则无论如何筛选也得不到表达外源基因产物的细胞，因此说它是能否表达的关键，当然其它步骤也不能忽略，如 CHO-dhfr-细胞转
25、染、使用强启动子等。如果构建成功可以产生外源蛋白，那么筛选高表达的细胞株等操作就是提高外源蛋白表达量的问题，使外源蛋白高效表达，也是很有意义的，为大规模培养奠定基础。MTX 筛选扩增系统，常需在 MTX 选择压力下，经过长期的筛选。因此 MTX 加压筛选是需要时间和耐心的，但是细胞培养的条件要合适，如培养基的选用（CHO 细胞一般采用 F-12 培养基），营养成分的适量（L-谷氨酰胺），培养液的新鲜等，首先要保证细胞正常的生长和存活，这样才能缩短加压筛选的周期。另外也要等细胞适应这个压力并恢复正常生长后再继续加压，提高 MTX 浓度，可以成倍数递增，待细胞适应新的压力并恢复正常生长时再继续，同
26、时还要保存每个 MTX 浓度下的细胞种子。因为在此后的细胞培养的过程中，随着 MTX 的撤离和细胞传代次数的增加，转染细胞高表达抗体的能力常会逐渐下降甚至丧失。因此，即使是来源于同一细胞株的各个亚克隆细胞之间，其抗体表达量也常不均一。CHO 转染细胞的这种不稳定性，可能是由于细胞内外源基因拷贝数的丢失或转录效率下降等所致。对此尚有待进行深入地研究。但这一现象提示，在筛选建株的早期，应采取措施及早鉴定各个细胞克隆表达的稳定性，并及时大量保存稳定高表达的细胞种子，或适时地对细胞株用 MTX 再加压和克隆化筛选，以保持转染细胞高表达抗体的能力。应及时用 MTX 对细胞株进行再加压筛选，以保持细胞稳定表达抗体的能力。有报道称加压方式对表达量的提高和细胞株表达的稳定性有较大的影响。小梯度多次加压有利于最终得到高表达细胞株，且细胞株表达稳定，比大幅度快速加压能够得到表达水平更高的克隆。大幅度加压可以在短期内得到高表达克隆株细胞，但是最终表达水平并不比小幅度多次加压得到的细胞株表达量高，而且细胞株表达往往不稳定，在撤掉筛选压力后，表达水平往往下降。在大幅度加压筛选过程中，可能由于种种原因 dhfr 基因发生突变，突变后的 DHFR 对 MTX 的亲和力降低，因而突变细胞株的基因扩增倍数也低，目的基因无法高表达，更易产生非生产性克隆。
