1、电子探针Electron Microprobe一 种 分 析 仪 器 ， 可 以 用 来 分 析 薄 片 中 矿 物 微 区 的 化 学 组 成 。 该 仪 器 将 高 度 聚 焦的 电 子 束 聚 焦 在 矿 物 上 ， 激 发 组 成 矿 物 元 素 的 特 征 X 射 线 。 用 分 光 器 或 检 波 器 测 定荧 光 X 射 线 的 波 长 ， 并 将 其 强 度 与 标 准 样 品 对 比 ， 或 根 据 不 同 强 度 校 正 直 接 计 数 出 组分 含 量 。 electron probe 全 名 为 电 子 探 针 X 射 线 显 微 分 析 仪 ， 又 名 微 区 X 射
2、 线 谱 分 析 仪 。 可 对 试 样 进 行微 小 区 域 成 分 分 析 。 除 H、 He、 Li、 Be 等 几 个 较 轻 元 素 外 ， 都 可 进 行 定 性 和 定 量 分析 。 电 子 探 针 的 大 批 量 是 利 用 经 过 加 速 和 聚 焦 的 极 窄 的 电 子 束 为 探 针 ， 激 发 试 样 中 某一 微 小 区 域 ， 使 其 发 出 特 征 X 射 线 ， 测 定 该 X 射 线 的 波 长 和 强 度 ， 即 可 对 该 微 区 的 元素 作 定 性 或 定 量 分 析 。 将 扫 描 电 子 显 微 镜 和 电 子 探 针 结 合 ， 在 显 微 镜
3、 下 把 观 察 到 的显 微 组 织 和 元 素 成 分 联 系 起 来 ， 解 决 材 料 显 微 不 均 匀 性 的 问 题 ， 成 为 研 究 亚 微 观 结构 的 有 力 工 具 。 龈沟液浅谈 作者: 陈 龙 【摘要】通过对龈沟液的基本信息而探究其实际应用 【关键词】龈沟液;含漱液;应用 1 龈沟液的定义 龈沟液 ( gingival crevicalar fluid GCF) 是从龈沟渗出的液体, 是唯一的,直接从体液渗出的液体,其成份与血清相近, 含有电解质、氨基酸、 IgG, IgM 等抗体、溶菌酶等成份，GCF 的产生模式是: 微血管系统内的液体,经过内皮细胞间隙渗入到细胞
4、间形成细胞间液,最后经过淋巴管回流吸收,当渗出大于回流时, 液体就会经结合上皮细胞间隙外渗到龈沟内形成龈沟液。口腔及全身疾病的改变可引起龈沟液的量及成分的改变, 比如:1.1 龈沟液的量可反映出种植体周围组织的健康情况； 1.2 龈沟液中的天冬氨酸转氨酶可作为诊断牙周炎各阶段的指标 1.3 龈沟液的 PH 值与牙周袋深度、龈下菌斑、 厌氧菌总数呈显著正相关； 1.4 由于与血清的相似性, 通过研究 GCF 葡萄糖水平来了解血糖的变化； 1.6 另外人类免疫缺陷病毒感染患者的抗体的变化也会在龈沟液中表现。 它作用巨大，同时也可以成为微生物的培养基，因此研究它也就显得意义大。 2 龈沟液中的主要成
5、分与其检测 龈沟液其成份与血清相近, 含有电解质、氨基酸、 IgG, IgM 等抗体、溶菌酶等成份。而这里，我们举出一例，用以探究取样及检测的方法。2.1 白细胞介素 2 6 (I L2 6)和白细胞介素 2 1 (I L2 1)的检测 2.1.1 试剂 检测 I L2 1 和 I L2 6 的 EL ISA 试剂盒购自美国 R 合并每牙颊侧、舌侧的近中与远中两个位点样本 ,充分混匀分为两份 ,即实验组 A 和对照组 B,每组 39 份样本。 2.2 龈沟液重量与体积换算曲线制作 2.2.1 称取 10 mm 2 mm What man 3 号滤纸条重量 2.2.2 用微量进样器分别吸取 0
6、. 05, 0 . 1, 0 . 2,0 . 4, 0 . 6, 3 . 2L 的 1 5 稀释的质控血清 ,加在已知重量的滤纸条上 ,立即再次称重 ,计算质控血清净重。 2.3 龈沟液检测结果的统计方法 采用 SPSS 13 . 0 软件 ,计量资料数据用均数 标准差表示 ,将 A和 B 组样本检测 I L2 1 的结果 ,以及 C 和 D 组样本检测弹性蛋白酶的结果进行配对 t 检验和相关分析;根据拟和曲线换算龈沟液样本体积。 3 龈沟液的收集方法 GCF 的收集方法一般有龈沟液冲洗法, 滤纸条法, 微吸管法, 收集方法不同, GCF 的量和质亦有差异。因此, 为了更好保证 GCF 的质和
7、量, 根据研究目的和收集方法的优点不同, 可采取不同的收集方法, 微吸管法可收集到大量 GCF, 但缺点是易对牙固袋壁组织产生较大的刺激, 这样就会引起毛细血管通透性增加, 导致血清漏出到龈沟中, 从而使 GCF 被稀释和“ 污染” 。改良刻度微吸管法可克服这一缺点。龈沟冲洗法主要适合于研究龈沟内白细胞数目及功能, 短时间内限定位点的龈沟彻底冲洗法可获得代表性龈沟内样本。GCF成份及量因不同的牙位而不同, 故在取样时, 最好是取同一牙位的 GCF。在目前使用的滤纸条中 Griffiths 认为 2 8mm 规格的 Whatman 3MM 滤纸条对血清蛋白的回收率最高。取样时间及重复多次取样对
8、GCF 量和成份有影响,重复多次取样会刺激沟内组织, 从而引起 GCF 量的增加; 而关于取样时间及重复取样对成份的影响, 则有待进一步深入。 4 龈沟液的定量方法 据 Cimasoni 报告, 口腔内每天龈沟液的生成量为 0.5- 2.4ml。在测定 GCF 中的酶、蛋白质等成分时必须以龈液量为标准, 故 GCF 的定量分析已成为研究 GCF 性质的重要内容。定量 GCF 方法有龈沟液测量仪 ( Periontron) 分析法,茚三酮染色法和称重法。 龈沟液测量仪有两种, 分别是 Periotron 600 和 Periotron 6000, 经研究 Periotron 600 对测定 GC
9、F 的量和成份分析都是最理想的选择。称重法则是用天平称量取液前、后滤纸条重量的方法。茚三酮染色法即茚三酮滤纸染色法。与茚三酮起反应的物质是氨基酸、氨、肽、蛋白质、胺类、氨基酸糖等, 与龈沟液的成份相似,故有显色。 5 龈沟液的贮存和处理 在 GCF 的保存中, 其成分活性的保持尤为重要, 特别是蛋白质的活性。GCF 在保存过程中蛋白质火性受时间、温度以及缓冲液种类和是否加入稳定剂及其类型的影响而发生变化, 阎福华等研究认为液氮速冻和不速冻对酶的稳定性影响甚微, 而贮存时间和温度对酶的稳定性有直接影响。在 GCF 的酶中加入稳定剂可以保持酶的活性, Gekko 等认为酶中加入甘油, 酶的活性可以
10、得到保持。 GCF 中各种酶的稳定性与加入缓冲液的不同而不同, 阎福华等研究证实 GCF 中加入 BSA ( 0.05%小中血清蛋白) 的 Tris- Hd (三氢甲基氨基甲烷盐酸) 缓冲液, 可以保持酶的活性。 6 关注：含漱液与龈沟液 研究已证实龈沟液内毒素与牙周炎临床症状密切相关，因此龈沟内及龈下牙菌斑中微生物和内毒素的有效清除对牙周炎的疗效至关重要。在实验中，对含漱茶多酚含漱液的患者与正常对照组龈沟液内的内毒素进行比较，从而可观察一些化学成分 (如茶多酚)对龈沟液的影响，利用李德懿方法, 将系列稀释已知浓度的内毒素标准品 ( 阳性对照) , 去热源水 ( 阴性对照) 各 0.5ml,实
11、验结果如下 由表 1 可见, 三组患牙治疗前龈沟液内毒素量 ( 基线值) 比较无显著性差异 ( P 0.05) ; 治疗后三组患牙龈沟液内毒素量较治疗前明显降低 ( P0.05) , 实验组龈沟液内毒素量明显低于阴性对照组 ( P0.05) 。 7 龈沟液的研究何去何从 从上面的叙述可见，龈沟液的研究显得是相当重要的。之所以说那么多，从龈沟液的定义、产生、成分、收集、储存以及简单应用（是最简单的应用了），就是想表明龈沟液容易直观的接触与研究，并且其效用极强，因此研究它也就显得简易而合时宜。作为本科生，理论知识和试验技能有所限，因此想对龈沟液做出更加深入的思考显得比较艰辛，而我窃以为，对龈沟液作
12、艰苦的研究是值得的，因为每一项理论总是要看看它的实际应用的广泛程度从而来确定它的价值，而通过平衡、降低以及利用药物诱导龈沟液的产生对萌牙后牙齿的发育，牙周病的预防以及治疗都有特别的指导意思！就像上面所讲的龈沟液与茶多酚含漱液的综合利用便是一个很好的开始。 我设想是否可以借鉴利用 F 来保护牙釉质一样，可以在牙膏中加入一些成分来控制龈沟液成分，从而达到广泛的预防口腔疾病，维持口腔健康！这也是我写这篇研究性学习文章的原因所在。虽然内容繁琐，重点不很突出，但希望老师理解我最终的重点-龈沟液与含漱液的合用来维持口腔健康环境的可能性？希望老师给出建议与一种可行的思考方式 。 参考文献 1龈沟液收集和贮存
13、方法的研究 李自良 雷雅燕 ;2龈沟液微量样本中多种成分的检测 寇传哲 孟焕新 ;3 两种取样方法龈沟液量与牙周临床指标关系的初步研究 福建医科大学附属口腔医院 (350002) 陈群 陈建明 闫福华 林莺 ;4复方茶多酚含漱液对牙周炎患者龈下菌群及龈沟液内毒素水平的影响王 萍 ,季 平 , 罗慧琼 , 张 伟 , 唐 明 ;5实验性龈炎的临床观察和龈沟液量的分析赵亦兵 孟焕新 陈智滨 。摘要 龈沟液及其内容的检测是牙周病目前研究的热点之一。龈沟液的收集有两种方法：袋内法和袋口法。龈沟液中有众多的酶类，其中碱性磷酸酶是研究得比较早的一类。通常检测骨性碱性磷酸酶的方法分为两大类：电泳法和非电泳法
14、。对龈沟液中的碱性磷酸酶采用化学发光法效果较好。龈沟液中的碱性磷酸酶水平与牙周袋深度、牙槽骨吸收量和活动性附着丧失呈明显地正相关。有炎症或种植失败的种植体四周龈沟液中的碱性磷酸酶明显升高。而牙周炎牙齿在接受正畸外力时龈沟液中的碱性磷酸酶的含量有增加的趋势。关键词牙周炎；龈沟液；碱性磷酸酶牙周炎是间歇进行造成牙周软硬组织破坏的非特异性感染性疾病。牙周炎治疗除必要的局部处理和长期的健康维护外，关键在于猜测和控制活动期。随着牙周病病原学研究的日渐深入，人们已经熟悉牙周病是活动期与静止期相交替的渐进的缓慢的发展过程。发现并终止活动期的发展无疑是早期防止牙周支持组织丧失的有效办法。但现有的牙周传统诊断方
15、法无法辨别牙周疾病活动期，因此需要寻找一系列客观的、有效的、准确的牙周诊断新技术，来完善牙周病的检查和诊断。龈沟液检测可显示某一个体或某一部位免疫反应状况及局部炎症病变程度，并可依某些生化成分的改变猜测和诊断活动期，是目前常用的牙周病检测研究方法。1 龈沟液11 龈沟深度为 0.53.0mm。龈沟液以大约 20l/h 的速度自牙龈组织内的毛细血管网渗入到龈沟内。目前被接受的 GCF 产生模式为：微血管系统内液体，经内皮细胞间隙渗入细胞间形成细胞间液，再通过淋巴管回吸收。当渗出大于回流时，细胞间液在组织内聚积形成水肿；或经结合上皮细胞间隙外渗至龈沟形成 GCF。正常情况下，龈沟内存在菌斑微生物及
16、其代谢产物，龈沟内始终有渗透梯度的变化，故有少量 GCF 聚积。GCF 流量改变出现于牙龈炎主要症状之前，是龈沟最早可检测到的客观指标。对牙周炎和牙龈炎 GCF 检测结果显示：牙周炎 GCF 量大于牙龈炎，且均高于正常对照，并随炎症好转而下降。GCF 量与测定部位有关，邻间沟最大，颊舌侧龈沟变化不明显。GCF 流量由切牙到磨牙逐渐升高，上切牙高于下切牙，同名牙无区别。另外，GCF 量与袋深成正比，与附着丧失一般无关。只有在 AL5mm 时，GCF 量才显著增加。故目前多认为 GCF 量与炎症程度成正比，但不能说明牙槽骨的破坏程度，不能作活动期的判定标准。第 1 期龈沟液中的碱性磷酸酶与牙周的关
17、系王雯雯，等12 龈沟液的收集方法重复取样：重复取样则可将多次重复采取的样本混合形成一个牙位的 1 份 GCF 储池，或者各重复采取的样本进行多成分或一种成分的多方法分析，既扩大了样本量，避免了牙位特异性的影响，又便于研究各成分的交互作用。袋内法和袋口法：袋内法：袋内法取 GCF量较宜反映牙龈炎症。袋内法取样，插入深度易受牙石、牙周袋的宽松程度影响，而插入深度又明显与取得的 GCF 量呈正相关。袋口法：袋口法避免了滤纸条插入对龈沟上皮的物理性刺激，但获得 GCF 量少；袋内法较袋口法获得 GCF 量多，但对局部的刺激可能导致血清稀释作用。且袋内法反映炎症变化没有袋口法敏感。2 碱性磷酸酶碱性磷
18、酸酶是在碱性条件下水解多种膦酯酯并具有转磷酸基作用的一组酶，包括由不同结构基因编码的小肠、胎盘、生殖细胞和非特异型同工酶。前三者基因定位于染色体 2q3437 的相邻位点，后者基因定位于染色体 1q3634 之间，其中非特异型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。这些同工酶的理化性质、分子生物学特性、作用机制的深入研究以及准确的定量测定将有助于其在临床上的应用。碱性磷酸酶几乎存在于机体的各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏、肾脏含量较多。正常人血清中的碱性磷酸酶主要来自骨骼，由成骨细胞产生，也可来源于肝脏、肾脏、肠道。妊娠时血清中的 ALP 来源于胎盘组织。ALP 经肝胆系
19、统进行排泄。测定血清中 ALP 作为 Paget 病、甲状腺功能亢进及肾病性骨营养不良等疾病的诊断指标，已有很久的历史，其方法简便成熟。保存 12h，在 4保存数日，在-20保存数月。牙周组织健康的人血清中的非特异性 ALP 男女之间没有区别。血清中的碱性磷酸酶较为稳定，可在室温中 12h，有附着丧失者血清中的骨型ALP 较牙周健康者的要少，但全部类型总的 ALP 含量无差异。血清中的 ALP 与年龄有关，青少年的高于成年人。且与青少年成长发育规律有关，快速生长期高于其他时期。排除年龄和生长发育快速期，男性女性之间无太大的差异。2 龈沟液中的碱性磷酸酶龈沟液中含有多种酶，其中目前认为与牙周病有
20、关的酶有许多，例如：天冬氨酸转氨酶。碱性磷酸酶为成骨细胞的功能酶，是成骨细胞成熟的标志，与骨组织钙化密切相关，主要参与骨的代谢。GCF 中 ALP 经电泳热稳定性来测定，出现短而宽可被磷脂酰肌醇固定的带，显示对抗骨型 ALP 的免疫学特异性，而另一条窄而游走距离远的稳定带，与牙龈卟啉菌的 ALP 一致，因此推测 GCF 中 ALP 是来自牙周膜细胞和细菌的几种同工酶，多是龈下G-菌代谢产生。牙周膜细胞中本身就含有大量的 ALP，当牙周膜细胞破裂或通透性增高时，外溢到龈沟液内。牙周膜细胞中的 ALP 是与骨、肝、肾等组织中相似的同工酶，无特异性。23GCF 中的 ALP 与牙周病的关系关于牙周病
21、活动性的研究已有十几年的历史，龈沟液中宿主来源的酶是现在研究的热点，ALP 便是其中之一。ALP 与牙周袋深度、附着丧失和骨破坏有关，牙周炎者高于牙龈炎者和正常人，后两组无区别，活动期和植骨术后 ALP 水平升高，故可作为骨吸收破坏的标志。在牙周炎活动性的检测中对龈下菌斑中微生物的检测和龈沟液中生化指标的检测是早期诊断牙周炎活动性的重要方法。在牙龈炎临床症状出现的前 714d 就可检测到 GCF 中的ALP 升高。有研究表明，测定成人牙周炎和快速进展型牙周炎患牙的 GCF 中的 ALP 水平，其值明显高于无牙周破坏者及边缘性牙龈炎者，且水平高低与临床症状呈高度正相关。经治疗后 GCF 中的 ALP 水平随临床症状的改善而明显下降，提示 GCF 中的 ALP 可能是牙周组织炎症状况和破坏程度的一项有意义的诊断指标。现有资料表明，GCF 中的 ALP 水平与牙周袋深度和牙槽骨吸收量呈明显正相关与活动性附着丧失呈明显正相关。对不同位点 GCF 中的 ALP 的监测，可猜测是否将要发生附着丧失。GCF 中的 ALP 水平和牙周袋的深度和牙槽骨吸收的百分率密切相关，可反映牙周早期炎症和破坏状况。
