1、重组里氏木霉高产纤维素酶的研究High activity cellulase production by recombinant Trichoderma reesei 夏黎明浙 江 大 学,纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，可广泛应用于棉织物生物整理、饲料工业、植物中药成分提取、纤维素的糖化等众多领域。,当前，人类正面临着能源危机与环境污染的严峻挑战。由于石油等一次性矿质资源的加速消耗以及环境污染的日益加剧，酒精作为安全、洁净的燃料及汽油添加剂已经倍受关注。,我国人口众多，人均可耕面积不足1.5亩，粮食供应形势严峻，利用粮食或糖料作物生产燃料酒精的规模将受到制约。 植物纤维原料是丰
2、富而廉价的可再生资源，采用适宜技术可将它们水解成单糖，并进一步转化为酒精。,目前纤维素的酶解糖化工艺中纤维素酶的成本偏高。提高纤维素酶的生产效率对于促进纤维素乙醇的产业化具有极其重要的意义。,近年来国外纤维素酶的生产技术发展较快,丹麦诺维信公司(Novozymes)、美国节能科公司(Genecor)是最为著名的纤维素酶供应商，但其生产技术严格对外保密。,本研究室在国家863项目、国家科技支撑项目以及工厂企业研发经费的资助下，在纤维素酶生产菌种的基因重组、发酵工艺优化等方面已有多年的研究积累，下面向大家作一个简单介绍。,1、 可溶性诱导物的研制 在纤维素酶生产中，普遍采用纤维素为碳源及诱导物。由
3、于纤维素是不溶于水的高分子固体物质，传质阻力大、不适于高浓度发酵及连续流加工艺，所以存在着发酵周期长、产酶效率偏低、生产成本高等问题 。,以葡萄糖为原料，定向合成适用于纤维素酶生产的可溶性诱导物,已取得突破性进展。 通过优化、调控葡萄糖转苷酶的催化反应，产物中槐糖含量可达50 g/L，大大超出了预定目标（863项目考核指标：10g/L）。,葡萄糖经转苷酶作用后形成的复合糖液的高效液相色谱 A: glucose(13.3min) , B: sophorose(10.9min), C: the mixture derived from glucose by glucosylase,2、 自制复合糖
4、对纤维素酶合成的诱导作用研究 将葡萄糖经转苷酶作用后形成的复合糖直接用于纤维素酶生产，试验结果表明：自制复合糖可以替代微晶纤维素作为里氏木霉的碳源和产酶诱导物。与直接采用葡萄糖相比，产酶时间提前25h，滤纸酶活力可提高14倍。,该项研究成果为制备纤维素酶的可溶性诱导物提供了一条新途径，对于纤维素酶生产水平的提高、加速纤维乙醇的产业化进程等都具有重要意义。,3、 黑曲霉纤维二糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达 纤维素酶主要包括内切-葡聚糖酶、外切-葡聚糖酶、和纤维二糖酶，在将纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠不同组分之间的协同作用才能完成。,目前常用的纤维素酶生产菌种里氏木霉（Trichoder
5、ma reesei）产纤维二糖酶的能力不足，以至于在纤维素酶水解反应过程中会造成纤维二糖的累积，对内切-葡聚糖酶及外切-葡聚糖酶的水解反应具有很强的反馈抑制作用，导致纤维素的糖化效率不高。,从黑曲霉（Aspergillus niger）细胞中克隆纤维二糖酶基因，将其两端分别安装上里氏木霉的强启动子Pcbh1和终止子Tcbh1，进一步构建成一个带有潮霉素B抗性标记的重组质粒pHB9。,重组质粒pHB9,以里氏木霉的分生孢子为材料制备原生质体,采用PEG-CaCl2转化法，将重组质粒转入原生质体。利用潮霉素B抗性标记筛选出387个阳性转化子，进一步在以纤维二糖为唯一碳源的培养平板上复筛，得到10个
6、优良转化子。,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,里氏木霉重组转化子染色体DNA中黑曲霉纤维二糖酶基因的PCR电泳图谱,重组转化子纤维二糖酶活力的提高可明显增强纤维素酶制剂的协同催化性能，降低纤维素原料的酶解糖化成本。 该项研究成果将在纤维素酶生产菌种的定向进化、以及纤维乙醇的产业化进程中发挥重要作用。,4、内切-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达 厌氧真菌分泌的纤维素酶比活力相对较高，但生长速度很慢。将厌氧真菌的纤维素酶基因导入里氏木霉，可以有效地提高纤维素酶的产率。,将克隆到的内切-葡聚糖酶基因序列置于里氏木霉的强启动子Pcbh1及其信号肽下游，并进一步以pCAMBIA13
7、00为载体骨架，构建成含潮霉素B抗性标记的重组质粒pCB-hF 。,重组表达载体pCB-hF,采用根瘤农杆菌介导转化技术，将重组质粒转入里氏木霉的分生孢子中。以潮霉素B为抗性标记初筛到318个阳性转化子，进一步在以CMC为唯一碳源的培养基上，复筛到8个优良转化子。 在摇瓶条件下分别进行产酶试验，培养96h时，发酵液中内切型-葡聚糖酶活力最高可达到1250U/ml,是出发菌株的4.23倍。,不同转化子的内切-葡聚糖酶活力,里氏木霉转化子染色体DNA的EG基因PCR检测,已建立的基因操作技术平台将进一步促进丝状真菌表达体系的发展与完善，具有重要的学术价值和实际应用价值。,5、液体深层发酵产纤维素酶
8、 在50吨发酵罐中液体深层发酵，纤维素酶活力（FPA）可以达到126IU/ml以上。,技术特点：1）采用基因重组里氏木霉菌株；2）采用自制的可溶性诱导物；3）采用连续流加式液体深层发酵工艺。,6、 玉米秸秆的酶水解 以玉米秸秆为原料，对纤维素酶的协同降解机制进行了深入研究。结果发现：当纤维素酶反应体系中CB/FPA大于0.5时，纤维二糖的累积现象可以消除，纤维素酶的协同降解性能增强。 已完成玉米秸秆酶解糖化的中试与放大，当每克底物的纤维素酶用量为20FPIU时，酶解得率可达87.3% 。,玉米秸秆酶水解试验结果,7、 利用玉米秸秆水解液发酵酒精 玉米秸秆水解液适当浓缩后，含葡萄糖66.9g/L、木糖32.1g/L。采用重组酵母72h发酵, 可生成41.2 g/L乙醇。 采用固定化重组酵母，发酵24h，乙醇浓度为40.7g/L。,在已建成的年产3000吨纤维乙醇示范装置中,由6.4吨玉米秸秆可以生产出1吨酒精及1吨木质素。 一吨自制粗酶液可以满足生产一吨纤维素乙醇的需要，用于生产每吨纤维乙醇的纤维素酶成本可以下降到1000元以下。,谢 谢！,
